层析技术大实验ppt
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离子交换柱层析法分离氨基酸(共19张PPT)
管进行光波吸收测定（测定570nm波长的光吸收 将层析管与恒流泵，恒流泵与梯度混合器联接。
试管太多，建议大家进行水浴时使用铝制试管架或100mL烧杯水浴，使用橡皮筋绑试管时一捆不要太多，否则中间的管容易脱出摔裂。
值）。以光吸收值为纵坐标，以洗脱体积为横坐 调节恒流泵流速，定时收集流出液并测量流出液的体积，根据流出液体积与所需时间计算其流速，反复调整测量直到流速约为1mL/min。
全部加在某一局限部位。
注意：平衡、加样、洗脱时都不能冲破树 脂表面
加样示意图
6.洗脱并收集:
将体积均70mL（建议适量多加）离子强度为 与的两种缓冲溶液分别加入到梯度混合器的两个 烧杯中。其中的加入到直接输出溶液的那个池， 如图
将层析管与恒流泵，恒流泵与梯度混合器联接。
同时开始用部分收集器开始收集洗脱液，管×50。
3、装柱
干净的烧杯内装入大约20mL树脂和10mL蒸馏水。
将层析管用层析管架固定在铁架台上适当高度， 一个同学一手手同学控制洗瓶加水的速度以及水流出的速度
注意：
1、装柱过程不可中断，倒树脂要缓慢均匀
2、刚开始倒树脂时，水流出速度要控制到很 小，同时可以适当多加点水。最后一段加水和放 水都要慢，装柱过程中水面一定不能低于树脂， 但也不能溢出。
18cm
端倒 面好 高平 的 整层 ，析 无管 气 泡 ， 约
4．平衡：
将层析管与恒流泵联接，从烧杯中吸取钠 离子强度为的柠檬酸缓冲液平衡层析柱，流出 液达床体积的四倍以上时，用pH试纸测流出的 液体的pH，直到和缓冲液的pH一样时（即试管
内的pH和缓冲液一样）即可上样。在平衡同时 进行调速：
调节恒流泵流速，定时收集流出液并测量流 出液的体积，根据流出液体积与所需时间计算其
试管太多，建议大家进行水浴时使用铝制试管架或100mL烧杯水浴，使用橡皮筋绑试管时一捆不要太多，否则中间的管容易脱出摔裂。
值）。以光吸收值为纵坐标，以洗脱体积为横坐 调节恒流泵流速，定时收集流出液并测量流出液的体积，根据流出液体积与所需时间计算其流速，反复调整测量直到流速约为1mL/min。
全部加在某一局限部位。
注意：平衡、加样、洗脱时都不能冲破树 脂表面
加样示意图
6.洗脱并收集:
将体积均70mL（建议适量多加）离子强度为 与的两种缓冲溶液分别加入到梯度混合器的两个 烧杯中。其中的加入到直接输出溶液的那个池， 如图
将层析管与恒流泵，恒流泵与梯度混合器联接。
同时开始用部分收集器开始收集洗脱液，管×50。
3、装柱
干净的烧杯内装入大约20mL树脂和10mL蒸馏水。
将层析管用层析管架固定在铁架台上适当高度， 一个同学一手手同学控制洗瓶加水的速度以及水流出的速度
注意：
1、装柱过程不可中断，倒树脂要缓慢均匀
2、刚开始倒树脂时，水流出速度要控制到很 小，同时可以适当多加点水。最后一段加水和放 水都要慢，装柱过程中水面一定不能低于树脂， 但也不能溢出。
18cm
端倒 面好 高平 的 整层 ，析 无管 气 泡 ， 约
4．平衡：
将层析管与恒流泵联接，从烧杯中吸取钠 离子强度为的柠檬酸缓冲液平衡层析柱，流出 液达床体积的四倍以上时，用pH试纸测流出的 液体的pH，直到和缓冲液的pH一样时（即试管
内的pH和缓冲液一样）即可上样。在平衡同时 进行调速：
调节恒流泵流速，定时收集流出液并测量流 出液的体积，根据流出液体积与所需时间计算其
柱层析法的原理和方法ppt课件
实验案例讨论与经验分享
案例介绍
介绍几个典型的柱层析法应用案例，包括实验设 计、操作过程、结果分析等。
经验分享
分享实验过程中积累的操作技巧、注意事项、故 障排除等方面的经验。
互动交流
鼓励与会者提问、分享自己的实验经验和心得， 进行深入的讨论和交流。
总结与展望
06
柱层析法原理与方法的总结回顾
柱层析法原理
方法 调整流动相的组成和pH值
优化柱温和流速
参数优化的方法和原则
• 选择合适的色谱柱和填料
参数优化的方法和原则
原则 通过实验确定最佳参数组合
根据目标物质的性质和分离要求进行参数优化 注意避免参数变化过大，以免对分离效果造成不利影响
结果分析方法和技术
方法 峰面积和峰高比较法
标准曲线法
结果分析方法和技术
离、纯化和鉴定。
生物样品分析
柱层析法可用于生物样品中痕量 物质的分离和分析，如生物碱、 氨基酸等，提高分析的灵敏度和
准确性。
柱层析法在食品安全检测中的应用实例
01
农药残留检测
柱层析法可用于食品中农药残留的分离和检测，通过合适的填料和洗脱
条件，将农药与食品中的其他成分分离，提高检测的准确性和可靠性。
发展历程
自20世纪初开始，柱层析法逐渐从基础的实验室技术发展为高效、自动化的现 代分离分析方法。
柱层析法的重要性和应用
重要性
柱层析法在化学、生物、医药、环境等领域发挥着重要作用 ，为复杂混合物的分离和纯化提供了有效手段。
应用
药物研发、天然产物提取、环境监测、食品安全等领域广泛 应用柱层析法。
柱层析法的基本原理
实验操作和案例分
05
析
生物化学与分子生物学 课件实验六、凝胶层析-李婷
实验记录
• 项目、日期、室温 • 数据记录
管号 颜色 1-4 5 6 …
颜色度
实验报告
• 一、原理 • 二、操作 • 三、结果 画出蓝葡聚糖2000和DNFP-甘氨酸的洗 脱曲线。 • 四、讨论
★ 胶面不平，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降，
使表面平整。
▲ 加样与洗脱
1、加样：用滴管将约0.5ml样品加入柱床面，打开出口使样 品溶液渗入凝胶。 2、洗脱与收集：加入洗脱液，打开出口，保持流速 6滴/min，收集洗脱液，每管收集1ml 。 3、绘制洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，洗脱液的颜色度为 （-，+，++，+++）为纵坐标（相对指示洗脱液内物 质浓度的变化），作图，得到洗脱曲线。
凝胶层析（分子筛层析法） 分离物质
【实验目的】
1．熟悉层析技术概念，分类
2．掌握凝胶通透层析基本原理
3．掌握凝胶通透层析法的操作
凝胶层析原理
凝胶层析法是按混合物各组分分子量大小不同随 流动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。
凝胶层析法分离物质
• 在洗脱液的洗脱下，混合物中分子
量最大的物质最先出柱，分子量最
操作步骤：
▲ Sephadex G-50的准备 ▲ 装柱（18cm）
1、层析柱保持垂直。 2、放2ml蒸馏水，排沙芯下空气，关闭出口。 3、加入搅拌均匀的SephadexG-50悬液，调节流速10滴/min， 使凝胶均匀沉降，不断补充，直至18cm。 4、上留1-2mm的水，关闭出口。
注意：★ 床面上要保持少许水，防止胶床露出液面。
▲ 凝胶的再生
不断加洗脱液，使样品全部流出，为下次实验做准备
洗脱
②上样
层析法-理论ppt课件
方法：
(1) oligo(dT)-纤维素层 析柱法
(2) oligo(dT)-纤维素液 相结合离心法
(3)磁珠分离法
oligo(dT)-纤维素层析柱法
磁 珠 分 离 法
配体与载体结合
(固相化)
亲和层析
装柱
的基本过程
(亲和层析柱)
解吸附 洗柱
亲和吸附
(生物高分子与配体专一结合)
配体与载体的联接方法
固定相——滤纸上的吸附水 流动相——溶剂(乙醇、丙醇、丙酮及与水不相溶
的溶剂)
分离示意图
层 析 纸
层析缸
溶剂前沿
y x2
x1 起始线
(原点)
展开剂
Rf > 0.02 ，A 、B可分离. 与标样比较可定性鉴定
. 如果两种氨基酸的迁移速率相近，
或者氨基酸的Rf值相同，如何来分
离？
氨基酸的Rf值
展开剂 正丁醇+吡啶+水
名称
分离原理
固定相只能与一种待分离
亲和层析法 组份专一结合，以此和无 亲和力的其它组份分离
层析法的分类
• 按操作形式不同分类
名称
操作形式
柱层析法 固定相装于柱内，使样品沿着 一个方向前移而达分离
纸层析法 用滤纸作液体的载体，点样后 用流动相展开，使各组份分离
将适当的高分子有机吸附剂制成 薄膜层析法 薄膜，以类似纸层析方法进行物
加入样品 层析后
实验：胡萝卜的 柱层析分离法
柱层析示意图
薄层吸附层析
( Thin layer absorption chromatography)
薄层吸附层析是将吸附剂 均匀地在玻璃板上铺成薄层， 再把样品点在薄层板上，点样 的位置靠近板的一端。然后将 板的这端浸入适当的溶剂(流 动相)中，使溶剂在薄层板上 扩散，并在此过程中通过吸附 →解吸→再吸附→再解吸的反 复进行，而将样品各个组分分 离出来。
实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质ppt课件
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
教学目标:
❖了解：
1. 层析技术的基本原理。 2. 有效分配系数Kav的计算。
❖理解：
葡聚糖凝胶的选择和准备。
❖掌握：
1. 凝胶层析的原理和操作方法。 2. 有效分配系数Kav的意义。
❖ 较小的分子则可以渗透进入凝胶颗粒内 部，然后再扩散出来，经历的流程长， 流动速度慢，后流出。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
凝胶层析的数理关系
外水体积Vo 凝胶体积Vg
四、样品收集
1. 样品一旦加入柱床面后马上用 烧杯收集流出液，（注意柱床上 要不断加水，保持1cm高水层） 直到两种蛋白全部洗脱。
2. 倒出凝胶，清洗层析柱。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
使用教材：
《生物化学与分子生物学实验技术》，杨安钢主 编，高等教育出版社，2008年第1版
参考资料：
《生物化学》，贾弘褆主编，人卫出版社，2005 年第1版
推荐网站：
1. 第三军医大学生物化学与分子生物学教研室： http://192.168.4.133:8002/
2. 美国国立生物技术信息中心：
☻葡聚糖凝胶（Sephadex）
G型（G-X: X数字代表 LH型交联度与吸水量）
☻聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）
教学目标:
❖了解：
1. 层析技术的基本原理。 2. 有效分配系数Kav的计算。
❖理解：
葡聚糖凝胶的选择和准备。
❖掌握：
1. 凝胶层析的原理和操作方法。 2. 有效分配系数Kav的意义。
❖ 较小的分子则可以渗透进入凝胶颗粒内 部，然后再扩散出来，经历的流程长， 流动速度慢，后流出。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
凝胶层析的数理关系
外水体积Vo 凝胶体积Vg
四、样品收集
1. 样品一旦加入柱床面后马上用 烧杯收集流出液，（注意柱床上 要不断加水，保持1cm高水层） 直到两种蛋白全部洗脱。
2. 倒出凝胶，清洗层析柱。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
使用教材：
《生物化学与分子生物学实验技术》，杨安钢主 编，高等教育出版社，2008年第1版
参考资料：
《生物化学》，贾弘褆主编，人卫出版社，2005 年第1版
推荐网站：
1. 第三军医大学生物化学与分子生物学教研室： http://192.168.4.133:8002/
2. 美国国立生物技术信息中心：
☻葡聚糖凝胶（Sephadex）
G型（G-X: X数字代表 LH型交联度与吸水量）
☻聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）
硅胶柱层析技术(共32张PPT)
▪ 极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统 ①干法：将吸附剂一次加入色谱管，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入开始层析时使用的流动相，或将色谱管下端出口加活
塞，加入适量的流动相，旋开活塞使流动相缓缓滴出，然后自管顶缓缓加入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附
层柱。子可以分为：加压，常▪ 压，极减压性。较大的用甲醇：氯仿系统
匀浆法
1、称量
200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量 的 硅 胶 H 。 干 硅 胶 的 视 密 度 在 左 右 ， 所 以 要 称 40g 硅 胶 ， 用 烧 杯 量 100ml也可以。
2、搅成匀浆
加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/ 乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就 用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸 乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸 钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸 敏感，不能用氯仿体系过柱。
②加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗 剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼 缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可 过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。
③常压柱色谱，又称柱层析，是色谱法中最常见的一种。它的突出优点 是，分离效率比经典的化学分离方法高的多，与其他色谱法相比，不 需要昂贵的仪器设备，更换流动相和吸附剂方便，消耗材料少，成本 低，适合分离取样量从克到微克级范围很宽的各种样品，因此在化学 实验室中至今仍被广泛应用。
4.2 展开 展开剂选择
选择展开剂时,可采用微量圆环法和小型色谱法进行选择.
塞，加入适量的流动相，旋开活塞使流动相缓缓滴出，然后自管顶缓缓加入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附
层柱。子可以分为：加压，常▪ 压，极减压性。较大的用甲醇：氯仿系统
匀浆法
1、称量
200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量 的 硅 胶 H 。 干 硅 胶 的 视 密 度 在 左 右 ， 所 以 要 称 40g 硅 胶 ， 用 烧 杯 量 100ml也可以。
2、搅成匀浆
加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/ 乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就 用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸 乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸 钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸 敏感，不能用氯仿体系过柱。
②加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗 剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼 缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可 过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。
③常压柱色谱，又称柱层析，是色谱法中最常见的一种。它的突出优点 是，分离效率比经典的化学分离方法高的多，与其他色谱法相比，不 需要昂贵的仪器设备，更换流动相和吸附剂方便，消耗材料少，成本 低，适合分离取样量从克到微克级范围很宽的各种样品，因此在化学 实验室中至今仍被广泛应用。
4.2 展开 展开剂选择
选择展开剂时,可采用微量圆环法和小型色谱法进行选择.
纸层析 PPT课件
毛细现象
P8 检索咨询
具有细微缝隙的物质或直径很小的 细管(称毛细管)与液体接触时，液体沿 细缝或毛细管上升的现象称毛细现象。
毛细现象是物质分子间作用力的结 果，常见的纸张或毛巾吸水都是毛细现 象。
色谱分析法
色谱分析法是一种常用的物质分离分析方法， 常用于分离结构相近、物理性质和化学性质相 似物质。
CuSO4溶液
FeCl3溶液
溶液颜色
蓝色
棕黄色
加氢氧化钠
显色反应
蓝色沉淀
与过量氨水生成 深蓝色溶液
红褐色沉淀
与氨水生成红褐色沉淀 与KSCN生成血红色溶液
如何分离CuCl2与FeCl3混合溶液？
知识预备 纸层析法
原理：利用待分离混合物中各组分在某一物质（固定相） 中的亲和性的差异（吸附性差异、溶解性差异），让混 合物溶液（流动相）流经固定相，使混合物在流动相和 固定相之间进行反复吸附和分配等作用，从而使混合物 中各组分分离
验现象，描述Fe3+和Cu2+得到分离的原因。
纸层析法
柱层析法
薄层色谱法
柱层析法
二、操作方法
1、配制试样溶液
2、裁纸
1.5cm×20cm
3、画原点 离滤纸末端约2cm处用铅笔
4、点样
用毛细管取样品溶液，轻轻点样 于原点上，晾干，重复3～5次。 斑点直径需<0.5cm
5、取展开剂 不能粘到试管壁上
6、展开 滤纸不可触及试管的内壁，纸
条末端浸入展开剂约0.5cm,不
Cu 2+ +2NH3 .H2O
Cu（OH）2 +2 NH4 +
Cu（OH）2 + 4NH3 . H2O
层析填料的选择及其装柱技术介绍幻灯片
一、基质的选择
理想的基质应符合下面的要求： 1．极低的非特异性吸附。 2．高度的亲水性。 3．较好的理化稳定性。 4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合。 5．适当的多孔性。
一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联 葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。
常用亲和吸附剂采用的基质
反相层析填料的选择原则
考虑样品组分的种类和性质、分离的规模及对分辨率 的要求、流动相条件：
待分离物分子量，对介质孔径的选择提供指导； 样品组分的疏水性质决定采用何种配基； 分离的规模及对分辨率的要求也是须考虑的因素，通
常分离规模和分辨率的关系是负相关的 ； 反相层析时的流动相条件很大程度上影响反相介质基
层析填料的选择 及装柱技术介绍
佳辰公司生物中心 陈阶
2012-04-18
如何选择填料？
一、依据所纯化的对象的各物理和化学特性。
（一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、 核酸等）
二、纯化所要达到的目的（粗提？中度纯化？ 精细纯化？）。
三、所要选择的层析方法
1. 凝胶过滤 ( Gf)
易脱落。 4) 配体自身应具有较好的稳定性。
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为 两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体 （general ligand）
亲和吸附介质的配基
（1）酶的抑制剂 （2）抗体 （3）A蛋白 A蛋白（protein A）为分子量约42KD的蛋白质，
Sephadex LH-20 同时具备亲水和亲脂双重性质， 且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作 用。
Pharmadex LH-20同时适用于分子类别非常相似 的物质的分离和工业规模的制备，既可用于初 步纯化步骤，也可用于最终精制步骤，如非对 映同分异构体的分离。
理想的基质应符合下面的要求： 1．极低的非特异性吸附。 2．高度的亲水性。 3．较好的理化稳定性。 4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合。 5．适当的多孔性。
一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联 葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。
常用亲和吸附剂采用的基质
反相层析填料的选择原则
考虑样品组分的种类和性质、分离的规模及对分辨率 的要求、流动相条件：
待分离物分子量，对介质孔径的选择提供指导； 样品组分的疏水性质决定采用何种配基； 分离的规模及对分辨率的要求也是须考虑的因素，通
常分离规模和分辨率的关系是负相关的 ； 反相层析时的流动相条件很大程度上影响反相介质基
层析填料的选择 及装柱技术介绍
佳辰公司生物中心 陈阶
2012-04-18
如何选择填料？
一、依据所纯化的对象的各物理和化学特性。
（一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、 核酸等）
二、纯化所要达到的目的（粗提？中度纯化？ 精细纯化？）。
三、所要选择的层析方法
1. 凝胶过滤 ( Gf)
易脱落。 4) 配体自身应具有较好的稳定性。
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为 两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体 （general ligand）
亲和吸附介质的配基
（1）酶的抑制剂 （2）抗体 （3）A蛋白 A蛋白（protein A）为分子量约42KD的蛋白质，
Sephadex LH-20 同时具备亲水和亲脂双重性质， 且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作 用。
Pharmadex LH-20同时适用于分子类别非常相似 的物质的分离和工业规模的制备，既可用于初 步纯化步骤，也可用于最终精制步骤，如非对 映同分异构体的分离。
第09章疏水层析ppt课件
33
Water molecules
Hydrophobic ligand
Sample application
1. Equilibration
2. Sample application
3. Washing 4. Elution
Hydroptrix
Proteins
Washing out unbound material
R代表疏水配基，M代表基质。调节两种反 应物的比例可控制介质的配基密度
偶联至基质的常见配基类型
（A）丁基 （B）辛基 （C）苯基 （D）新戊基
对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力 太强，洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具 中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙三醇等) 不仅可提供足够的结合力，且避免了上述缺点。
工作pH范围为3-13,清洗pH范围为2-14,工作 的最大速度是600cm/h,配基结合量为每 ml50μmol正辛烷基，疏水性中等，适合各种蛋 白的分离和纯化。
⒊ Phenyl Sepharose 6 Fast Flow
工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14， 工作的最大速度是600cm/h配基结合量为每ml 40 μmol苯基Phenyl，疏水性最强，载量高， 适合含芳香族配体的生物分子的预处理，
▪ 硫酸钠是一种非常好的盐析试剂，但是在 高浓度下，蛋白稳定性的问题可能会阻碍 它的应用。
图22 不同盐对选择性的影响：按顺序增大洗脱体积洗脱： 细胞色素C、溶菌酶、核糖核酸酶A、α-糜蛋白酶原。
▪ 如果目的分子洗脱得太晚或根本不洗脱， 或者不能更换到不同的填料，尝试使用50% 的盐浓度结合。
▪ 有些蛋白在高盐浓度下开始沉淀。起始缓 冲液中的盐浓度需要降低以避免在运行中 的沉淀。重复的以小量上样也能帮助避免 由于沉淀引起的产量丢失。
Water molecules
Hydrophobic ligand
Sample application
1. Equilibration
2. Sample application
3. Washing 4. Elution
Hydroptrix
Proteins
Washing out unbound material
R代表疏水配基，M代表基质。调节两种反 应物的比例可控制介质的配基密度
偶联至基质的常见配基类型
（A）丁基 （B）辛基 （C）苯基 （D）新戊基
对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力 太强，洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具 中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙三醇等) 不仅可提供足够的结合力，且避免了上述缺点。
工作pH范围为3-13,清洗pH范围为2-14,工作 的最大速度是600cm/h,配基结合量为每 ml50μmol正辛烷基，疏水性中等，适合各种蛋 白的分离和纯化。
⒊ Phenyl Sepharose 6 Fast Flow
工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14， 工作的最大速度是600cm/h配基结合量为每ml 40 μmol苯基Phenyl，疏水性最强，载量高， 适合含芳香族配体的生物分子的预处理，
▪ 硫酸钠是一种非常好的盐析试剂，但是在 高浓度下，蛋白稳定性的问题可能会阻碍 它的应用。
图22 不同盐对选择性的影响：按顺序增大洗脱体积洗脱： 细胞色素C、溶菌酶、核糖核酸酶A、α-糜蛋白酶原。
▪ 如果目的分子洗脱得太晚或根本不洗脱， 或者不能更换到不同的填料，尝试使用50% 的盐浓度结合。
▪ 有些蛋白在高盐浓度下开始沉淀。起始缓 冲液中的盐浓度需要降低以避免在运行中 的沉淀。重复的以小量上样也能帮助避免 由于沉淀引起的产量丢失。
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Vt（πr2h或者Vo ＋ Vi） Vo（蓝色葡聚糖2000测定，分子质量200万） Ve（洗脱体积） Kav=－b lgM＋c 在同一凝胶柱上分离多种已知分子量的蛋白质，根 据上述线性关系绘制标准曲线（以Kav 值为横坐标 ，以lgM 为纵坐标，绘制标准曲线。） 测出未知蛋白的Kav 值，求得该蛋白的分子质量
2008 作者：蒋华云 南京师范大学 22
葡聚糖凝胶（LH型）
Sephadex G-25和G-50中分别加入羟丙 基基团反应，形成LH型烷基化葡聚糖凝胶 。
例：Sephadex LH-20
LH型葡聚糖凝胶与G型葡聚糖凝胶相比较
葡聚糖凝胶过滤层析（G型） 葡聚糖凝胶渗透层析（LH型）
LH型葡聚糖凝胶适用于分离脂溶性物质，
4.3 离子交换层析
基本原理 离子交换剂的种类和性质 离子交换层析操作的具体问题 离子交换层析的应用
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2008 作者：蒋华云 南京师范大学 16
4.4 亲和层析
基本原理 亲和吸附剂的种类和性质 亲和层析操作的具体问题 亲和层析的应用
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2008 作者：蒋华云 南京师范大学 17
凝胶层析基本原理
M/Da 12400 13700 24000 45000 67000
lgM 4.0934 4.1367 4.3802 4.6532 4.8261
31
作者：蒋华云 南京师范大学
蛋白质的lgM与其Kav值的线性关 系
例：胆固醇、脂肪酸激素等。
2008 作者：蒋华云 南京师范大学 23
葡聚糖凝胶Sephacryl
Sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖与甲叉双丙烯 酰胺（N, N’-methylene bisacrylamide）交 联而成，是一种硬性凝胶。 Sephacryl与Sephadex相比有很多优点
化学和机械稳定性更高 耐高温 稳定工作的pH一般为2～11 机械性能较好，比较耐压，可以用较高的流速洗脱 ，分辨率也较高 分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108，远远 大于Sephadex的范围
凝胶的再生和保存
再生：洗涤后重新平衡或按预处理的方法处理后重新装柱 保存：短时间加抗菌剂，长时间脱水干燥保存
2008
作者：蒋华云 南京师范大学
27
凝胶层析操作的具体问题
洗脱液的选择
一般来说，洗脱液的选择只要能溶解被洗脱物质并 不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。为了防 止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓 度的盐。
加样量（1~5％组分分离/10~25%组别分离）
一般组分分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1～5 ％左右，而组别分离时约为凝胶柱床体积的10～25 ％
洗脱速度
影响因素：柱子的长度、凝胶的型号、凝胶的粒度
2008 作者：蒋华云 南京师范大学
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28
凝胶层析的应用
生物大分子的纯化
优点：不改变样品生物学活性
以具有立体网状结构的球 形惰性凝胶颗粒为固定相 ，颗粒的表面和内部形成 很多孔穴，且孔穴直径较 一致，若样品中各组分的 分子大小不同，样品进入 凝胶层析柱后，各个组分 向凝胶颗粒的孔穴内扩散 ，能否进入孔穴内部取决 于孔穴的大小和组分分子 的大小。
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2008 作者：蒋华云 南京师范大学 18
凝胶层析基本原理
流动相
在层析过程中，推动固定相上待分离的物质向一定方向移动的液 体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱 剂，薄层层析时称为展层剂。
分配系数
在一定的条件下，某一组分在固定相和流动相中含量（浓度）的 比值，常用K来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的重要依据 。
2008 作者：蒋华云 南京师范大学 5
床体积（Vt）total volume 外水体积（Vo）out volume 内水体积（Vi）inner volume 基质体积（Vg）gel volume
2008 作者：蒋体积（Ve）elution volume
指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最 大值时的流动相体积。
生物化学与分子生物学大实验
——技术理论部分
层析技术
2008
作者：蒋华云 南京师范大学
2
第四章 层析技术
4.1 层析技术概述 4.2 凝胶层析 4.3 离子交换层析 4.4 亲和层析
9学时
2008
作者：蒋华云 南京师范大学
3
4.1 层析技术概述
层析法，又称层离法或色谱法（ Chromatography） （历史） 层析的两个重要理论
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凝胶层析操作的具体问题
凝胶的选择（排阻极限、粒度）
组别分离是指分离那些相对分子质量之间相差很大的样品 组分分离则是指分离那些相对分子质量之间相差较小的样品 粒度就是凝胶颗粒的大小，而与交联度无关
凝胶的预处理（溶胀、脱气）
计算干胶用量：干胶用量（g）＝柱床体积（mL）/膨胀度（ mL/g） 脱气：抽气、加热煮沸（必须避免在酸或碱中加热）
）
2008
作者：蒋华云 南京师范大学
20
2008
作者：蒋华云 南京师范大学
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21
葡聚糖凝胶（ G型）
葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex G系列， 它是葡聚糖与3－氯－1,2环氧丙烷（交联剂） 以醚键相互交联而成。
例：Sephadex G-75
分级分离 吸水率 排阻极限
指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量 例： Sephadex G-50的排阻极限为30,000
平衡
平衡液体积一般为2～3倍柱床体积，以保证平衡后柱子符合 填充均匀、松紧一致和没有气泡的标准。如果需要，可用兰色 葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是 均匀的。
2008
作者：蒋华云 南京师范大学
12
柱层析的基本操作
加样
一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。 通常加样量应少于20%的操作容量，加样体积 应低于5%的床体积。对于分析性柱层析，加样 体积不超过床体积的1%。
分辨率是用来判断相邻两组分在层析柱内的分离情况的，是指相 邻两个峰的分开程度，可以用两个层析峰保留值之差与两峰底宽 的平均值之比表示。用Rs来表示。
2008
作者：蒋华云 南京师范大学
6
层析的基本概念
正相色谱与反向色谱 操作容量（交换容量）
在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应达到平衡时，存 在于基质上的饱和容量，我们称为操作容量（或交换容量）。
层析的基本概念
迁移率（或比移值）
在一定条件下，某一组分在相同的时间内，在固定相移动的距离 与流动相本身移动的距离之比值，常用Rf来表示。
相对迁移率
在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离 与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。它可以小于等于1 ，也可以大于1。用Rx来表示。
分辨率（或分离度）
分配系数Kav
Ve − Vo K av = Vt − Vo
2008
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19
凝胶的种类和性质
凝胶的种类和性质
葡聚糖凝胶（dextran）（常见的两大类，商品名分别为 Sephadex（G型和LH型）和Sephacryl ） 聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide）（商品名为Bio-Gel P ） 琼脂糖凝胶（agarose）（瑞典的Sepharose系列、美国的 Bio-gel A系列、英国的Sagavac系列、丹麦的Gelarose系 列和我国的QT系列等 ） 聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶（Ultrol Gel AcA34 多孔玻璃珠、多孔硅胶
洗脱
简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱 洗脱液的流速
2008
作者：蒋华云 南京师范大学
13
柱层析的基本操作
收集、检测、合并及保存
洗脱下来的流出液用部分收集器来收集。 根据检测结果绘制洗脱曲线：以管号、洗脱体积或 者洗脱时间为横坐标，以每管溶液中样品的浓度或 活性为纵坐标。 合并前的鉴定 冻干低温保存
柱子的再生
2008 作者：蒋华云 南京师范大学 30
Kav值与蛋白质分子量之间存在线性关系
几种蛋白质的Kav值
名称 细胞色素C 核糖核酸酶 胰蛋白酶 卵清白蛋白 血清白蛋白单体
2008
Ve-Vo 105.2 120 85 47.4 20.4
Vt- Vo 150.8 164.7 167 148.1 167
Kav 0.70 0.66 0.51 0.32 0.22
死时间（t0）及死体积（V0） 保留时间（tR）及保留体积（VR）
2008
作者：蒋华云 南京师范大学
8
层析法的分类
根据固定相基质的形式分类
纸层析、薄层层析和柱层析
根据流动相的形式分类
液相层析、气相层析和超临界层析
根据分离的原理不同分类
吸附层析 分配层析 凝胶层析 离子交换层析 亲和层析
2008
作者：蒋华云 南京师范大学
例：Bio-Gel P-300，排阻极限为3×105
聚丙烯酰胺凝胶与Sephadex相比
在酸中的稳定性比Sephadex好，在pH为1～10之 间比较稳定 在较强的碱性或较高的温度条件下不如Sephadex 稳定 不长微生物
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琼脂糖凝胶
琼脂糖是由D－半乳糖（D-galactose）和3,6－脱水 半乳糖（anhydrogalactose）交替构成的链状多糖。 它在100 °C时呈液态，当温度降至45 °C以下时，多糖 链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖，经凝聚 即成为束状的琼脂糖凝胶。
2008
作者：蒋华云 南京师范大学
10
柱层析的基本装置
基本装置（Biologic LP system）
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葡聚糖凝胶（LH型）
Sephadex G-25和G-50中分别加入羟丙 基基团反应，形成LH型烷基化葡聚糖凝胶 。
例：Sephadex LH-20
LH型葡聚糖凝胶与G型葡聚糖凝胶相比较
葡聚糖凝胶过滤层析（G型） 葡聚糖凝胶渗透层析（LH型）
LH型葡聚糖凝胶适用于分离脂溶性物质，
4.3 离子交换层析
基本原理 离子交换剂的种类和性质 离子交换层析操作的具体问题 离子交换层析的应用
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4.4 亲和层析
基本原理 亲和吸附剂的种类和性质 亲和层析操作的具体问题 亲和层析的应用
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凝胶层析基本原理
M/Da 12400 13700 24000 45000 67000
lgM 4.0934 4.1367 4.3802 4.6532 4.8261
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蛋白质的lgM与其Kav值的线性关 系
例：胆固醇、脂肪酸激素等。
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葡聚糖凝胶Sephacryl
Sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖与甲叉双丙烯 酰胺（N, N’-methylene bisacrylamide）交 联而成，是一种硬性凝胶。 Sephacryl与Sephadex相比有很多优点
化学和机械稳定性更高 耐高温 稳定工作的pH一般为2～11 机械性能较好，比较耐压，可以用较高的流速洗脱 ，分辨率也较高 分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108，远远 大于Sephadex的范围
凝胶的再生和保存
再生：洗涤后重新平衡或按预处理的方法处理后重新装柱 保存：短时间加抗菌剂，长时间脱水干燥保存
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凝胶层析操作的具体问题
洗脱液的选择
一般来说，洗脱液的选择只要能溶解被洗脱物质并 不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。为了防 止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓 度的盐。
加样量（1~5％组分分离/10~25%组别分离）
一般组分分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1～5 ％左右，而组别分离时约为凝胶柱床体积的10～25 ％
洗脱速度
影响因素：柱子的长度、凝胶的型号、凝胶的粒度
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凝胶层析的应用
生物大分子的纯化
优点：不改变样品生物学活性
以具有立体网状结构的球 形惰性凝胶颗粒为固定相 ，颗粒的表面和内部形成 很多孔穴，且孔穴直径较 一致，若样品中各组分的 分子大小不同，样品进入 凝胶层析柱后，各个组分 向凝胶颗粒的孔穴内扩散 ，能否进入孔穴内部取决 于孔穴的大小和组分分子 的大小。
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凝胶层析基本原理
流动相
在层析过程中，推动固定相上待分离的物质向一定方向移动的液 体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱 剂，薄层层析时称为展层剂。
分配系数
在一定的条件下，某一组分在固定相和流动相中含量（浓度）的 比值，常用K来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的重要依据 。
2008 作者：蒋华云 南京师范大学 5
床体积（Vt）total volume 外水体积（Vo）out volume 内水体积（Vi）inner volume 基质体积（Vg）gel volume
2008 作者：蒋体积（Ve）elution volume
指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最 大值时的流动相体积。
生物化学与分子生物学大实验
——技术理论部分
层析技术
2008
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2
第四章 层析技术
4.1 层析技术概述 4.2 凝胶层析 4.3 离子交换层析 4.4 亲和层析
9学时
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4.1 层析技术概述
层析法，又称层离法或色谱法（ Chromatography） （历史） 层析的两个重要理论
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凝胶层析操作的具体问题
凝胶的选择（排阻极限、粒度）
组别分离是指分离那些相对分子质量之间相差很大的样品 组分分离则是指分离那些相对分子质量之间相差较小的样品 粒度就是凝胶颗粒的大小，而与交联度无关
凝胶的预处理（溶胀、脱气）
计算干胶用量：干胶用量（g）＝柱床体积（mL）/膨胀度（ mL/g） 脱气：抽气、加热煮沸（必须避免在酸或碱中加热）
）
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葡聚糖凝胶（ G型）
葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex G系列， 它是葡聚糖与3－氯－1,2环氧丙烷（交联剂） 以醚键相互交联而成。
例：Sephadex G-75
分级分离 吸水率 排阻极限
指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量 例： Sephadex G-50的排阻极限为30,000
平衡
平衡液体积一般为2～3倍柱床体积，以保证平衡后柱子符合 填充均匀、松紧一致和没有气泡的标准。如果需要，可用兰色 葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是 均匀的。
2008
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12
柱层析的基本操作
加样
一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。 通常加样量应少于20%的操作容量，加样体积 应低于5%的床体积。对于分析性柱层析，加样 体积不超过床体积的1%。
分辨率是用来判断相邻两组分在层析柱内的分离情况的，是指相 邻两个峰的分开程度，可以用两个层析峰保留值之差与两峰底宽 的平均值之比表示。用Rs来表示。
2008
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6
层析的基本概念
正相色谱与反向色谱 操作容量（交换容量）
在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应达到平衡时，存 在于基质上的饱和容量，我们称为操作容量（或交换容量）。
层析的基本概念
迁移率（或比移值）
在一定条件下，某一组分在相同的时间内，在固定相移动的距离 与流动相本身移动的距离之比值，常用Rf来表示。
相对迁移率
在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离 与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。它可以小于等于1 ，也可以大于1。用Rx来表示。
分辨率（或分离度）
分配系数Kav
Ve − Vo K av = Vt − Vo
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凝胶的种类和性质
凝胶的种类和性质
葡聚糖凝胶（dextran）（常见的两大类，商品名分别为 Sephadex（G型和LH型）和Sephacryl ） 聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide）（商品名为Bio-Gel P ） 琼脂糖凝胶（agarose）（瑞典的Sepharose系列、美国的 Bio-gel A系列、英国的Sagavac系列、丹麦的Gelarose系 列和我国的QT系列等 ） 聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶（Ultrol Gel AcA34 多孔玻璃珠、多孔硅胶
洗脱
简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱 洗脱液的流速
2008
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柱层析的基本操作
收集、检测、合并及保存
洗脱下来的流出液用部分收集器来收集。 根据检测结果绘制洗脱曲线：以管号、洗脱体积或 者洗脱时间为横坐标，以每管溶液中样品的浓度或 活性为纵坐标。 合并前的鉴定 冻干低温保存
柱子的再生
2008 作者：蒋华云 南京师范大学 30
Kav值与蛋白质分子量之间存在线性关系
几种蛋白质的Kav值
名称 细胞色素C 核糖核酸酶 胰蛋白酶 卵清白蛋白 血清白蛋白单体
2008
Ve-Vo 105.2 120 85 47.4 20.4
Vt- Vo 150.8 164.7 167 148.1 167
Kav 0.70 0.66 0.51 0.32 0.22
死时间（t0）及死体积（V0） 保留时间（tR）及保留体积（VR）
2008
作者：蒋华云 南京师范大学
8
层析法的分类
根据固定相基质的形式分类
纸层析、薄层层析和柱层析
根据流动相的形式分类
液相层析、气相层析和超临界层析
根据分离的原理不同分类
吸附层析 分配层析 凝胶层析 离子交换层析 亲和层析
2008
作者：蒋华云 南京师范大学
例：Bio-Gel P-300，排阻极限为3×105
聚丙烯酰胺凝胶与Sephadex相比
在酸中的稳定性比Sephadex好，在pH为1～10之 间比较稳定 在较强的碱性或较高的温度条件下不如Sephadex 稳定 不长微生物
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琼脂糖凝胶
琼脂糖是由D－半乳糖（D-galactose）和3,6－脱水 半乳糖（anhydrogalactose）交替构成的链状多糖。 它在100 °C时呈液态，当温度降至45 °C以下时，多糖 链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖，经凝聚 即成为束状的琼脂糖凝胶。
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柱层析的基本装置
基本装置（Biologic LP system）