谷氨酰胺发酵调控
氨基酸发酵
｜
｜
和 嘧 啶 的 前 体 物 ， 尤 其 是 AT P ， 它 还 直 接
参与组氨酸的合成，所以利用嘌呤的结构 类似物抗性突变株解除反馈调节可以达到 增加组氨酸前体物的积累。
途径也能增加HMP途径的流量。
5． HMP途径的阻断 由于合成组氨酸需要HMP途径的中间代谢产物， 所以完整的HMP途径会减少D-核糖的生成，通过 阻断转酮酶来破坏完整的HMP途径，从而使代谢
谷氨酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶是保证α -酮戊二酸向 谷氨酰胺而不是向草酰乙酸的三羧酸循环方向代谢的 关键酶。同时在该循环中还存在着向天冬氨酸、丙氨 酸、缬氨酸的分支代谢，设法减弱分支代谢而强化主 流代谢，主要的方法是减弱催化这些分支代谢酶的酶 活。
3
谷氨酰胺发酵
｜
谷氨酰胺合成酶的最佳pH为 6.5 ～ 7.0 ， 而 谷 氨 酰 胺 酶 、 N- 乙 酰 谷 氨 酰 胺 脱 乙 酰 酶 的
1
丙氨酸发酵 丙 氨 酸白
1
丙氨酸是构成蛋白质的基本单位，是组成人体蛋 质 的 20 种 氨 基 酸 之 一 。 它 的 分 子 式 是
｜
｜
(alanine) C3H7NO2 ， 有 α - 丙 氨 酸 和 β- 丙 氨 酸 两 种 同 分
异构体。
2
功能
预防肾结石、协 助葡萄糖的代谢， 有助缓和低血糖， 改善身体能量。
3
用途
用于合成新型甜 味剂及某些手性 药物中间体的原 料。 点石演示
简介
点石演示
点石演示
1
丙氨酸发酵
｜
73% 93% 80% 78%
｜
丙氨酸性状
丙氨酸是构成蛋白质的基本单位， 是组成人体蛋白质的20种氨基酸
谷氨酰胺代谢调控
H
H
改良方法
• 对于有机杂酸：可以通过调节溶 氧水平来消除； • 对于非目的氨基酸：可以采取筛 选营养缺陷型或适当添加相应氨 基酸的方法来减弱。
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2.3.1 葡萄糖浓度 Gln的转化随着葡萄糖的加入量的增加而提高， 但从能量偶联效率来讲，葡萄糖的利用率却随 葡萄糖的加入量的增加在降低。因此，从经济 方面讲，提高葡萄糖的添加量并不是提高Gln 转化量的有效途径。 2.3.2谷氨酸浓度 补加Cl-能影响细胞膜的透性，使谷氨酸不易 渗出，而转化为谷氨酰胺分泌出来
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2.1.1谷氨酰胺合成酶（GS）的效能的调节 硫氨酸亚砜(MsO)是谷氨酰胺的结构类似物，很 容易被GS误认而与其变构部位结合抑制其活性。
针对这一现像，我们可以使用甲硫氨酸亚砜 (MsO)作为筛选剂选育突变株。从代谢角度解除 了因谷氨酰胺的积累而造成的对GS的反馈抑 制．
H
GS的存在形式：未修饰、经腺苷共价修饰的。 AMP 共价键 酪氨酸残基 GS(AMP) 腺苷酰基转移酶(Adenylyltransferase，Atase) 腺苷酰化会使GS的活性降低或丧失 铵浓度 铵盐↑ 腺苷酰化程度↑ GS酶活力↓ 因此我们可以利用重叠引物法将GS结构基因的 Tyr405突变为Phe405从而除去GS腺苷酰化位点。
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策划：林骥晗、王蒙、刘一凡 资料：卢霄崎、杨帆 整理：林骥晗 制作：杨瀛、邢桦彬 展示：刘一凡 茶水：王瀚泽、，毛新宇、甘海威 托儿：王蒙
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可以看出Gln转化量随Glu浓 度的增加而有所提高。这可 能是由于谷氨酰胺合成酶的 分子结构所致:Glu进人酶活 性中心部位很困难。而高浓 度的Glu则会增加或加快其进 入到酶活性中心部位，促进 酶催化反应。但从如图4中也 能看到Gln转化率却随着Glu 浓度的增加而下降。
4谷氨酸发酵控制
由于各种微生物所具有的酶系不同，所 能利用的碳源往往是不同的。目前所发现的 谷氨酸产生菌均不能直接利用淀粉，只有利 用葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖等单糖或双 糖，有些菌种能够利用醋酸、乙醇、正烷烃 等。由于国内绝大多数味精厂采用的碳源为 淀粉水解糖，因此这里主要介绍淀粉水解糖 作业碳源的发酵。
培养基中糖浓度对谷氨酸发酵有很大影 响。在一定范围内，谷氨酸产酸率随糖浓 度增加而增加，但当糖浓度过高时，由于 渗透压增大，对菌体生长和发酵均不利， 当工艺条件配合不当时，糖酸转化率相当 低。同时培养基浓度大，氧溶解的阻力也 增大，影响供氧效率。
由于双酶法（高温淀粉酶液化、糖化 酶水解）对原料中生物素等营养因子破坏 很少，因此采用双酶法制糖时，如果采用 生物素亚适量工艺进行谷氨酸发酵，尽量 采用精制淀粉。
4.1.2 氮源
氮源是合成菌体蛋白质、核酸等含氮物 质和合成谷氨酸氨基的来源。同时，在发酵 过程中一部分氨用于调节发酵液pH，形成谷 氨酸铵。因此，谷氨酸发酵需要的氮源比一 般的发酵工业要高，一般发酵工业碳氮比为 100: 0.2～2.0，而谷氨酸发酵的碳氮比为 100: 15～30。
磷酸盐对谷氨酸发酵影响很大。当磷 酸盐偏高时，菌体代谢转向合成缬氨酸； 但如磷酸盐过低，菌体生长也不好，造成 延长发酵时间，影响谷氨酸的合成。
②硫酸镁 Mg2+许多重要酶(如己糖磷酸化酶、异柠 檬酸脱氢酶、羧化酶等)的激活剂。如果Mg2+ 含量太少，就会影响其底物的氧化。一般革 兰氏阳性菌对Mg2+的最低要求为25mg/L；革 兰氏阴性菌为4～5mg/L。 MgSO4· 2O中含Mg2+ 9.87%，发酵培 7H 养基中添加0.5g/L MgSO4· 2O时，Mg2+浓 7H 度约为50mg/L。
谷氨酰胺合成酶的基因表达和谷氨酰胺代谢途径的定向进化
中山大学硕士学位论文谷氨酰胺合成酶的基因表达和谷氨酰胺代谢途径的定向进化姓名：杜云平申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：刘建忠20070607 中山大学２００７届硕士学位论文杜云平了定向进化。
经亚硝基胍（ＮＴＧ）和紫外线诱变后，选用谷氨酰胺的结构类似物磺胺胍（ｓＧ）以及硫酸铵（（ＮＨ，）：Ｓ０，）筛选出四株具有两重抗性标记的谷氨酰胺高产菌株（产量分别为３１．３４９／Ｌ，３０．２８９／Ｌ，３０．６２ｇ／Ｌ和３１．８１ｇ／Ｌ）。
然后在青霉素Ｇ为０．６Ｕ，处理３ｈ的条件下去除谷氨酸棒杆菌的细胞壁，运用原生质体融合技术使具有不同正突变的多个全基因组进行随机重组。
经三轮的基因组重排，谷氨酰胺的产量达到４７．３５ｇ／Ｌ，提高４８．８５％，菌株命名为ｃｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＧ．ＳＨＵ３。
最后，我们对所获菌株：Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ－（ｉＳ和ＣｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＧ．ＳＨＵ３进行了５．Ｌ发酵罐的发酵实验。
在采用搅拌速率为８５０ｒｐｍ，通气量为１．５ＶＶＭ的条件下和初期脲量为１．５ｇ／Ｌ（摇瓶初脲量的３０％），在发酵中后期流加４５％的尿素达到控制ｐＨ维持在６．２左右，同时达到补充氮源的双重目的。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｐＥＣ－Ｘ１０９Ｅ－ＧＳ５－Ｌ发酵产量提高到６３．００ｇ／Ｌ，发酵周期缩短为２８ｈ，产率为２．Ｌ．２５ｇ．１／ｈ。
而ＣｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＧ＝ＳＨＵ３发酵产量提高到７４．８２９／Ｌ，发酵周期缩短为３６ｈ，产率为２．０８舀Ｌ．１／ｌＩ。
关键词：谷氨酸棒杆菌谷氨酰胺合成酶定向进化表达基因组重排Ⅱ中山大学２００７届硕士学位论文杜云平ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｌｕｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｇｅｎｅａｎｄｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙｏｆｇｌｕｔａｍｉｎｅｉｎＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＵＴＨＯＲ：ＹＵＮ．ＰＩＮＧＤＵＳＵＰＥＲⅥＯＲ：ＡＳＳＯＣＵⅡ１ＥＰｒｏｆ．Ｊ¨蝌．ＺＨＯＮＧＵＵ心ＯＲ：ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹＬ－Ｇｈｔａｍｉｎｅ（Ｌ－Ｇｈ）ｗａｓａｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙｅｓｓｅｎｔｉａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｍａｉｎｌｙｕｓｅｄｔｏｃｕｒｅｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｏｆｄｉｇｅｓｔｉｖｅｕｌｃｅｒａｎｄｔｈｅｂｒａｉｎｎｅｒｖｅａｓｏｎｅｋｉｎｄｏｆｉｍｐｏｒｔａｎｔｎｕｔｒｉｍｅｎｔａｎｄｐｒｏｍｉｓｉｎｇｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｓｉｎｃｅ１９７７，ＧｌｕｔａｍｉｎｅｈａｄｂｅｅｎｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙｐｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎＪａｐａｎａｎｄＫｏｒｅａ．Ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｇｈｔａｍｉｎｅｈａｄｒｅａｃｈｅｄｔｏ６０９．Ｌ－１ｉｎＪａｐａｎａｎｄ５０ｇ．Ｌ１ｉｎＫｏｒｅａｓｉｎｃｅｔｈｅｍｉｄｄｌｅｏｆ１９９０ｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｇｈｔａｍｉｎｅｃｏｕｌｄｎｏｔｒｅａｃｈａｔｔｈｅｓｅｌｅｖｅｌｓｉｎＣｈｉｎａ．Ｉｎｏｕｒｓｔｕｄｙ，ａｆｔｅｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔｈｅｇｌｕｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＧＳ）ｇｅｎｅ，ｇｅｎｏｍｅｓｈｕｆｆｌｉｎｇｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｇｈｔａｍｉｎｅ．Ｆｉｒｓｔｏｆａｌｌ，ｗｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｇＧＳｇｅｎｅｂｙＰＣＲａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｗｈｏｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｇｈｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｇｅｎｅｏｆＣｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｐｕｂｌｉｓｈｅｄｂｙＪａｋｏｂｙ．ＡｆｔｅｒｃｌｏｎｉｎｇｉｎｔｏｔｈｅｖｅｃｔｏｒｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ，ｔｈｅⅢ中山大学２００７届硕士学位论文牡云平ｒｅｓｕｌｔａｎｔｐｌａｓｍｉｄｗａｓｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｔｏＣｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｂｙｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎｆｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｎｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆ３％ｇｌｙｃｉｎｅａｎｄ２．５ｈｐｒｅ·ｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓｗｅｒｅｆｕｒｔｈｅｒｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙｔｗｏａｄｄｉｔｉｏｎａｌｆｒｅｅｚｅ／ｔｈａｗｃｙｃｌｅｓｏｆｃｅｌｌｓ，ｐｒｉｏｒｔｏｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｗｈｅｎｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅｒｅａｃｈｅｄａｔ２４ｈ，ｗｅａｄｄｅｄ０．５ｍＭＩＰＴＧｆｏｒｉｎｄｕｃｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＳｇｅｎｅ．Ａｓａｒｅｓｕｌｔ，ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｇｌｕｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｗａｓｅｎｈａｎｃｅｄｕｐｔｏ２６４％．ＴｈｉｓｂａｃｔｅｒｉｕｍｗａｓｎａｍｅｄＣｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｐＥＣ—ＸＫ９９Ｅ－ＧＳ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙｏｆｇｌｕｔａｍｉｎｅｉｎＣｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＷａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｂｙｇｅｎｏｍｅｓｈｕｆｆｌｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｃｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｃｅｌｌｓｗｅｒｅｍｏｓｔｌｙｇｒｏｗｎｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆ０．６ＵｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎＧｆｏｒ３ｈｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｔｈｅｃｅｌｌｗａｌｌｂｅｆｏｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈｌｙｓｏｚｙｍｅ．ＴｈｅｎｗｅｆｕｓｅｄｔｈｅｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｏｆＣｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄｗｉｔｈｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅａｎｄｔｈｅｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｒａｄｉａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｇｌｕｔａｍｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｔｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆ３１．３４ｇ／Ｌ，３０．２８ｇ／Ｌ，３０．６２ｇ／Ｌａｎｄ３１．８１ｇ／Ｌ．Ａｓａｒｅｓｕｌｔ，ａｆｔｅｒｔｈｒｅｅｔｉｍｅｓｇｅｎｏｍｅｓｈｕｆｆｌｉｎｇｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｇｌｕｔａｍｉｎｅｒｅａｃｈｅｄｔｏ４７．３５ｇ／ＬａｎｄＷａｓｅｎｈａｎｃｅｄｕｐｔｏ４８．８５％．ＴｈｉｓｂａｃｔｅｒｉｕｍＷａｓｎａｍｅｄＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＧ—ＳＨＵ３．Ｌａｓｔｂｕｔｎｏｔｌｅａｓｔ，ｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｅｓｏｆｇｌｕｔａｍｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ－ＧＳａｎｄＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＧ—ＳＨＵ３ｉｎｔｈｅ５一Ｌｆｅｒｍｅｎｔｏｒｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．ＴｏｃｏｎｔｒｏｌｐＨｉｎｔｈｅｌａｔｅａｇｅｏｆＩＶ中山大学２００７届硕士学位论文杜云平ｐｒｏｃｅｓｓｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｌａｙｅｄａｌｌｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｇｌｕｔａｍｉｎｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．ＷｈｅｎｐＨｏｆｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｗａｓｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄａｔａｂｏｕｔ６．２ｂｙｆｅｅｄｉｎｇ４５％ｕｒｅａａｆｔｅｒｉｔｎａｔｕｒａｌｌｙｄｒｏｐｐｅｄｔｏｔｈｉｓｐＨ，ｇｌｕｕａｍ〕ｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｒｅａｃｈｅｄｔｏ６３．００ｇ／ＬｉｎＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ—ＧＳａｎｄ７４．８２ｇ／ＬｉｎＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＧ－ＳＨＵ３．Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ’ｔｈｅｔｉｍｅｓｆｏｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｅｒｅｒｅｄｕｃｅｄｆｒｏｍ５０ｈｏｕｒｓｉｎｔｈｅＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒｆｌａｓｋｔｏ２８ｈｏｕｒｓｉｎＣｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ－ＧＳａｎｄ３６ｈｏｕｒｓｉｎＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＧ－ＳＨＵ３．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ，Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，ｇｌｕｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＧＳ）。
植物乳杆菌Lp-G18谷氨酰胺合成酶活力发酵工艺优化
植物乳杆菌Lp-G18谷氨酰胺合成酶活力发酵工艺优化徐煜;蒋德意;韩迪【摘要】植物乳杆菌是一种具有多种生物活性的益生菌,其中缓解肌肉疲劳和损伤能力的运动保健功能引起了市场的关注,这与其谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)的活力相关,目前尚缺乏对植物乳杆菌GS发酵工艺研究的报道.通过在培养基中添加L-谷氨酸、调整碳源以及改变金属离子质量浓度等方式提高植物乳杆菌Lp-G18发酵后的GS活力.得到优化培养基组成为:葡萄糖40 g/L(222 mmol/L)、七水硫酸镁4.92 g/L(20 mmol/L)、一水硫酸锰0.025 g/L、L-谷氨酸8.82 g/L(60 mmol/L)、蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉10 g/L、酵母膏5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、柠檬酸氢二胺2 g/L、乙酸钠5 g/L、吐温-801 g/L.采用优化培养基发酵得到的GS活力比原基础MRS培养基培养条件下的酶活力提高了1.4倍.【期刊名称】《乳业科学与技术》【年(卷),期】2019(042)002【总页数】5页(P13-17)【关键词】植物乳杆菌;谷氨酰胺;合成酶活力;发酵【作者】徐煜;蒋德意;韩迪【作者单位】润盈生物工程(上海)有限公司,上海 200436;润盈生物工程(上海)有限公司,上海 200436;润盈生物工程(上海)有限公司,上海 200436【正文语种】中文【中图分类】TS252.1乳杆菌是一类传统的、普遍被认为安全的益生菌，在酸乳、饮料、菌粉或泡菜中都有使用[1] 。
植物乳杆菌是常见的益生菌之一，具有良好的耐酸、耐胆盐能力，并具有许多益生功能，如调节肠道健康、抗氧化、抗真菌、预防便秘和腹泻、防治上呼吸道感染、抑制致病菌侵入和调节人体免疫等作用[2] 。
同时，植物乳杆菌还具有运动保健功能，具有缓解肌肉疲劳和损伤的能力[3] 。
植物乳杆菌缓解肌肉疲劳及损伤的能力与其谷氨酰胺的合成能力相关。
谷氨酰胺研究进展
谷氨酰胺研究进展L-谷氨酰胺( Gln)是由L-谷氨酸和氨化合而成的, 与谷氨酸一样也是20种氨基酸中的一种。
1883年Schulze从甜菜汁中发现了Gln。
后来又先后从发芽种子及蛋白质中检出。
1935 年, Hans Kerbs首次发现哺乳动物肾脏合成和分解L-Gln的能力, 人们开始逐渐了解它的作用。
并在随后的研究中, Kerbs强调多数氨基酸都有多种功能, 但L-Gln的功能是最丰富的。
1955年, Harry Eagle综述了哺乳动物细胞的G ln营养需要, 并强调了它是一种很重要的营养素。
近年来, 随着人们对L-Gln的生理、生化、临床等方面研究的深入和发展,Gln对生命的重要性正日渐突出, 被认为是目前所知道的最重要的氨基酸之一, 并被称之为条件性必需氨基酸, 也是一种极有发展前途的新药。
L-谷氨酰胺的理化性质L-谷氨酰胺(L-glutamine，L-Gln)是L-谷氨酸的γ-羧基酰胺化的一种条件性必需氨基酸（图1），相对分子质量146.15，熔点185℃(分解)，晶体呈白色斜方或粉末状，结晶状态下稳定，无臭，稍有甜味，溶于水(水溶液呈酸性) ，等电点5.65，几乎不溶于乙醇和乙醚。
L-Gln 属中性氨基酸，在偏酸、偏碱及较高温度下易分解成谷氨酸或环化为吡咯烷酮二羧酸。
图1 L-谷氨酰胺分子结构L-谷氨酰胺的生理特性L-谷氨酰胺是构成人体蛋白质所必需的20种氨基酸之一, 是机体含量最丰富的氨基酸, 占全部游离氨基酸60%以上，主要储存在脑、骨骼肌和血液中, 具有很广泛的生理作用: (1)维持机体免疫功能。
现有资料表明谷氨酰胺不仅是淋巴细胞和巨噬细胞的重要能量物质, 甚至可能是各种免疫细胞的主要能源物质。
小肠作为人体重要的最大免疫器官, 是利用L-谷氨酰胺的主要器官, 它的吸收细胞以很高的速率利用谷氨酰胺, 说明谷氨酰胺在机体免疫中发挥着十分重要的作用。
(2)调节蛋白质的合成和分解。
谷氨酰胺是蛋白质合成的重要调节剂, 在运动中可以调节蛋白质合成和降低肌肉蛋白质的分解, 从而维持机体的生理功能。
谷氨酸发酵影响因素及控制
生物素对菌体细胞膜通透性的影响
谷氨酸发酵采用的菌种都是生物素缺陷型，而生物 素又是菌体细胞膜合成的必须物质，因此，可以通 过控制生物素的浓度，来实现对菌体细胞膜通透性 的调节。
生物素对细胞膜合成的影响主要是通过对细胞膜的 主要成分——磷脂中的脂肪酸的生物合成来实现的， 当限制了菌体脂肪酸的合成时，细胞就会形成一个 细胞膜不完整的菌体。生物体内脂肪酸的合成途径 如下：
谷氨酸发酵是典型的代谢控制发酵 发酵过程中，谷氨酸的大量积累不是
由于生物合成途径的特异，而是菌体代谢 调节控制和细胞膜通透性的特异调节以及 发酵条件的适合。
整个发酵过程可简单的分为2个阶段: 第1阶段是菌体生长阶段; 第2阶段是产酸阶段,谷氨酸得以大量积累
。
第二节 影响谷氨酸产量的因素及发酵条件控制
NH4+不足：不利于-酮戊二酸的还原氨基化， -酮戊二酸积累，引起反馈调节
影响因素3：NH4+浓度
NH4+的供给方式（流加）： （1）液氨 （2）0.8%尿素
影响因素氨酸的产量随糖含量的增加而增加 ，但糖含量过高，渗透压过大，对菌体生长不利， 谷氨酸对糖的转化率低。
我国使用的生产菌株：
北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense) AS1.299
北京棒杆菌D110
钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum) AS1.542
棒杆菌(Corynebacterium sp.)S-914 黄色短杆菌T6~13
生产菌株特点
在己报道的谷氨酸生产菌中，除芽孢杆菌外 ，虽然它们在分类学上属于不同的属种，但都有 一些共同特点: 1. 革兰氏阳性 2. 菌体为球形、短杆至棒状 3. 不形成芽孢 4. 没有鞭毛，不能运动 5. 需要生物素作为生长因子 6. 在通气条件下才能产生谷氨酸。
氨基酸类药物的发酵生产—谷氨酸的发酵生产
生物素的来源：氨基酸生产上可以作为生物素来源的原料 有玉米浆、麸皮水解液、糖蜜及酵母水解液等，通常选取 几种混合使用。例如，许多工厂选择纯生物素、玉米浆、 糖蜜这三种物质来配制培养基。各种原料来源及加工工艺 不同，所含生物素的量不同。玉米浆含生物素500μg/kg， 麸皮含生物素300μg/kg，甘蔗糖蜜含生物素1500μg/kg。
操作简单 周期长，占地面积大。
直接常温等电点法工艺流程
发酵液
起晶中和点（pH4-4.5) 育晶（2h）
盐酸
菌体及细小的 谷氨酸晶体
等电点搅拌pH3-3.22 静置沉降4-6h 离心分离
成品
母液
干燥
湿谷氨酸晶体
2、离子交换法
可用阳离子交换树脂来提取吸附在树脂上的谷氨 酸阳离子，并可用热碱液洗脱下来，收集谷氨酸 洗脱流分，经冷却、加盐酸调pH 3.0～3.2进行结 晶，之后再用离心机分离即可得谷呈棒形或短杆形； 革兰氏阳性菌，无鞭毛，无芽孢；不能运动； 需氧性的微生物； 生物素缺陷型； 脲酶强阳性； 不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白、明胶等；
发酵中菌体发生明显形态变化，同时细胞膜渗透性改变； 二氧化碳固定反应酶系强； 异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循环弱； α-酮戊二酸氧化能力微弱； 柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶活
有机氮丰富有利于长菌，因此谷氨酸发酵前期要 求一定量的有机氮，通常在基础培养基中加入适 量的有机氮，在发酵过程中流加尿素、液氨或氨 水来补充无机氮。
（3）无机盐
磷酸盐 ：工业生产上可用K2HPO4·3H2O、KH2PO4、 Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O等磷酸盐，也可用磷酸。 过高：代谢转向合成缬氨酸。 过低：菌体生长缓慢。
微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)发酵中试条件优化的研究
微生物谷氨酰胺转胺酶（MTG）发酵中试条件优化的研究在本文中,以10升生物反应器为研究基础,对影响微生物谷氨酰胺转胺酶（MTG）合成的操作条件如搅拌和转速以及发酵条件的影响因子如溶解氧和pH 值进行一定的研究,在此研究基础上进行了初步的葡萄糖补料和放大实验研究,最后根据本实验室的发酵体系,在优化好的条件基础上建立了一个包括三个数学方程的MTG分批发酵的动力学模型,其主要结果如下: 1.在摇瓶的基础上,用不同培养基来研究MTG分批发酵的动力学关系,研究表明,MTG分批发酵中细胞生长与产物合成是一种偶联与非偶联的复合模型,产物合成与底物（碳源）消耗是一种直接利用的关系,为进一步的实验研究提供了一定的理论参考。
2.在10升的生物反应器上,对搅拌转速和通气量进行了一定的研究,在本文中350rpm的搅拌转速对细胞生长和产物合成是比较有利的,1.0vvm左右的通气量对细胞生长和产物合成是比较有利的。
最后对通气量和搅拌转速进行了一定的混合,在10升的生物反应器上,在0h-8h前搅拌转速为250rpm,通气为0.6vvm左右,在8h-32h之间,搅拌转速为350rpm,通气为1.0vvm左右,在32h后,搅拌转速为250rpm,通气为0.7vvm左右。
MTG在47小时达到4.36(u.ml<sup>-1</sup>),生物得率系数为1.545(g.g<sup>-1</sup>)。
3.在对MTG自然分批发酵时溶解氧浓度的变化情况分析下,在本文中,在发酵前期高的溶解氧浓度（30%）对细胞的生长和产物的合成都是比较有利的,在发酵后期,低的溶解氧浓度（10%）对提高MTG的量和延长微生物细胞的代谢时间是有效的。
最后对整个发酵过程的溶解氧浓度进行一定的分阶段控制的策略,结果表明,把DO分阶段的控制（前32小时控制在30%左右,32小时后控制在10%左右）这一组合比较合适。
谷氨酸的代谢与调控
谷氨酸的代谢与调控谷氨酸是一种常见的氨基酸，在人体代谢中扮演重要的角色。
它的代谢和调控涉及到多个生化通路和物质，如谷氨酰胺、谷酰胺和氨基酸转运体等。
本文将从谷氨酸的合成、降解和利用等方面介绍其代谢与调控。
谷氨酸的合成路径涉及到多个步骤，其中最重要的是谷氨酸合成酶的催化作用。
该酶能够将谷氨酰胺和α-酮戊二酸反应生成谷氨酸和谷酰胺。
谷氨酸合成酶需要蛋白激酶A、活性多肽和NADPH等协同作用，才能够保持其正常的催化活性。
除了合成，谷氨酸的降解也是人体代谢中的一个重要环节。
人体中谷氨酸降解主要通过转化成脱氨酶谷酰胺酶的作用完成，该酶能够将谷氨酸转化成α-酮戊二酸和氨基氮。
在这个过程中，谷氨酸转运体则扮演了重要的运输作用，将谷氨酸转运到靶细胞或组织中，完成降解反应的催化。
谷氨酸的利用主要体现在人体代谢中的多个生化通路中。
例如，谷氨酸可以参与氧化应激反应和葡萄糖产生反应，后者主要发生在肝脏和小肠等组织中。
谷氨酸还可以参与尿素循环和酮体生成等反应，这些反应通常发生在骨骼肌和肝脏等组织中。
除了谷氨酸的基本代谢通路，人体中还存在多种调控因子，可以调节谷氨酸合成和降解的速率。
例如，蛋白激酶A可以激活谷氨酸合成酶，从而增加谷氨酸合成速率；而一些激素和细胞因子则可以抑制谷氨酸合成酶和谷氨酸转运体的活性，从而减缓谷氨酸的利用速率。
此外，环境和生活方式也会对谷氨酸的代谢和调控产生影响。
例如，人体遭受长期的营养不良和蛋白质饥饿时，谷氨酸合成会增加，而降解则相应减少。
另外，体育锻炼和运动也会对谷氨酸的代谢和调控产生影响，可以增加其利用速率和降解速率。
综上所述，谷氨酸的代谢和调控是人体代谢中的重要环节。
在人体不同的组织和生化通路中，其功能各异，但均与谷氨酸的合成、降解和利用密切相关。
人体内存在多种调控因子，可以影响谷氨酸的代谢速率和方向，这些调控因子不仅来自于体内的生物学过程，也受到环境和生活方式的影响。
水稻谷氨酸合成途径调控机制研究
水稻谷氨酸合成途径调控机制研究水稻作为我国主要的粮食作物之一，其高产、优质的培育一直是农业科技工作者们不断探索的方向。
其中，水稻谷氨酸的合成是影响水稻产量和质量的关键环节之一。
本文将详细探讨水稻谷氨酸合成途径的调控机制研究。
一、水稻谷氨酸的合成途径谷氨酸是水稻中重要的生理活性物质之一，具有促进植物的生长发育、提高植物对环境逆境的抗性和改善植物对环境污染物的耐受力等多种生理功能。
水稻谷氨酸的合成是一个复杂的代谢过程，包括多个关键酶和中间产物参与其中。
水稻谷氨酸合成的途径如下图所示：（图片）在水稻谷氨酸的合成途径中，谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合成酶（GOGAT）是两个重要的酶，分别推动谷氨酸途径中的第一阶段和第二阶段反应。
GS参与了谷氨酰胺的合成，是水稻植物体内氨基氮的主要来源。
而GOGAT则利用从GS反应中生成的谷氨酰胺回收氨，同时将谷氨酸合成所需的碳源和氮源连接起来。
此外，谷氨酸同源物转移酶（GPT）和谷氨酸脱氨酶（GDH）等也参与了谷氨酸合成途径中的反应过程。
二、水稻谷氨酸合成途径的调控机制水稻谷氨酸的合成途径受到多种因素的调控，包括内源和外源因素。
内源因素主要指水稻本身激素、信号分子等内源物质对谷氨酸合成途径的调节，外源因素则包括环境温度、光质、营养等外部因素对谷氨酸合成途径的调控。
1.内源调控内源因素对水稻谷氨酸合成途径的调控机制复杂多样。
目前，研究表明ABA是水稻干旱胁迫时调控谷氨酰胺代谢途径的重要激素之一。
ABA能够通过抑制GS和GOGAT的表达，从而降低谷氨酰胺的合成和谷氨酸的转化。
此外，茉莉酸、γ-氨基丁酸和乙烯等激素也参与了水稻谷氨酸合成途径的调控。
2.外源调控水稻谷氨酸合成途径的外源调控主要包括温度、光质和营养等因素。
水稻的生长和谷氨酸代谢是受温度影响很大的代谢过程之一。
研究表明，低温对于水稻GS的表达和活性具有抑制作用，而高温则会提高水稻GS的活性和转化率。
此外，水稻中光质也对谷氨酸合成途径产生影响。
产谷氨酰胺合成酶发酵条件的研究
维普资讯
辽 宁 大 学学 报
自然科 学 版
Ｊ Ｕ Ｎ Ｌ Ｏ Ｏ ＮＧ ＵＮ Ｅ ｓ Ｔ Ｏ Ｒ Ａ Ｆ ｕＡ ＮＩ Ｗ Ｒ Ｉ Ｙ
Ｎａ ｕ ａ ｃ ｔｒ ｌＳ ， Ｅｄｔ ｎ ｉｉ ｏ
第３ ３卷
第 ３期
２Ｏ Ｏ６年
Ｖ０ ． ３ Ｎｏ． ２ ｏ １３ ３ ｏ ６
作者简介 ： 魏 杰 （９７） 女 ， 宁 沈 阳人 ， 师 ， 事 现 从 事 微 生 物 工 程 教学 及 研究 工 作 研 究 １７ ． ， 辽 讲 从 基 金 项 目 ： 宁 省科 技 攻 关 项 目（０ ４００４ 辽 ２０２５０ ） 收 稿 日期 ：０ ６０ － ６ ２ ０ －４２ 通讯作者 ： 宏生， 刘 教授 ， － ａ ：ｕｏｇｓｅ ｇ ｎ ．ｄ ．ｎ Ｅ ｍ ｉ ｌ ｈｎ ｎ ＠Ｌ ｕｅｕ ｃ ｌｉ ｈ
菌体 悬 浮于 ４ ０ｍ ０ Ｌ缓 冲液 中 ， Ｖｒ ｎｃ０ 用 ｉ ｏｉ ０超 声 ｓ ３ 破 碎 器于 冰浴 中处理 ３ｍｎ 然后 于 ４℃ ．８ ０ ／ ｉ， １ ０ｒ ０ ｍｎ离心 ３ ｉ， 清部 分为 无细 胞抽提 液 ． ｉ ０ｍ ｎ 上
则 主要分 布于真 核生 物和 少量 细菌 中 ，Ｇ Ｈ 与前 ＳＩ 两类 差异较 大 ， 仅在 少量 的细菌 中发 现 ． 根据 一些 调节 特性 和氨 基酸序 列 的相 似度 ， 可将 Ｇ 又 ＳＩ进
１ 材 料 与 方 法
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通过前 期 研 究 得 到 ３种 节 杆 菌 ，Ｌ Ｕ ０ ６ ， Ｎ １５
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谷氨酸发酵主要影响因素及其控制
谷氨酸发酵的主要影响因素包括微生物、营养物质、pH值、温度和压力等。 首先，微生物是谷氨酸发酵的关键因素。不同种类的微生物具有不同的生长特性 和代谢途径，因此选择适合的微生物种类对谷氨酸发酵至关重要。其次，营养物 质是微生物生长和谷氨酸合成的基础。碳源、氮源、无机盐等营养成分的种类和 浓度都会影响发酵过程。
谷氨酸发酵主要影响因素及其 控制
基本内容
谷氨酸发酵是一种广泛应用于食品、医药和化工等领域的重要生物发酵过程。 在此过程中，微生物利用各种营养物质进行生长繁殖，并产生谷氨酸。了解谷氨 酸发酵的主要影响因素及其控制方法对于提高发酵效率、优化工艺具有重要意义。 本次演示将就谷氨酸发酵的影响因素及控制方法进行详细论述。
参考内容
基本内容
谷氨酸发酵是一种重要的生物过程，用于生产谷氨酸盐，如谷氨酸钠（味精 的主要成分）。在这个过程中，微生物，主要是谷氨酸棒状杆菌，利用糖或其他 碳水化合物作为碳源，并产生谷氨酸作为主要产物。这个过程需要精密的设备管 理以确保效率和产量。本次演示将讨论谷氨酸发酵设备管理的现状和发展趋势。
pH值是调节微生物生长和代谢的重要因素，不同pH值条件下，微生物的生长 速率和谷氨酸的合成量会有所不同。此外，温度和压力也会影响微生物的生长和 代谢，进而影响谷氨酸发酵过程。
针对上述影响因素，可采取以下控制方法以提高谷氨酸发酵效率：
1、优化工艺：通过调整培养基成分、优化发酵条件，提高谷氨酸产量。例 如，可以通过优化碳源、氮源的比例，为微生物提供最佳的生长环境；通过调节 pH值，控制微生物生长和谷氨酸合成；通过控制温度和压力，维持良好的发酵环 境。
3、清洁与卫生管理
谷氨酸发酵设备的清洁和卫生管理对于产品的质量和设备的运行至关重要。 为此，大多数企业都采用先进的清洁和消毒系统，以确保设备和管道的清洁，防 止微生物污染。
微生物发酵生产谷氨酰胺转氨酶工艺流程
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谷氨酸生产的培养基和发酵工艺控制的主要技术参数
谷氨酸生产的培养基和发酵工艺控制的主要技术参数摘要：谷氨酸非人体所必需氨基酸，但它参与许多代谢过程，因而具有较高的营养价值，谷氨酸能与血氨结合生成谷酰胺，接触组织代谢过程中所产生的氨毒害作用，另外谷氨酸单钠盐有很强烈的鲜味，是重要的调味品。
关键词：谷氨酸发酵影响因素工艺控制谷氨酸发酵主要原料有淀粉、甘蔗蜜糖、甜菜蜜糖等，国内多以淀粉为原料生产谷氨酸。
谷氨可通过谷氨酸生产菌在代谢过程中合成，这是一个复杂的过程，第一步是将原料淀粉水解成糖，即糖化作用，第二步是将糖在谷氨酸菌的作用下发酵成谷氨酸。
由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径：一、谷氨酸的生物合成途径主要有EMP途径、HM途径、TCA途径、乙醛酸循环、伍德—沃克反应等。
谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经糖酵解(EMP途径)和己糖磷酸支路(HMP途径)生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A(乙酰COA)，然后进入三羧酸循环，生成α-酮戊二酸。
α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。
当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。
因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。
二、谷氨酸生产菌的生化特征有：1、有催化固定CO2的二羧酸合成酶；2、a—酮戊二酸脱氢酶的活性很弱，这样有利于a—酮戊二酸的蓄积；3、异柠檬酸脱氢酶活力很强，而异柠檬酸裂解酶的活性不能太强，这样有利于谷氨酸前提物a—酮戊二酸的合成，满足合成谷氨酸的需要；4、谷氨酸脱氢酶的活力高，这样有利于谷氨酸的合成；5、谷氨酸生产菌经呼吸链氧化的能力要求弱；6、菌体本身进一步分解转化和利用谷氨酸的能力低下，利于谷氨酸的蓄积。
三、谷氨酸发酵工艺谷氨酸生产菌能在菌体外大量积累谷氨酸是由于菌体代谢调节处于异常状态，只有具特异性生理特征的菌体才能大量积累谷氨酸，这样的菌体对环境条件是敏感。
谷氨酸发酵是建立在容易变动的代谢平衡上，是受多种条件支配的。
发酵法生产谷氨酰胺研究综述_王书平
谷氨酰胺发酵的控制技术已有较多报道。如图 2所示, 葡萄糖合成谷氨酸和谷氨酰胺分解为谷氨酸的反应均是在 偏碱性条件下进行的, 由谷氨酸合成谷氨酰胺的反应亦是在
偏碱性条件下进行的。而谷氨酸生产菌生长的适宜 pH 值一 般在 6. 2~ 8. 0。所以发酵前期应控制 pH 值在偏碱性环境,
to glutam ine ferm entation
3 谷氨酰胺发酵的工艺控制 一般认为, 无论是野生菌株还是突变株, 其增殖旺盛时,
进行正常代谢的微生物培养液中不存在特定的生物合成代 谢中间产物大量分泌累积的现象。因此, 为了累积特定的氨 基酸, 必须使微生物代谢异常化, 且异常化的菌种对环境条 件较敏感。
胺 31. 4 g /L, 最高产量达 33. 2 g/L[ 10] 。刘永生等以天津短杆菌 (B. tianjinese) T. G-886为出发菌株, 经诱变获得 1株谷氨酰胺
高产菌株, 其平均产谷氨酰胺 27. 3 g/L[11]。徐建华等以钝齿
棒杆菌 (C. crenatum )HU7251为出发菌株, 经亚硝基胍、硫酸二
氨基酸发酵是建立在容易变动的代谢平衡基础上的, 该 平衡受多种条件支配。氨基酸发酵是一个复杂的生化过程, 其影响因素主要有发酵培养基、温度、溶解氧、pH 值等 [ 。 14]
K ennedy等详细介绍了优化发酵培养条件的各种方法与 技巧, 并比较了各种方法的优缺点 [15]。常用的优化技术可 分为非统计优化技术 (如单次单因子法 )和统计优化技术 (如部分因子设计法 [ 16], P lacket-t Burm an法, 中心组合设计法 及 B ox-B echnken法等响应面法 [17- 21] ) 2大类, 在多因子试验 中寻找最佳条件时, 响应面法是较单次单因子法更有效的优 化技术[ 22] 。
代谢控制发酵的原理及应用
代谢控制发酵的原理及应用1. 引言发酵作为一种重要的工业生产过程，广泛应用于食品工业、制药工业、化工工业等领域。
控制发酵过程中的代谢反应是提高发酵产物得率和质量的关键。
本文将介绍代谢控制发酵的原理及其在实际应用中的意义。
2. 代谢控制发酵的原理2.1 代谢途径代谢途径是细胞内各种代谢酶反应所组成的网络。
通过对代谢途径进行控制，可以实现对发酵过程中代谢产物的合成与降解的调控。
•代谢途径的分类：–糖代谢途径：通过调节糖酵解和糖异生途径的活性，实现对碳源代谢的控制。
–脂肪代谢途径：调节脂肪酸合成和降解途径，影响发酵产物的合成。
–氨基酸代谢途径：调控氨基酸的合成和降解，影响蛋白质合成和产物生成。
–核苷酸代谢途径：控制DNA和RNA的合成，对生物体的生长和发育起到重要作用。
2.2 代谢调控策略代谢调控策略是通过对代谢途径内关键酶的调控，实现对代谢产物合成和降解速率的调控。
•调控策略的分类：–底物浓度调控：通过调节底物浓度，影响酶催化反应速率，进而控制代谢产物的生成。
–反馈抑制：通过代谢产物对酶活性的抑制，调节代谢途径内各个酶的活性，从而控制代谢产物的生成。
–遗传调控：通过改变生物体内部基因表达水平，调节代谢途径内酶的含量，进而影响代谢产物的合成速率。
–外部条件调控：例如温度、pH值等环境条件的调控，对代谢产物合成有重要影响。
3. 代谢控制发酵的应用3.1 食品工业在食品工业中，利用代谢控制发酵技术可以实现食品添加剂、发酵食品等的生产。
•食品添加剂的生产：通过控制微生物发酵过程中的代谢途径和代谢产物的合成，可以高效生产食品添加剂，如谷氨酰胺、谷氨酰胺钠等。
•发酵食品的生产：利用代谢控制发酵技术，可以生产出口感好、品质优良的发酵食品，如酸奶、面包等。
3.2 制药工业代谢控制发酵技术在制药工业中有着广泛应用。
•抗生素的生产：通过调控微生物发酵过程中底物浓度、代谢途径和酶活性，可提高抗生素的产量和质量。
•生物药物的生产：通过遗传调控和代谢途径调控，可以实现生物药物的高效合成，如重组人胰岛素和重组人生长激素等。
发酵法生产_L_谷氨酰胺的研究进展
发酵法生产L 谷氨酰胺研究进展L-谷氨酰胺(L-glutamine, L-Gln)是L-谷氨酸的γ - 羧基酰胺化的一种条件性必需氨基酸(图1),相对分子质量146.15,熔点185℃(分解),晶体呈白色斜方或粉末状,结晶状态下稳定,无臭,稍有甜味,溶于水( 水溶液呈酸性) ,等电点 5 . 6 5 ,几乎不溶于乙醇和乙醚. L-Gln 属中性氨基酸,在偏酸,偏碱及较高温度下易分解成谷氨酸或环化为吡咯烷酮二羧酸.O H 2N C CH2 CH2 N H 3+ CH COO-L-Gln是人体血液中浓度最高(500～900 mol/L)的游μ 离氨基酸,所占比例高达61%.L-Gln 在肾脏是肾小管泌氨作用的主要氮源,在肝脏是糖异生和尿素合成的原料,在神经组织又是神经递质的前体物质,在血液中有暂时解除氨毒的作用,现已普遍认为L - G l n 是一种"条件性必需"氨基酸. L-Gln 主要生理功能如下: 治疗胃肠溃疡[1].因外源L-Gln 能促使胆汁分泌和正常排粪,故L-Gln 已用于临床治疗腹部溃疡,节段性回肠炎和过敏性肠炎.如日本寿制药株式会社生产的"麦滋林" ,为L - G l n / 萸磺酸钠颗粒剂,该胃药制剂现已进入我国市场.缓解运动综合症或运动疲劳[2].L-Gln可以调节蛋白质合成,抑制蛋白质降解,糖原合成,细胞生长,激活免疫,提高生长激素水平.让成年人喝下一瓶含有2g L-Gln 的饮料,90min 内,其血液样品中生长激素最高可增长4 3 0 % .目前已大量用于治疗运动员的运动综合症和高强度劳动或运动后的疲劳恢复. 调节机体免疫力[3-4].外源L-Gln 会刺激免疫球蛋白分泌,促进免疫系统重建,如: 烧伤,艾滋病,关节炎等免疫系统的恢复. 增强脑神经机能[5] .L-Gln 可被用作中枢神经抑制剂,在大脑中被转化成谷氨酸,与葡萄糖一起参与脑代谢,以平衡脑内电流脉冲,有利于人脑的清醒和情绪稳定,是少数几种能克服血脑屏障和参与大脑化学反应的物质之一,被称为"大脑燃料" . L-Gln 在癌症治疗上的潜在价值[6], 减少癌症治疗中化疗和放疗的副作用. 1 L- 谷氨酰胺的生产方法由于L-Gln 重要的生理功能和临床治疗作用,如何实现L-Gln 的工业化生产越来越受到关注.L-Gln 的生产方法主要有化学合成法,酶促合成法和发酵法. 1.1 化学合成法经L-Gln 合成酶(GS)催化而成,如图 3 所示. 与化学合成法相比,酶促合成法反应步骤相对简单,其中三磷酸腺苷( A T P ) 是必需的.A T P 价格昂贵, 同时酶促反应底物NH 4 + ,副产品二磷酸腺苷(ADP)都明显抑制L-Gln 的生成,因此该生产方法不能满足大规模工业化生产的需要. 1.3 发酵法发酵法是目前最常用的L-Gln 生产方法,具有原料来源广泛,生产成本低,产品质量可控,产物单一等优点,适宜于大规模工业化生产.1 9 6 1 年,T s u n o d a 等[ 7 ] 首先发现除了谷氨酸以外,在谷氨酸发酵液中还有L-Gln;1963 年,Oshima 等[8] 通过改变谷氨酸微球菌的发酵条件使谷氨酸发酵转向L-Gln 发酵;七十年代, Nakanishi 等[9-11]进一步证实了,改变发酵条件可以使谷氨酸产生菌从谷氨酸发酵转向L - G l n 发酵.八十年代后,我国在实验室小试或中试规模中进行了L-Gln 发酵法生产,但是L-Gln 产量低[12-13] ,至今未能进行大规模工业化生产. 本文对发酵法生产L-Gln 的关键技术环节(如菌种选育,发酵工艺和分离纯化) 的研究进展进行综述,并详细阐述L-Gln生物合成代谢调控和新型过滤及其藕联技术在下游分离纯化过程中的应用. 2 2.1 发酵法生产L- 谷氨酰胺菌种选育L-Gln 生产菌种主要来自谷氨酸生产菌,如棒杆菌C H 3O H CS2 NH3 C 5 H 9 NO 4 (Glu)—————→ C 6 H 11 NO 4 —————→ C 7 H 20 N 4 O 4 S2 —————→ H 2S O 4 NH3 HOAC C 7 H 18 N 4O 3 S 2 ————→ C 5 H 10 N 2 O 3 (L-Gln) C H 3O H N H 2N H 2 Raney 镍C 5 H 9 NO4 (Glu)—————→ C 6 H 11 NO 4 —————→ C 6 H 13 N 3 O 3 —————→ H 2S O 4 C6H 10 N2O 3(L-Gln) 图2 化学法合成L-Gln 流程图Fig.2 Chemical synthetic pathway for production of L -Gln(Corynebacterium sp.)[9-11], 短杆菌(Brevibacterium sp.) [7,14] ,微球菌(Micrococcus sp.)[8].此外,还有非谷氨酸生产菌, 如产黄菌(Flavobacterium rigense)的一些变[15-18] 异菌种. 目前,L-Gln 生产菌种的选育主要采用传统的随机诱变结合定向筛选的方法,随机诱变包括化学诱变,物理诱变和物理化学复合诱变等,常用的诱变剂和诱变因素有硫酸二乙酯,亚硝基胍,γ- 射线,紫外线等; 定向筛选包括对氨基苯甲酸的结构类似物磺胺胍的抗性突变筛选,L-Gln 结构类似物抗性突变筛选,高NH 4 + 浓度抗性突变筛选等.此外,随着人们对L-Gln 生产菌株遗传特性的研究,通过基因工程的手段改造生产菌种提高L-Gln 的生产能力,有可能从根本上解决L-Gln 生产能力低的难题. Y a m a d a 等[ 1 6 , 1 8 ] 以非谷氨酸生产菌产黄菌属(Flavobacterium rigense)FERM-P no. 3556为起始菌种, 通过紫外诱变获得了一株青霉素抗性突变株FERM-P no. 3628,L-Gln 生产能力由10g/L 提高到25g/L. 湖北工业大学吴思方等[19,24]采用γ- 射线- 硫酸二乙酯-γ- 射线进行复合诱变,磺胺胍抗性筛选得到一株高产主要有如图 2 所示两种化学合成法生产L-Gln: 由化学合成法流程图可见,两种方法均采用浓硫酸作为必需的催化剂,反应条件苛刻,反应步骤多,收率低.第二种方法虽有所改进,但仍很复杂,且要求使用催化剂Raney 镍,对工艺条件提出了新的要求.化学合成法使用的化学试剂在产品中会有不同程度的残留,L-Gln 作为一种药或功能食品,对纯度有较高的要求,而且大量化学试剂的使用会造成环境污染,从而限制了产品质量及使用范围. 1.2 酶促合成法酶促合成法生产L-Gln 是以NH 4 + 及谷氨酸作原料,Glu + NH4+ + ATP GS L-Gln + ADP + Pi +H2O图3 酶法合成L-Gln 流程图Fig.3 L -Gln produced by enzyme catalysis※专题论述食科品学2008, Vol. 29, No. 03501菌株SH77,L-Gln 平均生产能力由8.2g/L 提高到55.3g/L. 孙智杰等在谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum) ATCC 1 4 0 6 7 中表达增强摄氧的透明颤菌血红蛋白基因[20]Gln 合成需要过量铵之间的矛盾,在谷氨酸棒杆菌突变株NS61 中利用GS 酶的表达特性,设计了在线氮饥饿处理的发酵过程;在限制初始氮源浓度的条件下,菌体在生长后期自然进入氮饥饿状态,G S 酶表达量增加,此后再提供充足的铵盐,提高L-Gln 的合成能力,结果使L-Gln 的产量提高了69%,达到11.5g/L,菌体内谷氨酰胺合成酶活性提高了2 倍以上.李春等[26]提出了原位氮饥饿与铵盐梯度补加协同调控策略,提高了谷氨酰胺的产量,最高产量可达 2.19%,比原位氮饥饿工艺提高了近72%,比未经过氮饥饿处理的旧工艺提高了近200%, 达到19.7g/L. 2.3 生物合成代谢调控GDH Glu + H2O + NADP +(Vitreoscilla hemoglobin gene,vgb),以此提高细胞的摄氧能力及能量的供给水平,结果在溶氧浓度只有5% 的条件下,重组菌比野生菌细胞干重提高了 1.2 倍, 达到了54.1g/L,谷氨酸的生产能力提高了6.5 倍,达到了9.56g/L, L-Gln的生产能力提高了1.4倍, 达到了5.51g/L. U s d i n 等[ 2 1 ] 从丙酮丁醇梭杆菌( C l o s t r i d i u m acetobutylicum)P262中克隆L-Gln合成酶的编码基因, 构建pHZ200 重组质粒,导入E.coli ET8051 中进行克隆表达,并研究了L-Gln 合成酶的表达调控,结果发现L-Gln 合成酶不受腺嘌呤共价修饰调控,重组菌的生长速度是野生菌的1 . 7 倍;Y a m a m o t o 等[ 2 2 ] 从腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)中克隆谷氨酰胺合成酶基因Y- 3 0 ,导入大肠杆菌中进行克隆表达,其表达量是Pseudomonas taetrolens 中的30 倍.上述基础工作,为构建工程菌大规模工业化生产L-Gln 奠定了一定基础. 2.2 2.2.1 发酵工艺培养基Nabe 等[16] 研究了NH 4 + 浓度和延胡索酸对产黄菌属(Flavobacterium rigense)生产L-Gln的影响, 结果发现延胡索酸是L - G l n 生产的关键影响因子;高浓度N H 4+ +2-oxoglutarate + NH4+ + NADPH + H+ Glu + NH4+ + ATP GSL-Gln + ADP + P i + H2O GDH 2Glu + NADP +L-Gln + 2-oxoglutarate + NADPH + H +图4 L-Gln 发酵生产相关的生物反应及其关键酶Fig.4 Related reaction and key enzyme for production of L-GlnL-Gln 生物合成是以谷氨酸(glutamate)和NH4 + 为底物, 在谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)的催化下合成的.L-Gln 生物合成在细胞内是一个动态平衡的过程,除了受到谷氨酰胺合成酶(GS)调控外,还受到谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH),谷氨酸合酶(glutamate synthase, GOGAT)的调控(图4)[27]. 因此,代谢调控生物合成L-Gln,须建立一套协同调控策略,促进谷氨酰胺合成酶( G S ) 活性,抑制谷氨酸合酶(GOGAT) 活性,抑制L - G l n 的降解,从而过量合成L - Gln. 2.3.1 生物合成途径中关键酶的调控Tesch 等[ 2 8 ] 在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中研究了N H 4 + 浓度对G D H,GS,G O G A T 活性的影响,结果发现N H 4 + 浓度从 1 m m o l / L 增加至90mmol/L 时,GDH 活性维持在1.3U/mg 蛋白,没有发生变化,但当NH4+ 浓度大于10mmol/L 时,GS,GOGAT 活性小于1mmol/L 的10%,即分别低于110U/mg 蛋白, 4 2 U / m g 蛋白;并且发现谷氨酸脱氢酶酶促反应是谷氨酸棒杆菌摄取N H 4 + 的第一步反应.此研究结果为梯度补氮生产L-Gln 提供了理论基础. S c h u l z 等[ 2 9 ] 考察了碳源和氮源对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032 中GS 和G O G A T 活性的影响,结果发现在碳源充足,氮源缺乏的条件下,G S 和G O G A T 活性分别提高了5 倍和7 倍; 在碳源和氮源都缺乏的情况下G S 活性下降了3 倍,(0.9%～1.6%)有利于L-Gln 的生产,但是当NH4+ 浓度大于1.8% 时又会抑制L-Gln 的生产;最终得出当NH 4 浓度为0.9%～1.6%,延胡索酸浓度为 5.5% 时,L-Gln 生物合成达到最大值25g/L. A n d e r s o n 等[ 2 3 ] 考察了N a C l 对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生产L-Gln 的影响,结果发现添加5.8% 的NaCl ,L - G l n 的含量提高了2 8 0 0 %,达到161.82nmol/mg 干细胞;添加10% NaCl,L-Gln 的含量提高了3400%,达到195.71nmol/mg 干细胞. 湖北工业大学吴思方等[24] 研究了氮源种类和浓度, 金属离子,CaCO 3 等对L-Gln 生产的影响,得出最佳发酵培养基为:葡萄糖1 6 % ,氯化铵4 % ,玉米浆0 . 5 % , 磷酸氢二钾0.05%,磷酸二氢钾0.05%,硫酸镁0.05%, 尿素 1.4%,硫酸亚铁0.5mg/100ml,硫酸锰 2.5mg/100ml, 硫酸锌0.5mg/100ml, 1 0.1mg/100ml, VB 结果使菌株SH77 的L-Gln 生产能力平均达53.0g/L,最高达56.2g/L,这是目前文献报道的最高产量.2.2.2 发酵控制方式因为L-Gln生物合成是在谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase,GS)催化下进行的,所以发酵法生产L-Gln 的关键在于调控G S 酶活性微生物发酵法是L-Gln 的主要生产方法,生产国主要是日本,韩国也有少量生产.1 9 7 7 年日本用发酵法生产L-Gln 的年产量达100t,1979 年上升到500t,1990 年则上升到1200t,并有逐年递增的趋势.全世界L-Gln 生产量逐年递增,在1986 年为900t,1990 年为1800t, 目前年产量约为10000t. 我国已有不少企业研究L-Gln发酵生产工艺,但只是在实验室小试或中试规模中生产L- Gln.由于发酵法生产L-Gln 国外仅日本等几个国家生产,所以国际市场对我国L-Gln 出口需求迫切,预计年出口量将迅速达到1000t. 对于我们这样一个13 亿人口的大国,L-Gln 等药用氨基酸需求量很大,有巨大的潜在市场,目前我国药用L-Gln 依靠进口且价格昂贵.预计国内L-Gln 需求可达5000 吨/ 年,现在国际市场上L-Gln 价格大约100 万元左右/ 吨,L-Gln 的生产成本大约为谷氨酸的3～4 倍,产值达到50 亿人民币,利税可达到 1 亿元人民币.因此, 发酵法大规模生产L-Gln 将满足国内的市场需求,推动我国氨基酸发酵工业的发展,同时,产品还可出口创汇进入国际市场分离纯化L-Gln 发酵过程中的主要副产物是谷氨酸,而L-Gln和谷氨酸两者分子结构和化学性质相近,分离困难,并且L-Gln 不稳定,分离过程中在酸性条件下容易转化成谷氨酸.国外80 年代报道L-Gln 提取收率为 3 0 %,近来有专利报道实验室提取收率达70% 以上[ 3 1 ] . 2.4.1 L-Gln经典提取方法L-Gln 经典提取方法有浓缩结晶法,冰析法和双柱法(阴阳离子交换树脂组合法).用离子交换法分离提取L- Gln,可将发酵液调至酸性,在酸性条件下使L-Gln 成为阳离子,用强酸性阳离子交换树脂吸附;也可将发酵液调至中性附近,使其成为阴离子,用强碱性阴离子交换树脂进行交换吸附;还可以将阳离子和阴离子交替使用. 2.4.2 L-Gln 分离纯化的最新进展新型过滤技术,过滤与离子交换耦联技术及相关设为提高发酵法生产L-Gln 产量,国内外学者进行了大量研究工作:吴思方等[28] 采用随机诱变定向筛选的育种技术,并对发酵工艺进行了优化,使L-Gln 产量达到5 6 . 2 g / L ,这是目前文献报道L - G l n 产量的最高值; Wakisaka[26]对L-Gln生物合成特性及其调控机制进行了深入研究,建立了相关的耦联发酵策略,使L-Gln 生物合备的开发应用,使L-Gln 分离提取收率,纯度得到了大幅度提高,并最终分离纯化出了符合药用标准的L-Gln.。
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• Yamamoto等从腐臭假单胞菌 (Pseudomonas taetrolens)中克隆谷氨酰胺 合成酶基因Y-30，导入大肠杆菌中进行克 隆表达，其表达量是Pseudomonas taetrolens中的30倍。
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1.3 pH对谷氨酰胺发酵的影响
pH主要影响酶的活性 和菌的代谢
在中性和微碱性条件 下（PH7.0-8.0）积 累谷氨酸，在酸性条 件下积累谷氨酰胺
Байду номын сангаас
• 发酵前期应控制pH值在偏碱性环境，以促进菌体 生长，并激活谷氨酸合成酶的活性，保证谷氨酰 胺合成前体谷氨酸的合成； • 发酵后期应控制pH值在偏酸性环境，以增加谷氨 酰胺合成酶的活性，同时抑制谷氨酰胺酶的活性 ，使谷氨酰胺大量积累生成，而减少谷氨酸的生 成量。
• GS的表达易受到高浓度铵盐的阻遏，氮源 的一次性补加也容易导致谷氨酰胺合成酶 活性急剧下降；在铵盐不足时，GS表达量 就会增加，所以氮饥饿处理可以提高中GS 的表达量，梯度补加氮源也可以尽量减少 GS活力的快速丧失。
1.1 氮源
• 氮饥饿处理
• 李春等为了解决高浓度铵盐阻遏谷氨酰胺合成酶 表达与谷氨酰胺合成需要过量铵之间的矛盾，提 出了原位氮饥饿与铵盐梯度补加协同调控策略， 提高了谷氨酰胺的产量，最高可达2.19%，比原 位氮饥饿工艺提高了近72%，比未经过氮饥饿处 理的旧工艺提高了近200% 。
• （1）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，它受天冬氨酸的反馈抑 制； • （2）丙酮酸激酶，它是一个别构酶，受乙酰CoA、丙氨 酸、ATP的反馈抑制； • （3）丙酮酸脱氢酶系，该酶是催化不可逆反应的酶，受 乙酰CoA 、NADH、GTP的反馈抑制；
• （4）异柠檬酸脱氢酶，ADP和NADH 抑制此酶的活性； • （5）Glu脱氢酶和（6）GLn合成酶，此二酶是保证α-酮 戊二酸向GLu而不是向草酰乙酸的三羧酸循环方向的关键 。同时在此循环中还存在着向天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸 的分枝代谢，我们设法减弱分枝代谢而强化主流代谢，主 要的方法是减弱催化这些分枝代谢的酶。
谷氨酸 脱氢酶
NH4+浓度
谷氨酰 胺合成 酶
谷氨酸 合酶
GOGAT
Tesch在谷氨酸棒杆菌(CorynebaCterium glutamicum) 中研究了NH4+浓度对GDH、GS、GOGAT活性的影 响，结果如下： • NH4+浓度增加时，GDH活性基本没有发生变化； • NH4+浓度大于10mmol／L时，GS、GoGAT活性小 于1 mmol／L的10％，即分别低于110U／mg蛋白、 42U／mg蛋白； • 发现谷氨酸脱氢酶酶促反应是谷氨酸棒杆菌摄取 NH4+的第一步反应。此研究结果为梯度补氮生产LGln提供了理论基础。
• 陈奎发等设计了在线氮饥饿处理的发酵过程；在 限制初始氮源浓度的条件下，菌体在生长后期自 然进入氮饥饿状态，GS酶表达量增加，此后再提 供充足的铵盐，提高L-Gln的合成能力，结果使LGln的产量提高了69％，达到11.5 g／L，菌体内 谷氨酰胺合成酶活性提高了2倍以上。
1.2 金属离子
• 为了提高谷氨酰胺的产量，金属离子特别 是Zn2+、Mg2+和Mn2+的供给是必要的。 • Zn2+对谷氨酰胺合成酶具有刺激作用，同 时Zn2+还可增强NH4Cl对谷氨酰胺酶的抑制 作用，使其不能分解谷氨酰胺。
• 中村纯等人通过敲除细菌染色体上的谷氨 酸合酶基因的方法降低细胞内谷氨酸合酶 活性,来减少谷氨酰胺的分解; • 通过增加编码谷氨酰胺合成酶基因的拷贝 数和修饰编码谷氨酰胺合成酶基因的翻译 控制区,来增强谷氨酰胺合成酶基因的表达, 促使菌体内积累更多的谷氨酰胺。
• 郑强等进行glnA基因的克隆与过量表达，利用谷 氨酸棒杆菌发酵过程产生的谷氨酸为底物，在 glnA基因表达的GS酶的催化下，诱导后的重组 茵发酵液中的L-谷氨酰胺产量提高了1.8倍，培 养基质中的铵盐反应生成L-谷氨酰胺，理论上可 以节约添加谷氨酸的成本。
谷氨酰胺合成酶突变基因
• 谷氨酰胺合成酶／谷氨酸合酶(GS／GOGAT)体 系是由铵离子浓度调节的，在较低铵离子浓度下 发挥作用，在高铵离子浓度条件下受抑制。 • 谷氨酰胺合成酶的调节开关是在其肽链405位置 的酪氨酸被定点突变为苯丙氨酸，从而失去了这 种调节机制，使得谷氨酰胺合成酶可以在高铵离 子条件下发挥催化功能，将谷氨酸转化为谷氨酰 胺。
谷氨酰胺的发酵控制 /JDPP T
1
发酵条件控制 代谢途径调控
2
4
右图是谷氨酰胺发 酵工艺图 L-谷氨酰胺是在谷 氨酸发酵工艺基础 上，在谷氨酰胺合 成酶作用下生产L谷氨酰胺。
谷氨酰胺
采用谷氨酸生产菌,可以实现谷氨酸发酵转向谷氨酰 胺发酵。发酵转换的条件是: 一、发酵培养基中有高浓度的铵盐存在,其含氮量比 谷氮酸发酵时所用的氮量多得多,在谷氨酰胺合成 酶的催化下,由谷氨酸进一步合成为谷氨酸胺； 二、菌体增殖进入平衡期后,发酵pH值必须调整到 6.0左右,以抑制谷氨酰胺酶的活力,避免谷氨酰胺被 分解成谷氨酸。
1.4 供氧对谷氨酰胺发酵的影响
• 氨基酸发酵过程中，供氧不足会积累乳酸 等副产物，菌体减少。 • 通过通气搅拌增加溶氧量。
生产谷氨酰胺条件
影响细胞 膜通透性
二 代谢途径调控
天津短杆菌株合成谷 氨酰胺的主流代谢中， 有几个关键酶控制其 强度，这几个酶分别 受不同代谢物的反馈 调节，活化这些酶有 利于L-GLn的生物合 成。
生物合成途径中关键酶的调控
• 陈国强等人重组了一株含有透颤菌血红蛋白基 因vgb和谷氨酰胺合成酶突变基因glnA’的野 生谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC14067， 可以实现在较低溶氧量水平，较低成本下，生 产较高产量的谷氨酰胺。
• vgb是编码细菌中血红素蛋白(VHb)的基因 ，VHb是以氧合态参与和氧有关的代谢，通 过将氧传递给呼吸链，而调节末端氧化酶 的活性，改变氧化磷酸化的效率，进而改 变低氧条件下的代谢途径，从分子水平上 提高重组菌对氧气的利用能力，为解决谷 氨酰胺大规模生产过程中要求高溶氧的问 题提供了一个想法。
谷氨酰胺合成机理
发酵条件的变更，谷氨 酸产生菌中的谷氨酰胺 合成酶活力增加，而谷 氨酸合酶活力受到抑制 Text in here 由于细胞环境的影响， 谷氨酰胺易从细胞中分泌 出来积累在发酵液中， 而谷氨酸渗透性减小(滞 留在细胞内)
谷氨酰 胺积累
谷氨酸
谷氨酰胺
1 发酵条件控制
L-谷氨酰胺生物合成是在谷氨酰胺合 成酶(glutamine synthetase， GS)催 化下进行的，所以发酵法生产L-Gln的 关键在于调控GS酶活性。