组蛋白甲基化检测技术的研究进展

Histone Methylation Research technology

文璐综述张纯陈燕审校

【摘要】基因组含有两类遗传信息，一类是传统意义上的遗传信息，即DNA序列所提供的遗传信息。另一类是表观遗传学信息，它提供何时、何地以何种方式去执行遗传信息的指令。组蛋白甲基化修饰是表观遗传学的重要部分，近年来其检测技术取得了迅猛发展。本文对目前使用的组蛋白甲基化检测方法进行综【关键词】表观遗传学；组蛋白甲基化；检测；

表观遗传学（epigenetics）以不涉及DNA序列变化的、可遗传的基因表达调控信息传递为主要研究内容。“组蛋白密码”是其重要部分 [1]。核心组蛋白上的共价修饰，在真核细胞的染色质结构重塑和基因表达调控方面起重要作用[2]。组蛋白甲基化作为一个关键调节因素，被认为在基因表达的抑制或者活化，以及染色体结构域中发挥了关键作用。

研究表明在细胞核内，组蛋白甲基化和去甲基化过程处于动态平衡，两过程分别由组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶催化[3]。由此得知，组蛋白甲基化的位点和状态与两种酶的含量及活性密不可分。

近年来，组蛋白甲基化方面的检测技术取得了迅猛发展，一些独特的新实验技术已开始运用。本文对目前用于组蛋白甲基化及其相关酶类检测技术与方法作一篇综述。

组蛋白甲基化及其相关酶

1．组蛋白甲基化是指发生在H3和H4组蛋白N端精氨酸或者赖氨酸残基上的甲基化。目前发现24个组蛋白甲基化位点。甲基化可以是单=位点、双位点或三位点 [4]，共有3×1011种组蛋白甲基化组合状态。生物体则以组蛋白密码的方式发挥着各种生物功能。真核模型系统中，组蛋白H3K4、H3K36、H3K79甲基化与可遗传转录活力相关。在K9、K27发生的赖氨酸甲基化同基因抑制相关。甲基化的H3K9被发现与异染色质蛋白质-1结合在着丝粒周围，也见于其他遗传性染色体抑制区域，与着丝粒周围染色质凝集和X染色体失活有关[2]。综上所述，组蛋白甲基化的功能主要体现在异染色质形成、基因印记、X染色质失活和转录调控方面。

2．组蛋白甲基转移酶（histone methyltransferase,HMT）催化组蛋白甲基化。包括精氨酸甲基化转移酶（protein arginine methyltransferase,PRMT）和赖氨酸甲基化转移酶（histone lysine methytransferase,HKMT）。PRMT家族包括PRMT1、PRMT2、PRMT3、PMT1/HMT1、PRMT4/CARM1、PRMT5。PRMT家族中包含一个保守的催化核心区。由PRMT1和CARM1催化形成的不对称二甲基化组蛋白和基因活化有关，而由PRMT5催化形成的对称二甲基化组蛋白则与基因抑制有关。催化赖氨酸甲基化的酶被通称为含SET（Su(var),Enhancer of

zeste,Trithorax）结构域的家族，进化上高度保守[5],两侧有前SET域和后SET 域。HKMT有上百种，分为四大家族：SUV39、SET1、SET2、RIZ。SUV39家族具有前-SET域，该结构域使SET域特意作用于H3K9、H4K20发挥活性，被认为是组成性异染色质的主要决定因素。EZH2复合物属于SET1家族，催化H3K27甲基化，依赖PcG蛋白进行基因遏制[6]。SET2介导H3K36甲基化，发挥基因转录抑制功能。目前，对RIZ家族介导的甲基化研究甚少。

3．组蛋白去甲基转移酶（histone demethylation,HDM）LSD1/BHC110可以特异性将单、双甲基化的H3K4去甲基化，不能去三甲基化的赖氨酸[7]。后又发现一类含JmjC域的去甲基化酶，目前分为JHDM1、JHDM2和JHDM3三个家族。JHDM1针对H3K36me1去甲基化。JHDM2家族包括JMJD1A/JHDM2A, JMJD1B/JHDM2B，JMJD1C/JHDM2C/TRIP8三种蛋白。据推测人无毛蛋白HR属于JMJD1A/JHDM2A 家族,HR具有甲状腺受体转录辅阻遏物的功能[8]。JHDM3家族中JMJD2A/JHDM3A

针对H3K9me3/2和H3K36me3/2去甲基化，是重要的赖氨酸三甲基化特异性的去甲基化酶，发挥转录抑制活性。JMJD2B针对H3K9me3，JMJD2C/GASC1针对H3K9me3和H3K36me3,而JMJD2D针对H3K9me3/2，进行去甲基化[9]。

组蛋白甲基化检测

伴随表观遗传学的发展，一些独特的新技术随之产生。其中用于组蛋白修饰检测的技术以染色质免疫沉淀技术为核心，结合各种PCR技术和生物芯片技术，便可满足不同层次组蛋白修饰研究的需要。传统的Western免疫印迹技术在组蛋白修饰检测方面也有一定价值。此外，还可运用质谱分析技术来进行此类研究。1．染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation，CHIP）被广泛用于鉴定修饰后组蛋白及其他染色质相关因子在基因组的定位，是体内研究DNA-蛋

白质相互作用的强有力工具。此方法与生物芯片和分子克隆技术相结合,用于高通量的筛选已知蛋白因子的未知DNA靶点和研究反式作用因子以及特定的组蛋白修饰在整个基因组上的分布情况 [10]。CHIP 与PCR技术、Southern blot、狭缝杂交技术结合，为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用，全面阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。

CHIP技术一般有两种方法，区别在于不同的染色质处理手段。一种方法是使用标准微球菌核酸酶来消化细胞核，称为非变性染色质免疫沉淀（nChIP）,用来研究同DNA有高亲和力的蛋白，如组蛋白及其修饰后同工体等[11]；另一方法是在细胞中加入甲醛或者将细胞暴露在紫外线下使染色质交联，接着用超声波将染色质切割成小片段，这个方法被称为xChIP。如果研究者对研究同DNA结合亲和力不高的蛋白质有兴趣，如绝大多数非组蛋白的蛋白质，那么这个方法是唯一的选择。

组蛋白甲基化检测的研究，nChIP是适宜的选择。优点在于：1.可达到单核小体水平上的高分辨率。2.免疫沉淀所得的蛋白质复合物可直接用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，有助于把握免疫沉淀的效率。3.在nChIP准备阶段丢失的蛋白质可能会对附着有转录因子的修饰后核小体有帮助，而在xChIP中这些蛋白质一并被沉淀下来【2】。

原理：

细胞核用微球菌酶消化后释放出来的染色质可以通过蔗糖梯度离心来分离出单个核小体和双联核小体。然后利用特异性抗体将含有蛋白质或者修饰后蛋白质的染色质片段进行免疫选择。这样，就可以对特定位点基因或者位点上的蛋白质或者甲基化等修饰进行精确的基因定位。免疫沉淀染色质中抽提出的DNA序列内含物可以通过DNA印迹、或者PCR反应分析。

nChIP可分为四个步骤【2】：

Ⅰ. 染色质的准备：

提取细胞核，缓冲液重悬。微球菌核酸酶在20℃消化细胞核。注意：时间和酶剂量需按照细胞类型的不同而调整。

Ⅱ. 通过蔗糖梯度离心分离确切长度的染色质片段。

Ⅲ.特异性抗体进行非变性染色质免疫沉淀（nChIP）