水中大肠菌群的培养
生活饮用水 总大肠菌群 多管发酵法方法证实
生活饮用水微生物指标总大肠菌群1.项目概述本实验依据GB-T5750.12-2006 生活饮用水标准检验方法总大肠菌群多管发酵法。
总大肠菌群指一群在37℃培养24 h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群。
本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定。
2.培养基与试剂2.1 乳糖蛋白胨培养液2.1.1 成分A蛋白胨10 gB牛肉膏3gC乳糖5gD氯化钠5gE溴甲酚紫乙醇溶液(16 g/L) 1mLF 蒸馏水1000 mL2.1.2 制法将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2～7.4，再加入1 mL16 g/L的溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，68. 95 kPa (115℃．10 lb)高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
2.2 二倍浓缩乳糖蛋白胨培养液按上述乳糖蛋白胨培养液(2.1.1)，除蒸馏水外，其他成分量加倍。
2.3 伊红美蓝培养基2.3.1 成分A蛋白胨10 gB乳糖10 gC磷酸氢二钾2gD琼脂20 g～30 gE 蒸馏水1000 mLF伊红水溶液(20 g/L) 20 mLG美蓝水溶液(5 g/L) 13 mL2.3.2 制法将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH为7.2，加入乳糖，混匀后分装，以68.95 kPa(115℃，10 lb)高压灭菌20 min。
临用时加热融化琼脂，冷至50℃～55℃，加入伊红和美蓝溶液，混匀，倾注平皿。
2.4 革兰氏染色液2.4.1 结晶紫染色液A成分：a结晶紫 1 gb乙醇（95%，体积分数）20 mLc草酸铵水溶液(10 g／L) 80 mLB制法：将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
注：结晶紫不可用龙胆紫代替，前者是纯品，后者不是单一成分，易出现假阳性。
结晶紫溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。
2.4.2 革兰氏碘液A成分：a碘1gb碘化钾 2 gc蒸馏水300 mLB制法：将碘和碘化钾先进行混台，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水。
水中总大肠菌群检测方法
水中总大肠菌群检测方法
水中总大肠菌群检测一般采用以下方法：
1. 高级培养基方法：将取样的水样加入适当的营养培养基中，培养出细菌，并计数大肠菌群的数量。
常用的培养基有大肠杆菌培养基、MacConkey培养基等。
2. 荧光定量PCR方法：通过PCR技术检测水中大肠菌群的DNA，使用荧光探针结构标记大肠杆菌特异性基因，通过测定荧光信号进行定量分析。
3. 流式细胞仪方法：将水样进行染色，然后通过流式细胞仪分析计数大肠菌群的数量。
常用的染色方法有DAPI染色法、荧光活菌染色法等。
4. 基于微生物生物传感器的方法：利用微生物细胞对特定细菌的识别和响应能力，设计合成生物传感器来监测水中大肠菌群的存在和数量。
以上方法可根据实际需要选择使用，各自具有不同的优缺点。
在进行水环境监测时，可以结合多种方法进行检测，以获得准确和可靠的结果。
多管发酵法测定水中大肠菌群
多管发酵法测定水中大肠菌群
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2）平皿分离（证实试验）
水中除大肠菌群外, 还有其它细菌可能引发 糖类发酵, 所以需要深入证实。
将初发酵管中已发酵菌液接种于伊红美兰 培养基, 37 ºC培养24 h, 依据菌落特征（带关键、 有金属光泽深紫色菌落）, 挑取可能为大肠菌 群菌落制片, 经革兰氏染色, 深入证实是否为大 肠菌群。
划线接种于伊红美蓝琼脂平板上, 再于37 ℃培养 18～24 h, 将符合以下特征菌落进行染色镜检。
深紫黑色, 有金属光泽； 紫黑色, 不带或略带金属光泽； 淡紫红色, 中心颜色较深。
多管发酵法测定水中大肠菌群
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（3）复发酵试验 将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌菌株重复初
步发酵试验。并依据初发酵管试验阳性管查表, 即得大肠菌群数。
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二、试验原理
发酵法: 又称多管发酵法或三步发酵法
1) 初发酵（推测试验）:
将不一样稀释度水样，分别接种于 含有乳糖等糖类培养液中（3倍或1倍乳 糖液），经37 ºC培养24 h，观察产酸产 气情况，培养基内加有溴甲酚紫作为 PH指示剂，细菌产酸后，培养基即由 原来紫色变为黄色，以初步判断是否有 大肠管发酵法测定水中大肠菌群
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多管发酵法测定水中大肠菌群
一、试验目标 二、试验原理 三、试验材料 四、试验步骤 五、试验汇报
多管发酵法测定水中大肠菌群
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一、试验目标
1、学习测定水中大肠菌群数量多管发酵法。 2.了解大肠菌群数量在饮水中主要性。
多管发酵法测定水中大肠菌群
多管发酵法测定水中大肠菌群
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10ml×100 1ml×100 1ml×10-1 1ml×10-2
3×
饮用水大肠菌群检测方法
饮用水大肠菌群检测方法大肠菌群是指在37℃培养24h 内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革蓝氏阴性无芽孢杆菌的总称。
主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
水的大肠菌群数是指100 mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。
在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽孢杆菌等多种细菌。
这些细菌都可以随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。
目前，国际上已公认大肠菌群是粪便污染的指标。
因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。
水中大肠菌群的检测方法，常用多管发酵法和滤膜法。
多管发酵法可适用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要的时间较长。
滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于堵塞滤孔的水样。
(一)水样的采集供细菌学检验的水样，必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证再运送、贮存过程中不受污染。
水样从采集到检验不应超过4h，在0～4℃下保存不应超过24h ，如不能在4h 内分析，应在检验报告上注明保存时间和条件。
1、自来水取样：应在水龙头打开放水5min，再用无菌容器接取水样，待分析。
如水样内含有余氯，则采样瓶灭菌后按每500mL水样加3%Na2S2O3.5H2O溶液1mL。
2、江、河、湖、池自然水体取样：可用采样器，采样瓶应先灭菌。
采样后，瓶内应留有空隙。
如果与其他化验项目联合取样，细菌学分析水样应采在其他样品之前。
(二)初发酵试验1.水样稀释：制备水样10-1、10-2的稀释液，方法为用无菌移液管吸取水样10mL放于盛有90mL无菌水和若干玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡使混合均匀，并使其中的细菌尽量呈单个存在，即为10-1稀释液;再从10-1制备10-2稀释液。
以此类推，稀释到所需倍数。
2.接种和培养：以无菌操作于5支三倍浓缩培养基(接种前一定应先检查杜汉氏小管内有无气泡)中各加入水样10mL，5支普通培养基试管中加入水样1mL，5支普通培养基试管中加入10-1稀释液1mL，小心混匀放入37℃培养箱中培养24h 。
水中大肠菌群的检测
水中大肠菌群的检测法——（多管发酵法）一、实验原理大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。
大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌（Escherichia coli）为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48小时内发酵乳糖并产酸产气。
我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过三个。
多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。
乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
本实验为精简实验，所以省略了平板分离和复发酵试验后两部分，直接通过第一部分初发酵试验的颜色变化进行判断是否存在大肠菌群。
初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
二、实验器材1.水样中心湖的湖水2．试剂三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管3．仪器及其它用品移液枪，16支试管（16支德汉氏小套管）三、实验步骤初发酵试验取16支发酵管，其中10支用移液管加入10ml一倍的乳酸蛋白胨培养液，5支加入5ml三倍乳糖蛋白胨培养液，1支加入9ml自然水。
然后往16支试管各倒置一支汉氏小套管。
完成后包装好，于121℃高压灭菌锅中灭菌30min 左右。
将取回来的中心湖水样稀释20倍。
待试管冷却后，在无菌操作条件下，向装有三倍的乳酸蛋白胨培养液的5支试管加入10ml水样，向装有一倍的乳糖蛋白胨培养液的5支试管中加入1ml水样，向装有一倍的乳酸蛋白胨培养液的另5支试管中加入1ml 10-1水样。
将各试管充分混均，置于37℃恒温箱中培养24h。
四、实验结果同时观察其他两组也是用中心湖水样的，其结果全都是显示为黄色。
初步得出，取回来的水样的大肠菌群严重超标，比检测表的上限还要高，已经失去检测的意义了。
实验六 发酵法检测大肠菌群培养基制备
第5组：包培养皿，并协助第4组配制培养基。
① 6付1包。包90付。共15包。 ② 高压蒸汽灭菌。115℃，灭菌30min。
后续试验分组
2013-1班：分6组（5-6人1组） 2013-2班：分6组（5-6人1组） 2012-1班：分5组（5-6人1组） 2012-2班：分6组（5-6人1组）
30g 9g 15g 15g 3ml 1000ml
配制方法：
①将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠加热溶解于1000ml水中， 调整pH为7.2-7.4。
②定量加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀。
③分装试管（内有小倒管）。用注射器分装每管5ml。装36支 试管。
④高压蒸汽灭菌。115℃，灭菌30min。
实验六 发酵法检测水中大肠菌群培养基的制备
一 实验目的
1 学习并掌握液体培养基配制方法。 2 学习培养皿的包扎方法。 3 掌握并巩固高压蒸汽灭菌方法。
二 实验操作步骤（分组操作：6-7人1组,分5组）
第1组：3倍浓缩乳糖培养基制备。（配制200ml）
蛋白胨 牛肉膏 乳糖 氯化钠 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 水
③ 分装试管（内有小倒管）。用注射器分装每管10ml。每 组装55支试管。
④ 高压蒸汽灭菌。115℃，灭菌30min。
第4组：伊红美蓝储备培养基制备（配制1400ml）
蛋白胨 乳糖 磷酸氢二钾 琼脂ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ水
10g 10g 2g 20g 1000ml
配制方法： ① 将琼脂加入900ml水中，加热溶解；
② 然后加入磷酸二氢钾及蛋白胨，混匀溶解； ③ 加水补足1000ml，调pH7.2-7.4。 ④ 加入乳糖后溶解混匀。 ⑤ 分装三角瓶。每瓶200ml（定量）。 ⑥ 高压蒸汽灭菌。115℃，灭菌30min。
微生物实验10水中大肠菌群数的测定
实验九水中大肠菌群数的测定一、目的要求学习大肠菌群数的检测原理和方法。
二、实验材料1.样品：水样2. 培养基：乳糖胆盐发酵管(单料及双料)，伊红美兰琼脂(EMB)平板，乳糖发酵管。
3. 其他：显微镜，酒精灯，无菌吸管(10m1、1m1)，接种环，载玻片等三、基本原理水中的病原菌多数来源于病人和病畜的粪便。
由于病原菌的数量少，检测过程复杂，因此，直接测它们的存在是非常困难的专业化工作。
由于大肠菌群在粪便中数量大，在体外存活时间与肠道致病菌相近，且检验方法比较简便，因此一般采用测定大肠菌群或大肠杆菌的数量来作为水被粪便污染的标志。
如果水中大肠菌群的菌数超过一定的数量，则说明此水已被粪便污染，并有可能含有病原菌。
大肠菌群的定义是指一群好氧和兼性厌氧、革染氏阴性、无芽孢的杆状细菌，并能在乳糖培养基中，经37℃24~48h培养能产酸产气。
我国规定每升自来水中大肠菌群不得超过3个。
检测大肠菌群的方法有稀释培养法和膜滤法两种，其中稀释培养法是标准分析法，为我国大多数卫生单位和水厂所使用。
它包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
四、方法与步骤1.采样：取100ml磨口带塞玻璃瓶，包扎后，干热灭菌备用。
取自来水样时，至少应先放水5min，以冲去龙头口所带的微生物，获得主流管中有代表性的水样。
取样时，用右手握瓶，左手启开瓶塞，用覆盖瓶口的纸托住瓶塞，收集样品后，连同覆盖纸一起将瓶口塞好，并用线绳在原处扎好。
注意手指不得触及瓶口内部。
在静水中取样时，先用右手揭去塞子，瓶口朝下浸入水下约30cm处，然后将瓶子反转过来，待水注满后，取出塞好瓶口。
如果水在流动，瓶口必须迎着水流，以免手上的细菌被水冲进瓶子。
2.水样放置过程中，内含的细菌数目和类型会发生变化，所以要求水样品应于6~10℃贮存，并不超过6h。
3.初发酵试验：吸取待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，10ml接种量采用双料发酵管，而lml及lml以下接种量采用单料管。
大肠菌群在水中的培养实验
实验微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏一、实验目的和要求1.了解微生物的分离纯化方法。
2.学习检测水中大肠菌群的方法。
3.学习微生物的保藏及鉴定方法。
4.熟悉革兰氏染二、实验原理多管发酵法多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。
乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
1.初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
2.平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂，平板上划线分离菌落。
3.复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
三、实验器材及试剂1.水样污水样本2、培养基及试剂：二甲苯、苯酚、琼脂粉、香柏油、乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。
3、器材及耗材:双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球、产气管、培养皿、移液管等四、实验方法及步骤1.第一天实验前的准备1）配制3支乳糖胆盐液体培养基，每支10mL，并加入产气管。
配置营养琼脂培养基，灌装进2支试管中，配置200mL伊红美兰培养基150mL,于121℃高温高压灭菌20分钟，后放进恒温干燥箱。
2）包扎5套培养皿，包扎6根1mL、1根10mL移液管和3支滴管。
于121℃高压灭菌锅中灭菌20分钟。
3）称取一定量的液体石蜡，约为锥形瓶的三分之一。
于121℃高温高压灭菌20分钟。
水中总大肠菌群的测定法(多管发酵法)
3.1乳糖蛋白胨培养液：外购商品培养基或按下列方法自行配制。
3.1.1 组分
蛋白胨 10.0g
牛肉膏 3.0g
乳糖5.0g
氯化钠5.0g
1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1.0ml
蒸馏水1000ml
3.1.2 配制
将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1000ml蒸馏水中加热溶解，用1mol/L的NaOH或HCl调节pH为7.2～7.4，再加入1ml 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，置于高压蒸汽灭菌器中，以115℃灭菌20分钟，贮存于冷暗处备用。
6.2.3根据证实有总大肠菌群存在的阳性管数，查检数表（附录B），计算每升水样中的总大肠菌群数。
7 计算
根据总大肠菌群检数表（附录A、B），查表计算水中总大肠菌群数。
8 精密度
8.1重复性
无
8.2再现性
无
9报告
根据查表结果报告水中总大肠菌群数，单位是个/L。
10 附加说明
附录A总大肠菌群数检数表
（接种水样总量300ml，其中100ml水样2份，10ml水样10份）
4.2干热灭菌箱。
4.3培养箱：37土1℃。
4.4冰箱。
4.5电炉。
4.6天平。
4.7灭菌试管：150mm×20mm、140mm×15mm。
4.8灭菌刻度吸管。
4.9灭菌采样瓶。
4.10 pH计或精密pH试纸。
4.11显微镜。
4.12革兰氏染色用有关器材。
5 仪器准备
5.1测定用试管、刻度吸管、采样瓶、三角瓶在使用前应在高压蒸汽灭菌器121℃灭菌15min，或者在干热灭菌箱160℃灭菌2h，干燥后灭菌箱内存放备用。
6.1.2平板分离
多管发酵法测定水中大肠菌群实验报告
多管发酵法测定水中大肠菌群摘要：初步发酵实验中将水样接种与乳糖蛋白胨液体培养基的发酵管内，37度下培养，24内小管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性如果，如果出现产生气泡但不变色或者变色但不产气的情况，应该延长培养至48小时，若仍不的为阴性反应。
平板分离实验中把初实验产期产酸的试管的菌接到伊红美兰琼脂平板上然后培养24小时。
复发酵实验中将以上大肠杆菌阳性菌落，经涂色染色为革兰阴性无芽孢杆菌，通过次试验进一步证实原理：初发酵实验：发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一个杜氏小管。
乳糖能其选着作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠杆菌能发酵乳糖而产气产酸。
为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为指示剂，细菌产酸后培养基由原来的紫色变为黄色。
初步发酵实验中将水样接种与乳糖蛋白胨液体培养基的发酵管内，37度下培养，24内小管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性如果，如果出现产生气泡但不变色或者变色但不产气的情况，应该延长培养至48小时，若仍不产气的为阴性结果。
平板分离：伊红美兰琼脂培养基有伊红和美兰两种染料，在此作为指示剂，大肠杆菌发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料及结合，使培养基产生有金属光泽的深紫色菌落。
复发酵实验：以上大肠杆菌阴性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢的，通过此试验进一步证实。
原理与初发酵实验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠杆菌阴性结果。
材料与用具：1.培养基乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置杜氏小管）三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（内有杜氏小管）伊红美兰琼脂平板2．无菌水3. 用具载玻片灭菌带玻璃塞空瓶灭菌试管灭菌吸管方法：1水样的采取从不同水体（自来水、河水）中采集样品2自来水检查（1）初发酵实验在2个含有50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入100ml水样。
在10支含有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样。
_水中总大肠菌群的测定—多管发酵法
水中总大肠菌群的测定—多管发酵法一．原理总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。
多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。
试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN 表示。
三．仪器(1)高压蒸气灭菌器。
(2)恒温培养箱、冰箱。
(3)生物显微镜、载玻片。
(4)酒精灯、3mm接种环。
(5)培养皿（直径100mm）、试管（5×150mm），吸管（1、5、10mL）、烧杯（200、500、2000mL）、锥形瓶（500、1000mL）、采样瓶、移液枪。
四．培养基及染色剂的制备1．乳糖蛋白胨培养液：将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g 氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节溶液pH为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，贮存于冷暗处备用。
2．三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。
除蒸馏水外，各组份用量增加至三倍。
3．伊红美蓝培养基：①贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解。
再加2.0g邻酸二氢钾及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至1000mL，调节溶液pH值为7.2～7.4。
趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀后定量分装于250mL或500mL锥形瓶内，于121℃高压灭菌15min，贮于冷暗处备用。
②平皿培养基的制备：将上述制备的贮备培养基融化。
根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液（0.4g伊红溶于20mL水中）和一定量已灭菌的0.5%美蓝水溶液（0.065g美蓝溶于13mL水中），加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此培养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用。
水中总大肠菌群的测定法(多管发酵法)
1适用范围本标准适用于天然水和生活水中总大肠菌群的测定。
2方法概要总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37C 生长时能使乳糖发酵，在 24h 内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
总大肠菌群数系指每升水样中所含有的总大肠菌群的数目。
总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。
本标准参照GB 5750-85制订。
3试剂和材料 3.1乳糖蛋白胨培养液：外购商品培养基或按下列方法自行配制。
3.1.1 组分蛋白胨 10.0g 牛肉膏 3.0g乳糖 氯化钠1.6 %溴甲酚紫乙醇溶液蒸馏水3.1.2 配制将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于 节pH为7.2〜7.4，再加入1ml 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，置于高 压蒸汽灭菌器中，以 115C 灭菌20分钟，贮存于冷暗处备用。
3.2 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液: 按上述乳糖蛋白胨培养液（ 3.1 ）各组分的称量增加三倍配制。
3.3 品红亚硫酸钠培养基（供多吕发酵法用） :外购商品培养基或按卜列万法自行配制。
3.3.1组分蛋白胨 10.0g乳糖10.0g磷酸氢二钾3.5g琼脂10〜30g蒸馏水1000ml无水亚硫酸钠5g 左右 5.0g 5.0g 1.0ml 1000ml1000ml 蒸馏水中加热溶解，用 1mol/L 的NaOH 或HCI 调332 贮备培养基的配制先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，用1mol/L的NaOH或HCI调节pH为7.2〜7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置于高压蒸汽灭菌器中，以115C灭菌20分钟，贮存于冷暗处备用。
3.3.3平皿培养基的配制将上法制备的贮备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中。
再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解后，置于沸水浴中煮沸10分钟以灭菌。
水中大肠菌群的测定
水中大肠菌群的测定水中大肠菌群的测定一、实验目的1、了解和学习大肠菌群落的测定原理和测定意义2、学习和掌握大肠菌群数量与饮水卫生质量的关系和检测方法二、实验原理大肠菌群是一群能在37℃培养、48h内发酵乳糖产酸、产气的需氧或兼氧格兰氏染色阴性无芽孢杆菌。
在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群等多种细菌，这些细菌都可以随人畜排泄物进入水源。
一些水中的肠道病原菌如沙门氏菌，也存在于人的粪便中，它们的致病能力强，存活能力差，数量有限，而且培养的条件苛刻，分离和鉴别比较困难，样品监测即使为阴性，也不能保证没有病原微生物的存在。
而大肠菌群存活能力强，数量庞大，检测方法比较简易。
此外，大肠菌群细菌在水中的存活时间、对消毒剂和水体中不良因素的抵抗力与病原菌相似，可以作为人畜粪便污染的指示菌。
目前，国际上已经公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。
因而对饮用水必须进行大肠菌群落的检查。
《生活饮用水卫生标准》（GB 5749-2006）规定：生活饮用水总大肠菌群数规定为MPN/100mL或CFU/100mL不得检出。
MPN 为最大可能适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。
MPN是水的标准分析法，适用于各种水样，包括初发酵、平板分离和复发酵三部分。
三、实验材料1、水样：400mL2、培养基：乳糖蛋白胨半固体培养基、3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液、EMB培养基。
3、灭菌水：作阴性对照用。
4、接种大肠埃希菌的水样：做阳性对照用。
5、试剂和染色剂：草酸铵结晶紫染液，碘液，泛红染液，脱色液。
6、仪器设备：超净工作台，恒温培养箱，显微镜等。
7、其他：无菌移液管、无菌锥形瓶、发酵用试管、杜氏小管、培养皿、移液枪、酒精灯等。
四、操作步骤1、初发酵在3倍浓缩乳糖培养基中加入稀释度为10^-1、10^-2、10^-3的被检样品10mL，每个稀释度5个重复，混合均匀置于37℃培养24h。
2、平板分离培养24h后如果不产酸(乳糖发酵液变黄色)，产气（小指管底部有气泡）和不变浑浊者为阴性反应，产酸、产气或者仅产酸的乳糖发酵管为阳性反应，将阳性反应划线接种在伊红美兰平板上并且进行划线接种，37℃培养24h。
实验九多管发酵法测定水中大肠菌群
证实有大肠菌群存在后，再根据复发酵的阳性管
（瓶）数查表，即得每升水样中的大肠菌群数。
▲ 将100、10、1、0.1（10-1）ml水样的发酵管 结果查水 样的发酵管结果查表4
五 实验报告
实验课程论文
封面格式 《水处理微生物学》课程实验
水样管/ml 100 10 1 0.1 0.01
发酵结果
2 思考题
(1) 大肠菌群的定义是什么? (2) EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查 大肠菌群时，各起什么作用？
存在于肠道中的正常菌群,在正常生理情 况下不致病.
（1）大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli） E.coli
（2）产气杆菌（Aerobacter aerogenes） （3）枸橼酸盐杆菌（Coli citrovorum） （4）副大肠杆菌（Paracoli） 大肠菌群的生理习性与病原菌相似，并且外界 存活时间基本一致.
经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢 杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通 浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一 初发酵管的同类型菌落1--3个，37℃培养24h，结果 若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。
同类型菌落① 深紫黑色、有金属光泽。 ② 紫黑色、不带或略带金属光泽。 ③ 淡紫红色、中心颜色较深。
3 复发酵试验
以上大肠菌群阳性菌落，经涂片革兰氏染 色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再 进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸 又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
水样 接种
初步 发酵
产酸 产气
大肠菌群
厌氧芽孢杆菌
好氧芽孢杆菌
平 板 分 离
鉴 别 培 养 基
产酸 复发酵
实验九 水中总大肠菌群的测定
（2）检测池水、河水或湖水
应取距水面10－15cm的深层水样，先将灭菌带玻璃塞的空瓶瓶口向下 浸入水中，然后翻转过来，拨开玻璃塞，水即流入瓶中，满后将玻璃塞塞
好，再从水中取出。有时需用特制的采样器取水样。采取的水样最好立即
维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降
低压力，延长时间。 5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打 开灭菌器盖，取出物品。
手提式高压蒸 汽灭菌锅
高压蒸汽自动 灭菌锅
斜面摆放与冷凝
倒平板操作法示意图
五 操作步骤 1 水样的采取
（1）检测自来水
4 分离培养
将初发酵的阳性管(产酸产气)的菌液分别划线接种于伊红美蓝琼脂培 养基平板。置36±1℃温箱内，培养18～24h，然后取出，观察菌落形态。 选择符合大肠菌群菌落特征的菌落:① 深紫黑色，有金属光泽；② 紫黑色， 不带或略带金属光泽；③ 淡紫红色，中心颜色较深, 挑取一部分，进行革 兰氏染色。
思考题
1. 何谓大肠菌群？它主要包括哪些细菌属 ？ 2. 假如水中有大量致病菌，如：痢疾、伤 寒、霍乱等病原菌，用多管发酵法检测总 大肠菌群，能否得到阳性结果？为什么？ 3. 为什么接种100、10 mL水样，用的是3 倍 浓缩的乳糖蛋白胨培养基，而接种1.、 0.1、0.01、0.001 mL水样，则用乳糖蛋白 胨培养基？
（2）水源水
在装有5ml 3倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基的试管中加入10ml水样品；于各装有 10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL水样；再于各 装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL 1：10 稀释的水样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养 48h。 （可以根据水的污染程度选择3个稀释度）
实验6 水中大肠菌群
实验六水中大肠菌群(Coliform group)细菌的检测一、实验目的1.采用多管发酵法，以最近似数的方式测定水中大肠菌群数。
2. 掌握微生物实验中无菌操作技术方法。
二、实验原理如果水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原苗污染而引起肠道传染病。
由于肠道病原菌在水中数量较少，故从水中特别是自来水中分离病原菌常常非常困难。
大肠菌群细菌是肠道好氧菌中最普遍和数量最多的一类细菌，所以常常将其作为粪便污染的指示菌。
即根据水中大肠菌群细菌的数目来判断水源是否受粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。
一般规定每1000ml自来水中大肠菌群细菌不得超过3个．大肠菌群细菌是指一类好氧或兼性厌氧，革兰氏阴性，无芽孢的杆菌，包括四种细菌：大肠埃希氏杆菌、枸椽酸盐杆菌、产气杆菌及副大肠杆菌。
它们有相似的生化反应，能发酵葡萄糖，产酸产气，但发酵乳糖的能力不同。
当将它们接种到含乳糖的远滕氏培养基上生长时，四种菌的反应不一样，大肠埃希氏杆菌的菌落呈紫红色带金属光泽；枸椽酸盐杆菌的菌落呈紫红或深红色；产气杆菌的菌落呈淡红色，中心色深；副大肠杆菌的菌落无色透明(因不利用乳糖所致)。
本试验采用多管发酵法，以最近似数的方式来记载，这一数字是根据概率公式来估算，有大于实际数字的倾向，在增加每种稀释度的试管重复数后，可减少偏差。
本法除了用于检测水样(淡水或海水)外，尚可用于泥浆、沉积物、污泥等的检测。
测定时先将这类固体或半固体样品预先称重，再加水稀释，可取50g 样品，置于盛有450ml灭菌磷酸盐缓冲液并装有玻璃珠、石英砂的锥形瓶中，振荡l~2min，便成10-1稀释，以用于检验。
三、实验材料1.培养基；1.1乳糖胆汁液体培养基：蛋白胨：20.0g， 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液：l ml，乳糖：5.0g，胆酸钠：5.0g将蛋白胨、乳糖、胆盐加热溶解于1000m1蒸馏水中，调pH值至7.2～7.4，加入1.6％溴甲酚紫乙醇溶液l ml，充分混匀，分装于有倒置杜汉氏小管的试管中，注意小管中不得有气泡，115ºC灭菌20min。
水中总大肠菌、大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群的测定 光度法 -回复
水中总大肠菌、大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群的测定光度法-回复水中总大肠菌、大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群的测定- 光度法1. 引言水是生命中不可或缺的重要资源，然而水中存在着许多潜在的细菌污染。
其中，大肠菌群中的大肠埃希氏菌在水体中的检测尤为重要，因为它们可以作为病原体或指示性微生物，反映水体是否受到了粪便污染。
耐热大肠菌群的测定则是为了评估水体中存在的耐热菌的数量，以考察水体的卫生质量。
2. 实验步骤2.1 样品收集与处理从水源中收集所需样品，并确保样品容器是消毒干净的。
将水样转移到试管中，透过120目的筛布过滤以去除杂质。
将筛布冲洗，大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群的检测要求分别使用两个筛布。
2.2 媒介培养基的制备大肠埃希氏菌的培养基制备：使用大肠埃希氏菌选择液增殖大肠埃希氏菌菌种，然后按照制造商的说明添加适量的大肠埃希氏菌生长培养基。
将培养基搅拌均匀后，分装到培养皿中，并进行灭菌处理。
耐热大肠菌群的培养基制备：使用耐热大肠菌选择液增殖耐热大肠菌菌种，然后按照制造商的说明添加耐热大肠菌生长培养基。
将培养基搅拌均匀后，分装到培养皿中，并进行灭菌处理。
2.3 样品处理与菌落计数取一定体积的水样（一般为10ml），均匀地加入到含有大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群培养基的两个培养皿中。
在分发前使用三倍无微生物水进行稀释，确保每个培养皿中的细菌数量适合计数。
将含样品的培养皿进行培养，在适当的温度条件下孵育一定的时间（一般为37摄氏度，大肠埃希氏菌为48小时，耐热大肠菌群为24小时）。
之后，观察并数计培养皿中的菌落形成单位（CFU）。
3. 结果与数据分析根据菌落计数的结果，可以得到大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群在水样中的数量。
将每个培养皿中的菌落计数相加，并乘以稀释倍数，即可计算出水中大肠菌的浓度。
4. 结论光度法是一种常用的快速测定水中总大肠菌、大肠埃希氏菌和耐热大肠菌群的方法。
通过观察和计数菌落形成单位，我们可以得到这些细菌在水中的相对数量。
水中大肠菌群的培养
实验三水中大肠菌群的检测（多发酵法）、实验目的1.了解饮用水和水源水大肠菌群的原理和意义。
2.学习检测水中大肠菌群的方法。
二实验原理1.相关性大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。
大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌（Escherichia coli ）为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37^生长时，能在48小时内发酵乳糖并产酸产气。
我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过三个大肠杆菌能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K ,以及有杀菌作用的大肠杆菌素。
大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。
粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。
水体中的病原微生物常因数量较少而难以检出，即使检出结果为阴性，也不能保证无病原微生物存在；同时检出手续也很复杂。
所以，在实际工作中常借用检查水体中有无“指示菌”存在及其数量多少来判定水质是否被污染。
大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，国家规定，每升饮用水中大肠杆菌数不应超过3个。
大肠菌群是作为粪便污染指标提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。
大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。
因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。
大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中2.检测安全大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视.目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系,常做高效表达的首选体系。
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实验三水中大肠菌群的检测
（多管发酵法）
一、实验目的
1. 了解饮用水和水源水大肠菌群的原理和意义。
2．学习检测水中大肠菌群的方法。
二、实验原理
1.相关性
大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。
大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌（Escherichia coli）为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48小时内发酵乳糖并产酸产气。
我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过三个。
大肠杆菌能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。
大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。
粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。
水体中的病原微生物常因数量较少而难以检出，即使检出结果为阴性，也不能保证无病原微生物存在；同时检出手续也很复杂。
所以，在实际工作中常借用检查水体中有无“指示菌”存在及其数量多少来判定水质是否被污染。
大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，国家规定，每升饮用水中大肠杆菌数不应超过3个。
大肠菌群是作为粪便污染指标提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。
大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。
因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。
大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中
2.检测安全
大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,大规模发酵经济,倍受遗传工程专家的重视.目前大肠杆菌是应用最广泛,最成功的表达体系,常做高效表达的首选体系。
3.抗逆性
因为水中致病性的治病菌比较少，同时饮用水中的大肠杆菌的数量也是较少的，而大肠菌群与治病菌的抗逆性一样，所以检测大肠杆菌就能反应出水样的质量。
4. 数理统计
通过对某些现象的频率的观察来发现该现象的内在规律性，并作出一定精确程度的判断和预测；将这些研究的某些结果加以归纳整理，逐步形成一定的数学概型，这就是数理统计的原理。
就本次实验来讲，15支培养液中（其中有三类），5支装入的10ml水样，5支装入1ml水样，5支装入0.1ml水样，通过培养后，看各个种类的培养液中显示为阳性（黄色）的有几支，通过这些数据和报告中的表格，可算出每100ml水样中细菌的可能数。
如果连0.1ml水样的5支均为黄色时，可取水样稀释100倍后，再求出大肠杆菌的可能数。
5.微生物的代谢
能量代谢是微生物新陈代谢的核心。
绝大多数的微生物是异养生物，它们利用有机物作能源，通过生物氧化以及与此相连的氧化磷酸酸化或底物水平磷酸化反应形成ATP。
生物氧化必须经历脱氧，递氢和受氢三个阶段，并按其最终氢受体的性质而分为呼吸，无氧呼吸或发酵三种。
呼吸的产能效率最高，无氧呼吸次之，发酵则最低。
化能自养微生物因利用无机物的氧化取得ATP，故不但产生的能量少，而且还须通过能耗大的逆呼吸链反应产生固定所必须的还原力［Ｈ］，因此它们的生长缓慢，生长得效率低。
光能自养微生物可以通过循环光合磷酸化(如厌氧菌的光合细菌)，非循环光合磷酸化（如产氧的蓝细菌）或紫膜光合磷酸化取得ATP。
微生物所特有的合成代谢途径种类繁多，最重要且有代表性的是的自养固定，生物固氮，细胞壁肽聚糖和微生物次生代谢物的生物合成。
微生物的代谢调节具有可塑性强，灵敏度高和反应精确等特点，主要有调节酶合成量的酶诱导，阻遏机制和调节现成酶催化活力的激活和抑制尤其是反馈抑制机制两类。
6.多管发酵法
多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。
乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
①初发酵试验
水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
②平板分离
初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂，平板上划线分离菌落。
③复发酵试验
以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
三、实验器材
1.水样
自来水，中心湖水（稀释20倍），行政楼旁边水塘的水（稀释50倍）
2．试剂
乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝或复红亚硫酸钠琼脂平板。
3．仪器及其它用品
4．灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌移液枪，带塞灭菌试管。
四、实验方法
1．水样的采取
水源水（大学城中心湖的水，广工行政楼旁边水塘的水）。
2．（1））初发酵试验。
取16支发酵管，其中10支用移液管加入10mL一倍的乳酸蛋白胨培养液，5支加入5mL 三倍乳糖蛋白胨培养液，1支加入9mL自然水。
完成后包装好，于121℃高压灭菌锅中灭菌30min左右。
冷却后，在无菌操作条件下，向装有三倍的乳酸蛋白胨培养液的5支试管加入10mL水样，向装有一倍的乳糖蛋白胨培养液的5支试管中加入1mL水样，向装有一倍的乳酸蛋白胨培养液的另5支试管中加入1mL10-1水样。
将各试管充分混均，置于37℃恒温箱中培养24h。
注：本次实验没有经过平板分离和复发酵试验。
水样总量：55.5ml(5管10ml水样，5管0.1ml水样，5管0.1 1:10稀释水样时，不同阳性和阴性情况下100ml 水样中细菌的最可能数和95%可信限度值)
五、实验结果
（1）本次实验的所有试管都变成黄色，并且都产酸产气。
查表得每升水源水样中大肠菌群数大于2400。
本次试验用来稀释的水是自来水，虽然说自来水中的大肠菌群数量很少，但是水样中大肠菌群并不是均匀分布的，没有灭菌会带来误差。
实验并没有在超净实验台上进行，空气中的微生物干扰很大。
没有经过平板分离和复发酵操作，实验结果可信性降低了。
但本次试验操作大体来说还是正确的，而且水样经过稀释之后试管的颜色变化很大，证明培养基里的大肠菌群存在比较多，所以中心湖的水污染比较严重，需要合适的治理。
六、思考题
1．为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？
答：原因主要有：1、大肠菌群的来源比较单一，主要来自于人体和动物的粪便当中，而且在自然界中容易死亡。
与人体内致病细菌来源有很大相关性。
2、大肠菌群与致病菌的抗逆性一直，在自然界中致病菌与大肠菌群的存活机率是一致的。
3、大肠菌群检测简易，所得结果可靠。
4、致病菌相对比较难测量。
5、样品检测大肠菌群常有，致病不常有。