谷氨酰胺发酵调控

• GS的表达易受到高浓度铵盐的阻遏，氮源 的一次性补加也容易导致谷氨酰胺合成酶 活性急剧下降；在铵盐不足时，GS表达量 就会增加，所以氮饥饿处理可以提高中GS 的表达量，梯度补加氮源也可以尽量减少 GS活力的快速丧失。
1.1 氮源
• 氮饥饿处理
• 李春等为了解决高浓度铵盐阻遏谷氨酰胺合成酶 表达与谷氨酰胺合成需要过量铵之间的矛盾，提 出了原位氮饥饿与铵盐梯度补加协同调控策略， 提高了谷氨酰胺的产量，最高可达2.19%，比原 位氮饥饿工艺提高了近72%，比未经过氮饥饿处 理的旧工艺提高了近200% 。
1.3 pH对谷氨酰胺发酵的影响
pH主要影响酶的活性 和菌的代谢
在中性和微碱性条件 下（PH7.0-8.0）积 累谷氨酸，在酸性条 件下积累谷氨酰胺
• 发酵前期应控制pH值在偏碱性环境，以促进菌体 生长，并激活谷氨酸合成酶的活性，保证谷氨酰 胺合成前体谷氨酸的合成； • 发酵后期应控制pH值在偏酸性环境，以增加谷氨 酰胺合成酶的活性，同时抑制谷氨酰胺酶的活性 ，使谷氨酰胺大量积累生成，而减少谷氨酸的生 成量。
• 中村纯等人通过敲除细菌染色体上的谷氨 酸合酶基因的方法降低细胞内谷氨酸合酶 活性,来减少谷氨酰胺的分解; • 通过增加编码谷氨酰胺合成酶基因的拷贝 数和修饰编码谷氨酰胺合成酶基因的翻译 控制区,来增强谷氨酰胺合成酶基因的表达, 促使菌体内积累更多的谷氨酰胺。
• 郑强等进行glnA基因的克隆与过量表达，利用谷 氨酸棒杆菌发酵过程产生的谷氨酸为底物，在 glnA基因表达的GS酶的催化下，诱导后的重组 茵发酵液中的L-谷氨酰胺产量提高了1.8倍，培 养基质中的铵盐反应生成L-谷氨酰胺，理论上可 以节约添加谷氨酸的成本。
• （1）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，它受天冬氨酸的反馈抑 制； • （2）丙酮酸激酶，它是一个别构酶，受乙酰CoA、丙氨 酸、ATP的反馈抑制； • （3）丙酮酸脱氢酶系，该酶是催化不可逆反应的酶，受 乙酰CoA 、NADH、GTP的反馈抑制；
• （4）异柠檬酸脱氢酶，ADP和NADH 抑制此酶的活性； • （5）Glu脱氢酶和（6）GLn合成酶，此二酶是保证α-酮 戊二酸向GLu而不是向草酰乙酸的三羧酸循环方向的关键 。同时在此循环中还存在着向天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸 的分枝代谢，我们设法减弱分枝代谢而强化主流代谢，主 要的方法是减弱催化这些分枝代谢的酶。
• 陈奎发等设计了在线氮饥饿处理的发酵过程；在 限制初始氮源浓度的条件下，菌体在生长后期自 然进入氮饥饿状态，GS酶表达量增加，此后再提 供充足的铵盐，提高L-Gln的合成能力，结果使LGln的产量提高了69％，达到11.5 g／L，菌体内 谷氨酰胺合成酶活性提高了2倍以上。
1.2 金属离子
• 为了提高谷氨酰胺的产量，金属离子特别 是Zn2+、Mg2+和Mn2+的供给是必要的。 • Zn2+对谷氨酰胺合成酶具有刺激作用，同 时Zn2+还可增强NH4Cl对谷氨酰胺酶的抑制 作用，使其不能分解谷氨酰胺。
• Yamamoto等从腐臭假单胞菌 (Pseudomonas taetrolens)中克隆谷氨酰胺 合成酶基因Y-30，导入大肠杆菌中进行克 隆表达，其表达量是Pseudomonas taetrolens中的30倍。
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谷氨酰胺合成酶突变基因
• 谷氨酰胺合成酶／谷氨酸合酶(GS／GOGAT)体 系是由铵离子浓度调节的，在较低铵离子浓度下 发挥作用，在高铵离子浓度条件下受抑制。 • 谷氨酰胺合成酶的调节开关是在其肽链405位置 的酪氨酸被定点突变为苯丙氨酸，从而失去了这 种调节机制，使得谷氨酰胺合成酶可以在高铵离 子条件下发挥催化功能，将谷氨酸转化为谷氨酰 胺。
1.4 供氧对谷氨酰胺发酵的影响
• 氨基酸发酵过程中，供氧不足会积累乳酸 等副产物，菌体减少。 • 通过通气搅拌增加溶氧量。
生产谷氨酰胺条件
影响细胞 膜通透性
二 代谢途径调控
天津短杆菌株合成谷 氨酰胺的主流代谢中， 有几个关键酶控制其 强度，这几个酶分别 受不同代谢物的反馈 调节，活化这些酶有 利于L-GLn的生物合 成。
生物合成途径中关键酶的调控
• 陈国强等人重组了一株含有透颤菌血红蛋白基 因vgb和谷氨酰胺合成酶突变基因glnA’的野 生谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC14067， 可以实现在较低溶氧量水平，较低成本下，生 产较高产量的谷氨酰胺。
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• vgb是编码细菌中血红素蛋白(VHb)的基因 ，VHb是以氧合态参与和氧有关的代谢，通 过将氧传递给呼吸链，而调节末端氧化酶 的活性，改变氧化磷酸化的效率，进而改 变低氧条件下的代谢途径，从分子水平上 提高重组菌对氧气的利用能力，为解决谷 氨酰胺大规模生产过程中要求高溶氧的问 题提供了一个想法。
谷氨酰胺合成机理
发酵条件的变更，谷氨 酸产生菌中的谷氨酰胺 合成酶活力增加，而谷 氨酸合酶活力受到抑制 Text in here 由于细胞环境的影响， 谷氨酰胺易从细胞中分泌 出来积累在发酵液中， 而谷氨酸渗透性减小(滞 留在细胞内)
谷氨酰 胺积累
谷氨酸
谷氨酰胺
1 发酵条件控制
L-谷氨酰胺生物合成是在谷氨酰胺合 成酶(glutamine synthetase， GS)催 化下进行的，所以发酵法生产L-Gln的 关键在于调控GS酶活性。
谷氨酸 脱氢酶
NH4+浓度
谷氨酰 胺合成 酶
谷氨酸 合酶
GOGAT
Tesch在谷氨酸棒杆菌(CorynebaCterium glutamicum) 中研究了NH4+浓度对GDH、GS、GOGAT活性的影 响，结果如下： • NH4+浓度增加时，GDH活性基本没有发生变化； • NH4+浓度大于10mmol／L时，GS、GoGAT活性小 于1 mmol／L的10％，即分别低于110U／mg蛋白、 42U／mg蛋白； • 发现谷氨酸脱氢酶酶促反应是谷氨酸棒杆菌摄取 NH4+的第一步反应。此研究结果为梯度补氮生产LGln提供了理论基础。
谷氨酰胺的发酵控制 WEIBO.COM/JDPP T
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发酵条件控制 代谢途径调控
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右图是谷氨酰胺发 酵工艺图 L-谷氨酰胺是在谷 氨酸发酵工艺基础 上，在谷氨酰胺合 成酶作用下生产L谷氨酰胺。
谷氨酰胺
采用谷氨酸生产菌,可以实现谷氨酸发酵转向谷氨酰 胺发酵。发酵转换的条件是: 一、发酵培养基中有高浓度的铵盐存在,其含氮量比 谷氮酸发酵时所用的氮量多得多,在谷氨酰胺合成 酶的催化下,由谷氨酸进一步合成为谷氨酸胺； 二、菌体增殖进入平衡期后,发酵pH值必须调整到 6.0左右,以抑制谷氨酰胺酶的活力,避免谷氨酰胺被 分解成谷氨酸。