高通量药物筛选模型031121

高通量药物筛选模型*

姚佳杨建波杨洁*

（南京大学生命科学院生物化学系，医药生物技术国家实验室，南京210093）

摘要：本文介绍了可用于药物筛选的三种新的快速高通量筛选方法，包括基于反酵母双杂交的筛选系统；细胞平台伤的高通量筛选系统以及动物水平的筛选系统。并对其应用原理，应用情况和有缺点进行了阐述。

关键词：高通量筛选（HTS），酵母双杂交，靶点，受体

Abstract:

This article mainly deals with three new dominant plat forms of HTS(High-Throughput Screen) which are fairly useful in drug screen——the reverse yeast two hybrid system, the cell-based screen and the animal platform, including their principles, their appliance and their advantages together with disadvantages.

Key Words: High-Throughput Screen, yeast two-hybrid system, target, receptor

学科分类号：Q7

药物筛选模型研究经历了三个不同的发展阶段：最初意义上的筛选方法、分子生物学筛选方法和高通量筛选方法，而每一个阶段都源于一种新技术的诞生。最初的药物筛选是直接利用动物组织或天然产物进行的，并不涉及到疾病发生的分子机制。在这样粗略的筛选系统中只有有限的样品得到筛选，而且大多数样品只是基于疾病表征而非靶点的筛选。因此，药物的发现会带有偶然性。1980年以来，随着有机化学和分子生物学的发展，更加系统化的筛选方法应用到药物研究与开发中。一方面，有机化学的飞速发展为筛选提供了庞大的人工合成小分子库；另一方面，分子生物学为筛选提供了靶蛋白。通过比较正常人群与疾病患者间在机体组织细胞分子上的差异以及阐明模型组织中相应蛋白质的功能，从而正确地选择、描述并确认某些靶蛋白，有助于更加理性地进行药物筛选，不足的是上述过程往往费时耗财。而基因组学的发展对这个问题提供了很好的解决方法，基因组学能够更加有效地验证潜在的靶蛋白,并通过功能基因组研究能够快速有效地确认与特定疾病有关的靶蛋白[ 1 ]。

*本课题为国家自然科学基金资助项目（项目编号30171094和30271497）。联系人：杨洁，南京大学生命科学学院，医药生物技术国家重点实验室，南京210093，中国；电话：86-25-3594060，传真：86-25-3324605；Email：luckyjyj@。

传统意义上的药物筛选方法一般包括精确定义某些具有选择性的靶蛋白、确定其中某些靶蛋白的生物学性质以及体外药物筛选[ 2 ]。而基于化学基因组学的药物筛选则包括从基因角度广泛地确定靶蛋白，对其中的大部分靶蛋白进行高通量的化合物筛选，对其中有希望的化合物进行生物活性检测。使用该方法的优势在于能够提供更多的靶蛋白数据以利于进行庞大的化合物库的筛选，从而能够提高活性化合物的发现几率。

由于组合化学和化学基因组学的迅猛发展，为药物筛选提供了大量的化合物库以及更多的靶点，这必然要求有高效快速的方法进行药物筛选，高通量筛选系统（High-Throughput Screen System，HTS）的出现给药物研究者提供了一个快捷的途径。目前高通量筛选技术呈多元化发展趋势，可在以下三种平台上进行，即酵母平台、细胞平台和动物平台。本文主要介绍这些模型的原理及其应用。

1 基于反酵母双杂交系统的药物筛选模型

酵母反双杂交系统是从酵母双杂交系统发展而来的新型药物筛选系统。酵母双杂交系统在研究蛋白----蛋白相互作用方面已经成为一种成熟有效的遗传学方法[ 3 ]。其理论依据是，许多序列特异性的转录因子通过结合到DNA上游激活序列（UAS）并在相应的启动子部位激活RNA聚合酶II从而提高靶基因底转录效率。DNA结合和激活功能定位于2个互相分离的结构域内，分别称为DNA结合结构域（DB）和DNA激活域（AD）。与转录因子无关的蛋白与蛋白间相互作用使得DB和AD在空间上相互接近，从而重组形成一个有功能的转录因子。因此，有功能转录因子的重组可以总结为DB－X和AD－Y，其中的X、Y可以是来自任何组织的蛋白质分子。将酵母生长标记例如LEU2或者HIS3（分别参与了亮氨酸和组氨酸的合成）置于含有DB结合位点的启动子控制下，则DB－X与AD－Y的相互作用会产生选择性生长优势，从而在缺乏特定氨基酸的培养基上呈现小的菌落[ 4 ]。据此可以确定大量蛋白间的相互作用。

反酵母双杂交是基于酵母双杂交基础上的一种新型的药物筛选方法。其理论基础与酵母双杂交基本相似，区别在于其报告基因不同，反酵母双杂交系统中只有在蛋白间相互作用被阻断时能够显示出选择性的生长优势。在反酵母双杂交模型中，野生型DB－X与AD －Y的相互作用将会导致对酵母细胞的细胞毒或者致死作用，因为在这个系统中报告基因是一些毒性标记基因例如URA3（负选择）[5]。在这个模型下，DB－X与AD－Y的彼此分离能够促成生长优势，从而能够很方便的验证一些相互作用缺陷型的等位基因或者一些阻断相互作用的小分子药物或者小肽（图1）[ 2 ]。

图1双杂交系统原理示意图。(a)--正向的双杂交系统(b)--反酵母双杂交筛选

目前已经有多例成功报道，例如利用反酵母双杂交系统从人工合成的小分子库中筛选出了一些具有钙离子通道阻断活性的小分子[6]。在这里，N型钙离子通道的两个亚基β3和α1B-I-II胞内loop被分别融合到反酵母双杂交系统中的Gal4 DB和Gal4 AD中。利用CYH2作为负选择筛选标记，该基因的启动子中包含有Gal4结合位点。在含有放线菌酮的培养基上，如果该报告基因表达将会导致酵母细胞中毒死亡。利用该系统在含有156000个化合物的组合化学分子库中进行高通量筛选，发现其中有10个小分子显示出具有挽救放线菌酮敏感型的DB－β3与AD－α1B表达细胞的活性，获得了一个较好的抑制N型钙离子通道的活性小分子，并有可能发展成为一类新型的、有潜在治疗意义的钙离子通道拮抗剂。

反酵母双杂交系统作为一种理想的高通量筛选系统，具有以下优点：1）该系统中的酵母细胞能够繁殖，因此无需对靶分子进行耗时耗力耗财的生物纯化过程，而且能够在相对短时间内对大量的蛋白质进行测试。2）该系统是在一个生物体环境内进行的，因此与体内环境较为接近。细胞通透性以及细胞毒作用都作为参数在筛选过程中考虑。而这一点恰恰可以弥补体外筛选实验的不足。3）基于该系统的筛选能够比较准确地分析蛋白间的相互作用。利用几乎完全相同的步骤，不相关蛋白间的相互作用也可以进行测试。这就意味着许多蛋白间相互作用能够同时进行。4）该系统能够与现有的高通量筛选兼容，从而可以在96或384孔板上测试组合化学分子库中的化合物。另外它还很容易与计算机工作站等相结合，从而能够快捷地分析实验数据。

尽管反酵母双杂交系统作为一种理想的高通量筛选模型，具有很好的前景，但仍然存在一些缺陷，例如细胞膜通透性问题以及对药物浓度要求较高往往超出了组合化学所能提