实验六 印记基因v1(1)

实验六印记基因

一．实验目的

学习印记基因的鉴定方法。

二．实验原理

（一）背景知识

基因组印记是指组织或细胞中，基因的表达具有亲本选择性的现象，即只有一个亲本的等位基因表达，而另一亲本的等位基因不表达或很少表达，相应的基因则称为印记基因。只表达父本而不表达母本等位基因的印记基因称为母本印记基因；只表达母本而不表达父本等位基因的印记基因称为父本印记基因。

B830012L14Rik是一个非编码RNA基因，位于12号染色体上的印记基因簇中，目前该基因功能尚不明确。在该基因的第一外显子序列中存在一个SNP位点，在B6小鼠中该位点为A（AA），在ICR小鼠中则为碱G（GG）。而B6与ICR小鼠的子代杂交个体中则为AG。

若该基因非印记表达，则在子代个体的cDNA基因型为AG。而该基因若印记表达，则在子代杂合个体的cDNA基因型为OA或OG。通过对比父本或母本的基因型，便可判断该印记基因的表达模式。

（二）技术原理：

1. PCR

聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是一种分子生物学技术，用于体外扩增特定的DNA片段。

PCR技术主要过程是，通过人类合成的一小断单链DNA片段（叫做引物）与模板DNA特定的区域特异性结合，进而以四种dNTP为底物，通过DNA聚合酶沿着引物和模板形成的双链部分的3’端聚合形成DNA片段实现DNA体外扩增的过程。其中，最重要的是热稳定的DNA聚合酶，由于该酶在97度以上的高温也能保持稳定，所以我们可以通过94～97度这个温度范围内处理DNA形成单链，然后降温（根据引物不同而有差异，一般为50-55度）直至适量的引物结合到模板上。最后温度提升至72度，聚合酶聚合形成双链DNA。

表1. PCR体系组分及其作用

组分作用

DNA模板（template）含有需要扩增的DNA片断

2个引物（primer）决定了需要扩增的起始和终止位置

DNA聚合酶（polymerase）复制需要扩增的区域

脱氧核苷三磷酸（dNTP）是指4种脱氧核糖核酸，用于构造新的互补链缓冲体系提供适合聚合酶行使功能的化学环境

H2O 为了保持各个组分的浓度，在体系中加水稀释

注：部分品牌缓冲液不含有Mg2+，那么还需要添加对应浓度的Mg2+。酶请最后加入，水请最先加入。

PCR步骤包括DNA变性、退火、延伸三个步骤。

（1）DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

（2）退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

（3）延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。

PCR的循环参数

（1）预变性（Initial denaturation）

模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

（2）循环中的变性步骤

循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。

（3）引物退火（Primer annealing）

退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。

退火温度对PCR的特异性有较大影响。

（4）引物延伸

引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较

高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000 bp以上，含Pfu 及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。

（5）循环数

大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。

（6）最后延伸

在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

2. DNA纯化

DNA在离液序列高的高盐溶液中易于溶解，并能保持其稳定性。

50℃下，溶胶液中的盐溶液溶解含有DNA的琼脂糖凝胶，利用试剂盒中的硅质吸附柱在高盐缓冲系统下，专一吸附DNA分子，而凝胶则过柱弃掉。吸附DNA的硅质柱经漂洗液漂洗后，再用洗脱缓冲液过柱，将柱上吸附的DNA洗脱下来，即可用于后续实验。

乙醇可以竞争水化DNA的水分子，使得水分子与DNA之间的氢键断裂，DNA相互聚集形成沉淀，促使DNA吸附到硅质吸附柱上。

异丙醇可以代替乙醇，效果更好，所以当回收小片段DNA（≤500bp）时，向溶胶液中加入异丙醇，以提高小片段吸附硅质柱的效率，提高纯化回收效率。

三．实验材料试剂及仪器

正交：小鼠C57BL/6J♂×ICR♀杂交子代IBF1的组织DNA、脑组织cDNA及其母本ICR小鼠的组织DNA。

反交：小鼠ICR♂×C57BL/6J♀杂交子代BIF1的组织DNA、脑组织cDNA及其母本C57BL/6J小鼠的组织DNA。

Takara Taq酶，PCR缓冲液，dNTP（deoxy-ribonucleoside triphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸），灭菌的去离子水，无水乙醇，异丙醇，博大泰克胶回收试剂盒，琼脂糖，1×TE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），DL2000。

灭菌1.5ml离心管，灭菌的200ulPCR管，灭菌枪头（白色、黄色、蓝色），微量移液器（10ul，20ul，100ul，1000ul），离心管架，泡沫浮板，PE一次性手套，废物缸，200ml锥形瓶，制胶器。

小型台式离心机，微波炉，水平电泳槽，电泳仪，水浴锅（50℃）等。