肿瘤基因突变检测标本要求.
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收集胸水50-500mL 室温静置30分钟，吸去上清，剩余 5-50mL 沉淀物室温250g离心10分钟，吸去上清
低温保存
酒精固定涂片
福尔马林固定切片
标本的质量控制
• 福尔马林固定的标本
– 固定要及时，离体后即时处理<1h – 固定液：10% 中性缓冲福尔马林（新鲜配制） – 固定液的量：应为组织体积的10倍以上 – 固定时间：小组织6-12h，大标本6-48h
• 血液标本
1、血液标本收集后使用EDTA抗凝，由于血浆、血清中游离核酸以及循环肿瘤细胞量极少 ，建议尽可能在收集标本后2小时内进行核酸提取，以避免核酸更深降解。
手术标本
标本接收、固定
组织处理、石蜡包埋
切片及H&E染色
组织学观察
• 标本通常较大，能提供足够的肿瘤组织用于检测 • 标本可以是冰冻或福尔马林固定组织
• 冰冻组织
– – – – – – – 外科手术标本：最好标本，可得高质量肿瘤DNA 支气管镜、穿刺活检测标本：量少，但肿瘤DNA质量仍好 外科手术标本：可得足量肿瘤DNA，但DNA片段化 支气管镜、穿刺活检测标本：可得肿瘤DNA量少且片段化 胸水、肺泡冲洗液和痰液标本：肿瘤细胞含量不确定，通常很少
肿瘤基因突变检测标本
用于突变检测的标本
• 肺叶切除 • 肺段切除 • 支气管镜活检 • 细针穿刺活检
手术 病理评估合格的 标本适用于EGFR 基因突变检测 标本 细胞学 标本
• 支气管刷片 • 胸水
活检 标本 血液学 标本
• 血浆
• 血清
建议采用灵敏度 高的ARMS检测 方法
• 痰
肿瘤基因突变检测标本类型
• 石蜡组织标本
• 细胞学标本
1、胸水样本、心包积液、脑脊液等，建议在收到标本后两个小时内离心收集沉淀细胞进行 检测，如来不及操作可离心后将沉淀冻存至-20℃保存，等使用时取出；亦可将沉淀包埋成 蜡块后再切片检测； 2、或者将样本直接放置4℃保存过夜再离心收集沉淀，可能会一定程度影响DNA的完整性 ，但一般不影响实验结果。细胞学标本建议涂片后经病理诊断含有肿瘤后在进行检测。
• 肿瘤比例：标识肿瘤丰富的区域，提Biblioteka Baidu肿瘤细胞比例用于检测
尽量去除非肿瘤组织及细胞，提高检测的敏感性 不同敏感性的检测方法对肿瘤比例要求不一样 测序法：〉10% ARMS法：〉1%
• 固定包埋组织
• 细胞学标本 • 血液标本
血清、血浆标本：含肿瘤DNA，但含量不稳定，DNA片段化 循环血肿瘤细胞：可得较高质量肿瘤DNA，但量很少
1. Dacic S. Adv Anat Pathol 2008; 15(4):241-247. 2. Sequist LV, et al. Clin Cancer Res 2006; 12(14S):4403s-4406s. 3. Bai H, et al. J Clin Oncol 2009; 27(16):2653-2659.
• 冰冻标本
– 组织离体后立即速冻<1h
病理评估不达标样本导致EGFR突变检 测呈阴性结果
4 例肺肿块切除标本EGFR突变检测呈阴性
肺转移性肝细胞性肝癌
小细胞性肺癌
肿瘤细胞太少
未检测到肿瘤组织
Rubbish In; Rubbish Out
选择正确、合适的肺癌组织，是保证突变检测成功第一步及重要的步骤
• 细胞学标本中通常肿瘤细胞数目较少，需要采用灵敏度高的ARMS检测方法
• 建议有条件的病理科制备细胞蜡块：
– 处理流程：细胞学标本经离心处理后，常规福尔马林固定、处理及石蜡包埋即可 – 制备细胞蜡块的好处： （1）便于长期保存；（2）方便用于EGFR基因突变的检测及其他分
子生物学标记物的检测
四、胸水标本处理流程
标本的病理评估内容
• 诊断：确保肿瘤组织是非小细胞性肺癌 • 肿瘤量：确保有足够的肿瘤组织用于突变检测 尽量保证200-400个肿瘤细胞 对于技术成熟的实验室，可以尝试进行<200个肿瘤细胞的标本检测
5-10uM 10张切片能满足突变检测需求
当细胞数较少时,可以适当增加切片数,以满足检测需求
不同类型标本处理方式
• 新鲜组织标本：
• 1、迅速低温放置，如有条件可放置-80℃或者液氮保存，如果没有条件可使用-20℃保 存，但是保存时间不宜太久； 2、放入组织保存液中保存，组织保存液的能渗透0.5cm厚度的组织，因此用组织保存液 保存时，建议组织不宜过大。核酸在组织保存液中 37 ℃稳定存放1天，25 ℃稳定存放一 周，4 ℃ 1个月或–20 ℃长期存放 1、手术、穿刺、活检标本等放入10%中性福尔马林中固定后制作成蜡块，可保存数年之久 。(病理科常规处理样本方式)
支气管镜活检
标本较小 通常是福尔马林固定、石蜡包埋处理 建议采用灵敏度高的ARMS检测方法
细针穿刺活检
标本较小 通常是福尔马林固定、石蜡包埋处理 建议采用灵敏度高的ARMS检测方法
细胞学标本
涂片、染色 胸水或支 气管刷片 或痰液 液基细胞学
细胞蜡块，切片染色
病理诊断 病理诊断 病理诊断
低温保存
酒精固定涂片
福尔马林固定切片
标本的质量控制
• 福尔马林固定的标本
– 固定要及时，离体后即时处理<1h – 固定液：10% 中性缓冲福尔马林（新鲜配制） – 固定液的量：应为组织体积的10倍以上 – 固定时间：小组织6-12h，大标本6-48h
• 血液标本
1、血液标本收集后使用EDTA抗凝，由于血浆、血清中游离核酸以及循环肿瘤细胞量极少 ，建议尽可能在收集标本后2小时内进行核酸提取，以避免核酸更深降解。
手术标本
标本接收、固定
组织处理、石蜡包埋
切片及H&E染色
组织学观察
• 标本通常较大，能提供足够的肿瘤组织用于检测 • 标本可以是冰冻或福尔马林固定组织
• 冰冻组织
– – – – – – – 外科手术标本：最好标本，可得高质量肿瘤DNA 支气管镜、穿刺活检测标本：量少，但肿瘤DNA质量仍好 外科手术标本：可得足量肿瘤DNA，但DNA片段化 支气管镜、穿刺活检测标本：可得肿瘤DNA量少且片段化 胸水、肺泡冲洗液和痰液标本：肿瘤细胞含量不确定，通常很少
肿瘤基因突变检测标本
用于突变检测的标本
• 肺叶切除 • 肺段切除 • 支气管镜活检 • 细针穿刺活检
手术 病理评估合格的 标本适用于EGFR 基因突变检测 标本 细胞学 标本
• 支气管刷片 • 胸水
活检 标本 血液学 标本
• 血浆
• 血清
建议采用灵敏度 高的ARMS检测 方法
• 痰
肿瘤基因突变检测标本类型
• 石蜡组织标本
• 细胞学标本
1、胸水样本、心包积液、脑脊液等，建议在收到标本后两个小时内离心收集沉淀细胞进行 检测，如来不及操作可离心后将沉淀冻存至-20℃保存，等使用时取出；亦可将沉淀包埋成 蜡块后再切片检测； 2、或者将样本直接放置4℃保存过夜再离心收集沉淀，可能会一定程度影响DNA的完整性 ，但一般不影响实验结果。细胞学标本建议涂片后经病理诊断含有肿瘤后在进行检测。
• 肿瘤比例：标识肿瘤丰富的区域，提Biblioteka Baidu肿瘤细胞比例用于检测
尽量去除非肿瘤组织及细胞，提高检测的敏感性 不同敏感性的检测方法对肿瘤比例要求不一样 测序法：〉10% ARMS法：〉1%
• 固定包埋组织
• 细胞学标本 • 血液标本
血清、血浆标本：含肿瘤DNA，但含量不稳定，DNA片段化 循环血肿瘤细胞：可得较高质量肿瘤DNA，但量很少
1. Dacic S. Adv Anat Pathol 2008; 15(4):241-247. 2. Sequist LV, et al. Clin Cancer Res 2006; 12(14S):4403s-4406s. 3. Bai H, et al. J Clin Oncol 2009; 27(16):2653-2659.
• 冰冻标本
– 组织离体后立即速冻<1h
病理评估不达标样本导致EGFR突变检 测呈阴性结果
4 例肺肿块切除标本EGFR突变检测呈阴性
肺转移性肝细胞性肝癌
小细胞性肺癌
肿瘤细胞太少
未检测到肿瘤组织
Rubbish In; Rubbish Out
选择正确、合适的肺癌组织，是保证突变检测成功第一步及重要的步骤
• 细胞学标本中通常肿瘤细胞数目较少，需要采用灵敏度高的ARMS检测方法
• 建议有条件的病理科制备细胞蜡块：
– 处理流程：细胞学标本经离心处理后，常规福尔马林固定、处理及石蜡包埋即可 – 制备细胞蜡块的好处： （1）便于长期保存；（2）方便用于EGFR基因突变的检测及其他分
子生物学标记物的检测
四、胸水标本处理流程
标本的病理评估内容
• 诊断：确保肿瘤组织是非小细胞性肺癌 • 肿瘤量：确保有足够的肿瘤组织用于突变检测 尽量保证200-400个肿瘤细胞 对于技术成熟的实验室，可以尝试进行<200个肿瘤细胞的标本检测
5-10uM 10张切片能满足突变检测需求
当细胞数较少时,可以适当增加切片数,以满足检测需求
不同类型标本处理方式
• 新鲜组织标本：
• 1、迅速低温放置，如有条件可放置-80℃或者液氮保存，如果没有条件可使用-20℃保 存，但是保存时间不宜太久； 2、放入组织保存液中保存，组织保存液的能渗透0.5cm厚度的组织，因此用组织保存液 保存时，建议组织不宜过大。核酸在组织保存液中 37 ℃稳定存放1天，25 ℃稳定存放一 周，4 ℃ 1个月或–20 ℃长期存放 1、手术、穿刺、活检标本等放入10%中性福尔马林中固定后制作成蜡块，可保存数年之久 。(病理科常规处理样本方式)
支气管镜活检
标本较小 通常是福尔马林固定、石蜡包埋处理 建议采用灵敏度高的ARMS检测方法
细针穿刺活检
标本较小 通常是福尔马林固定、石蜡包埋处理 建议采用灵敏度高的ARMS检测方法
细胞学标本
涂片、染色 胸水或支 气管刷片 或痰液 液基细胞学
细胞蜡块，切片染色
病理诊断 病理诊断 病理诊断