新鲜冰冻血浆的病毒灭活方法及其应用

新鲜冰冻血浆的病毒灭活方法及其应用

新鲜冰冻血浆的病毒灭活方法及其应用

新鲜冰冻血浆（FFP）几乎含有全部凝血因子，主要用于多种凝血因子缺乏伴有严重贫血的患者，也用于大量失血或凝血试验异常而需要施行侵入性操作的患者以预防出血。虽然对FFP供者进行了严格的筛选和实验室病毒检测，但经血传播病毒的危险性仍然存在，原因在于：1）检测方法灵敏度有限；2）“窗口期”问题；3）新病毒的出现；4）目前我国检测病毒的种类仅为

HIV1/2、HBV、HCV；因此，检测结果阴性并不能排除病毒感染的可能。据估计，输用血浆的危险程度为10 000 U可发生75次不良反应，每1 000名患者有37起不良反应发生。1项研究在分析了48年来应用未经病毒灭活血浆和经病毒灭活血浆后发生不良反应需要救治的花费，发现应用病毒灭活血浆至少每年为美国节约200万美元，如果考虑非感染性并发症，如输血相关性急性肺损伤（TRALI），可以为英国每年节约5万英镑［1］。目前欧洲各国都已禁止使用未经病毒灭活的血浆，国内应用FFP非常广泛，但病毒灭活尚未普遍进行。目前国内外几种病毒灭活技术正

在临床应用，血浆成分及其衍生物主要采用有机溶剂去污剂法（SD）和亚甲兰加可见光法（MBR）,补骨脂素加光照血浆（PLT）已经在欧洲应用。核黄素加光照（PRT）对血浆、红细胞和血小板3种成分中的病毒可能均有灭活作用，但仍处于研发阶段；除SD法外其它灭活剂的作用都是针对病毒核酸的［2］。现就血浆病毒灭活的方法和应用作一简介。

1 SD法

1.1 灭活方法SD法由纽约血液中心发明，通常用磷酸3N丁酯（TNBP）和吐温-80或胆酸钠，二者协同作用可以溶解和去除病毒的脂包膜而使其灭活。SD法处理血浆是将＜2 500人份的同型、融化的FFP混合与1％TNBP和1％去污剂TritonX100，在37℃孵育4h，用蔬菜油浸出液萃取之后，用C18层析柱清除溶剂和去污剂。由此制备的血浆经无菌过滤，200ml分装，再次于-30℃冰冻保存。该法约使血浆稀释10倍，残留的微量TNBP(

1.2 优点SD通过破坏脂包膜病毒外膜结构的完整性或靶细胞受体识别位点，使之丧失感染

性，故对脂包膜病毒有较好的灭活效果。国外评价了几种病毒灭活方法后都认为，SD法对含脂包膜病毒的灭活效果最好，如HBV、HCV和HIV ［3,4］。实验表明SD处理可使黑猩猩感染HBV 和HCV的剂量（CID50）分别减少106和l05以上，使组织培养感染HIV的剂量(TCID50)减少106以上。SD法能有效杀灭非典型性肺炎（SARS）冠状病毒，但对非脂包膜病毒如HAV和B19病毒无灭活作用。研究证实经SD处理后的血浆蛋白质量合格，制备技术简单，有利于大规模生产和临床应用［5］，且不会导致红细胞溶血，不会影响血小板的形态及功能。研究还证实SDP中凝血因子和蛋白抑制因子（PI）在冻溶后4℃保存8h或常温保存6h均较稳定，融化后除了蛋白S （PS）外，所有凝血因子和PI的活性在融化后4℃储存6d至少还有0 5 IU/ml［6］，保持了较高的质量，应用效能和安全性也没有因为PS和纤维蛋白抑制因子活性降低而受到限制。SDP混合后可通过血浆抗体和过敏原的中和作用消除TRALI，也可明显减少过敏反应的发生，并可移除残余的血细胞、细胞碎片和细菌，移除血管性血友病因子（vWF）等大分子物质。从质量角度

而言，SDP汇集易于标准化，且易于过程质量控制，同一批中的各种凝血因子、纤维蛋白原(Fg)及总蛋白含量都是相同的，能给出准确含量，易于临床参照使用。1份研究报告显示，2×106U的SDP和11×106U经SD处理的血液制品输用后，尚未见发现病毒传播。因此认为SDP对临床使用有实际意义，适合大多数患者选择应用。

1.3 缺点SD法处理血浆后对凝血因子活

性影响很大，Doyle等［7］研究发现，经SD处理后，血浆FⅤ、FⅧ和PS分别下降31%、28%和50%；而Heger等［6］研究SDP在冻溶后4℃保存8h或常温保存6h后的凝血因子活性，发现FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ、vWF:Ag、Fg和PC（蛋白C）水平至少平均含有94%，FⅡ、FⅤ、FⅧ和抗凝血酶（AT）水平至少平均含有78%，立刻融化后FⅦ下降到83%，PS下降到43%，与FFP相比有很大差异，且FFP中FⅧ活性下降晚于SDP［8］。虽然经SD处理后血浆中各种凝血因子均有不同程度的下降，但是仍能满足临床的应用要求。从处理工艺上讲，大量混合后血浆原始成分可能发生变化，如大分子在vWF SDP及其制备的冷沉淀中缺失，在某种程度上又增加了感染病毒的危险

性，其后还需去除血浆中的稳定剂或有毒的化学物质，技术要求高，投资大，且SD法处理还不能对血浆中的未知病毒灭活。

1.4 临床应用SDP已成功地用于治疗DIC 和因大量输血引起的凝血因子缺乏的患者，临床适应证同FFP，即主要用于各种凝血因子缺乏的患者和血栓性血小板减少性紫癜的患者，不能用做血浆容量扩充剂和蛋白支持疗法。SDP可代替各种凝血因子制剂，用于心脏手术和各种创伤性失血、烧伤、低蛋白血症、各种失血性休克以及血液置换治疗，对于TTP的治疗效果也很好。SDP 副反应非常少，临床表现包括寒战、腹痛、气短等，总反应率为06％，发生变态反应比FFP 低。有研究对比较了应用SDP和FFP对心脏手术后患者凝血功能紊乱治疗的效果，发现它们均使Fg、FⅧ、AT、PC、游离PS、α1抗胰蛋白酶和纤溶酶原升高，PT和APTT下降，两者没有明显不同；但应用FFP后PS活性明显增加，PI 明显下降，对凝血酶原片段（F1+2），D二聚体（DD）或Fg降解产物（FDP）没有明显影响；两者临床止血效果无明显不同，均无不良反应，提示2种成分对改善止血和纤溶的效果一样，这

已经在严重的PS和PI缺陷的患者治疗中得到证实［9］。但是若患者有出血危险，准备外科手术或侵入性操作时，只能补充相应成分缺乏的血液，而不能应用SDP［10］。SDP中的Triton X100能够改变α2抗纤维蛋白酶活性，应用时应考虑可能发生纤溶的危险［11］，特别是对有肝病、继发性FⅤ缺陷和先天性或者获得性PS缺陷的患者应小心使用。

2 MBR法

2.1 灭活方法MBR法病毒灭活技术自20世纪90年代初期发展起来，目前主要集中于血浆病毒灭活的研究和临床应用，在欧美等发达国家己开展多年，是一项比较成熟的技术。MB属于吩噻嗪类染料，是一种光敏染料，可高效灭活含脂包膜病毒，包括逆转录病毒、疱疹病毒、囊膜病毒、黄热病毒等。MBR灭活病毒的原理为：不可逆的插入病毒核酸，诱导断裂缺口产生，导致病毒功能和遗传结构基础破坏，从而达到灭活病毒的效果。病毒灭活的效果与MB的浓度和接受光照的强度有关。实验证明极低浓度的

MB(001μg/ml)与卤素灯光照结合可高效灭活血浆中的模型病毒。1966年，Pohi首次使用MBR