细胞膜蛋白提取方法

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细胞膜蛋白的提取

细胞膜蛋白的提取

细胞膜蛋白的提取1. 引言细胞膜蛋白是细胞膜上的蛋白质,它们在细胞的结构和功能中起着重要的作用。

细胞膜蛋白具有多种功能,包括细胞识别、信号转导、运输和通道形成等。

为了研究细胞膜蛋白的结构和功能,科学家需要从细胞中提取这些蛋白质。

本文将介绍细胞膜蛋白的提取方法和步骤。

2. 细胞膜蛋白的提取方法2.1 细胞膜蛋白的提取原理细胞膜蛋白是细胞膜上的蛋白质,与细胞膜紧密结合。

因此,提取细胞膜蛋白需要破坏细胞膜,并保持蛋白质的完整性。

常用的细胞膜蛋白提取方法包括机械破碎法、化学溶解法和超声波法等。

2.2 机械破碎法机械破碎法是一种常用的细胞膜蛋白提取方法。

其步骤如下:1.制备细胞悬浮液:将培养的细胞收集,并用缓冲液洗涤,得到细胞悬浮液。

2.破碎细胞:将细胞悬浮液置于低温条件下,加入适量的缓冲液,然后用高速搅拌器或超声波破碎仪破碎细胞,使细胞膜破裂。

3.离心:将破碎后的细胞悬浮液进行离心,分离出上清液和沉淀。

4.收集上清液:将上清液转移到新的离心管中,这个上清液中含有细胞膜蛋白。

2.3 化学溶解法化学溶解法是另一种常用的细胞膜蛋白提取方法。

其步骤如下:1.制备细胞悬浮液:将培养的细胞收集,并用缓冲液洗涤,得到细胞悬浮液。

2.加入溶解剂:向细胞悬浮液中加入适量的溶解剂,如磷酸盐缓冲液或甘油,使细胞膜破裂。

3.搅拌:将细胞悬浮液与溶解剂充分混合,并用搅拌器搅拌一定时间,使细胞膜蛋白溶解在溶液中。

4.离心:将溶解后的细胞悬浮液进行离心,分离出上清液和沉淀。

5.收集上清液:将上清液转移到新的离心管中,这个上清液中含有细胞膜蛋白。

2.4 超声波法超声波法是一种快速、高效的细胞膜蛋白提取方法。

其步骤如下:1.制备细胞悬浮液:将培养的细胞收集,并用缓冲液洗涤,得到细胞悬浮液。

2.加入超声波溶解剂:向细胞悬浮液中加入适量的超声波溶解剂,如磷酸盐缓冲液,使细胞膜破裂。

3.超声波处理:将细胞悬浮液置于超声波处理器中,进行超声波处理,使细胞膜破裂。

提取膜蛋白的方法

提取膜蛋白的方法

提取膜蛋白的方法提取膜蛋白是一项关键的实验步骤,用于研究膜蛋白的结构和功能。

本文将介绍几种常用的膜蛋白提取方法。

1. 浸泡法浸泡法是一种简单的膜蛋白提取方法。

将细胞或组织样品置于适当的缓冲液中,如磷酸盐缓冲液或生理盐水中,并加入一些溶解剂(如阴离子洗涤剂)以破坏膜结构。

浸泡一段时间后,离心以分离出溶液中的膜蛋白。

2. 磷脂双层溶液法磷脂双层溶液法利用磷脂双层膜的特性来提取膜蛋白。

首先,将细胞或组织样品放入含有磷脂双层的液体中。

磷脂双层膜与细胞膜相似,可吸附并保持膜蛋白的结构和功能。

然后,用洗涤液洗涤磷脂双层,使膜蛋白释放到洗涤液中。

3. 超声法超声法是一种物理方法,通过超声波的能量来提取膜蛋白。

将细胞或组织样品置于含有缓冲液的管中,并使用超声波处理。

超声波的能量可以破坏细胞膜结构,使膜蛋白溶解到缓冲液中。

然后,对溶液进行离心,将膜蛋白分离出来。

4. 酸碱提取法酸碱提取法利用pH的变化来提取膜蛋白。

首先,将细胞或组织样品放入酸性或碱性溶液中,并搅拌。

酸性或碱性环境可以破坏细胞膜结构,使膜蛋白溶解到溶液中。

然后,通过调整pH值,使膜蛋白沉淀,进一步提纯。

5. 亲水基质法亲水基质法是一种通过亲水基质与疏水膜蛋白的选择性结合来提取膜蛋白的方法。

细胞或组织样品与亲水基质接触,亲水基质与细胞膜的亲水区域结合,使膜蛋白释放到溶液中。

然后,通过离心和洗涤步骤来分离和纯化膜蛋白。

这些方法在膜蛋白的研究中应用广泛,但根据具体的实验目的和样品特性,可以选择适合的方法进行膜蛋白提取。

实验中还应注意选择合适的缓冲液、溶液浓度和温度,并结合离心、洗涤等步骤进行蛋白的纯化和分离。

此外,需要根据实验目的选择合适的检测方法,如SDS-PAGE、Western blot等来确定提取的膜蛋白的质量和纯度。

总之,膜蛋白提取是膜生物学研究的重要一环,不同方法适用于不同的样品和实验要求。

正确选择和操作提取方法可以高效地提取膜蛋白,并为后续研究提供可靠的样品。

蛋白提取方法

蛋白提取方法

蛋白提取方法蛋白是生物体内一种重要的有机化合物,具有多种生物学功能。

在生物医学研究、食品工业、药物研发等领域,蛋白的提取和纯化是非常重要的工作。

本文将介绍几种常见的蛋白提取方法,希望能对相关领域的研究人员有所帮助。

1. 细胞裂解法。

细胞裂解法是一种常见的蛋白提取方法,它通过破坏细胞膜,释放细胞内的蛋白质。

通常采用机械方法(如超声波破碎、高压破碎)或化学方法(如洗涤剂裂解)来实现细胞裂解。

这种方法操作简单,提取效率较高,适用于大多数类型的细胞。

2. 亲和层析法。

亲和层析法是一种通过蛋白与特定配体之间的亲和作用来实现蛋白提取的方法。

常用的亲和层析配体包括金属离子、抗体、亲和标记物等。

通过将这些配体固定在固定相上,再将混合蛋白溶液通过柱子进行层析,从而实现对目标蛋白的选择性提取。

这种方法对蛋白的纯化效果较好,但成本较高。

3. 凝胶过滤法。

凝胶过滤法是一种通过分子大小差异实现蛋白提取的方法。

通常采用多孔性凝胶作为固定相,将混合蛋白溶液通过凝胶柱进行层析,从而实现对蛋白的分离和提取。

这种方法操作简单,对蛋白的形态和功能影响较小,适用于对蛋白分子大小要求较高的应用场景。

4. 盐析法。

盐析法是一种通过蛋白与盐溶液中离子相互作用的差异实现蛋白提取的方法。

在盐浓度逐渐增大的过程中,蛋白质的溶解度会发生变化,从而实现对蛋白的分离和提取。

这种方法操作简单,成本较低,适用于对蛋白的选择性提取要求不高的场景。

5. 超滤法。

超滤法是一种通过膜的孔径大小选择性分离蛋白的方法。

通常采用超滤膜将混合蛋白溶液进行过滤,从而实现对蛋白的提取。

这种方法操作简单,对蛋白的分离效果较好,但需要注意膜的选择和操作条件的控制。

总结。

蛋白提取是生物医学研究、食品工业、药物研发等领域中的重要工作。

本文介绍了几种常见的蛋白提取方法,包括细胞裂解法、亲和层析法、凝胶过滤法、盐析法和超滤法。

每种方法都有其特点和适用场景,研究人员可以根据具体的实验要求选择合适的方法进行蛋白提取工作。

膜-胞浆蛋白提取方法

膜-胞浆蛋白提取方法

膜-胞浆蛋白提取方法膜-胞浆蛋白提取方法膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒产品组成:产品组成规格试剂 A 试剂 B 试剂 C蛋白酶抑制剂混合物蛋白稳定剂BB-3111-150T 10ml 20ml 10ml 250μl 100ulBB-3111-2 100T 20ml 40ml 20ml 500μl 200ul储存条件:蛋白酶抑制剂、蛋白稳定剂-20℃保存;蛋白提取液2-8℃保存。

有效期:一年。

产品简介:哺乳动物跨膜蛋白承当各种生物功能,在疾病的发生、开展过程中扮演重要角色。

膜蛋白样品的制备需要充分考虑到与下游的胶分析^p 及质谱分析^p 等应用配套,因此膜蛋白样本制备成为一个难以逾越的挑战。

传统制备膜蛋白样品的方法是使用去污剂和外表活性剂增溶。

去污剂处理睬使膜蛋白丧失其天然构造,因此阻碍了膜蛋白的功能研究。

贝博膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒是一种基于化学而非去污剂方法的高产膜蛋白提取试剂盒。

本试剂盒提供配套试剂,适用于从细胞和动物组织提取膜蛋白和胞浆蛋白。

提取过程简单方便,可在1小时内完成。

提取的膜蛋白不仅纯度高,保持天然活性,而且绝少穿插污染。

提取的蛋白可用于Western Blotting、转录活性分析^p 、Gel shift凝胶阻滞实验、免疫共沉淀、酶活性测定等蛋白研究。

应用实例:1 4 4图片说明:用膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒提取细胞样本的'SDA-PAGE的电泳考染照片和Western照片。

图1泳道中1、4分别为Marker、膜蛋白样本。

图2为以上样品的EGFR的WB结果照片。

使用方法:A.细胞蛋白提取①1. 取5-10×106个以上细胞,在4℃,500g条件下离心2-3分钟,小心汲取培养基,尽可能吸干,搜集细胞。

2. 用冷PBS洗涤细胞两次,每次洗涤后尽可能吸干上清。

3. 细胞样品中参加200μl冷的试剂 A,2ul蛋白酶抑制剂混合物,2ul蛋白稳定剂,高速涡旋振荡15秒,置冰上10-15分钟。

细胞膜-胞浆-核膜蛋白分步提取方法

细胞膜-胞浆-核膜蛋白分步提取方法
蛋白提取步骤: 1. 提取液制备:每400ul 冷的蛋白提取液A/D 中加入分别加入2ul 蛋白酶抑制剂 混合物和2ul 磷酸酶抑制剂混合物,混匀后置冰上备用。 2. 取5-10×106 个细胞①,在4℃,1000rpm 条件下离心5-10 分钟,小心吸取培养 基,尽可能吸干,用细胞刮刀收集细胞。(组织样本50-100mg 剪碎,加冷PBS,用组
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
浴10 分钟,37℃下②1000g-2000g 力离心5 分钟,此时溶液分为两层
(对着光线看),上层为核内蛋白,下层是核膜蛋白约为20-40μl。小心移除上 层,用1-2 倍体积的提取液D 溶解下层即为细胞核膜蛋白。 9. 在步骤6 中所得到的上清(I)中加入5ul 提取液C,充分混匀。37℃水浴10 分钟。
10. 37℃下② 1000g 离心3 分钟,此时溶液分为两层(对着光线看),上层是胞浆
蛋白部分,下层是细胞膜蛋白部分约为40-50μl。 11. 将上清吸入另一预冷的干净离心管,即可得到胞浆蛋白。
12. 用80-200μl 冰冷的提取液D 溶解步骤10 中的下层部分,即得细胞膜蛋白。 13. 将上述蛋白提取物定量③后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验④。
织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体(或用液氮研磨),冰上静置5 分钟,小心将匀浆吸入 另一预冷的干净离心管。在4℃,500g 条件下离心2-3 分钟,弃上清。)
3. 用冷PBS 洗涤细胞两次,每次洗涤后尽可能吸干上清。 4. 每5×106 个细胞中加入400ul 冷的蛋白提取液A,混匀后,在4℃条件下用试 剂盒所配针筒反复吸吹细胞,使细胞完全破裂。 5. 在4℃,1000g 条件下离心5 分钟。 6. 快速将上清(I)吸入另一预冷的干净离心管,在沉淀中加入200μl 冷的提取液 B,高速涡旋振荡15 秒。 7. 将混匀的提取液B 置2-8℃振荡1-2 小时,至沉淀充分裂解,沉淀明显减少。8. 37℃水

蛋白质膜分离

蛋白质膜分离

蛋白质膜分离是一种实验技术,用于将细胞膜中的蛋白质与其他细胞组分分离开来,以便对其进行进一步的研究和分析。

这种技术常用于生物学和生物化学研究中,特别是在研究细胞膜蛋白的结构、功能和相互作用方面。

常见的蛋白质膜分离方法包括:
1. 亲和纯化:利用蛋白质与某些特定配体(例如抗体、配体分子等)之间的特异性相互作用,将目标蛋白质从混合物中纯化出来。

例如,可以使用标记有特定抗体的磁珠或琼脂糖柱进行亲和纯化。

2. 凝胶电泳:利用凝胶电泳技术,根据蛋白质的大小、电荷等特性将蛋白质从混合物中分离出来。

常用的凝胶电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和原位凝胶电泳(Native PAGE)。

3. 离心分离:利用离心技术,将细胞裂解液或组织匀浆在不同离心速度下离心,从而分离出不同密度或大小的细胞组分。

通过不同离心速度的选择,可以将膜蛋白从其他细胞组分中分离出来。

4. 超声波破碎:利用超声波对细胞进行破碎,将细胞膜破碎释放出的膜蛋白与其他细胞组分分离开来。

5. 亲水性与疏水性分离:利用膜蛋白通常具有的疏水性和亲水性特点,采用相应的溶剂或条件将其从其他细胞组分中分离出来。

例如,可以利用疏水性相互作用将膜蛋白从细胞溶液中提取到有机溶剂中。

这些方法通常会根据具体的研究目的和实验条件进行选择和优化,以达到最佳的分离效果。

在实际操作中,常常需要结合多种方法进行蛋白质膜的分离和纯化。

提取蛋白质的具体步骤

提取蛋白质的具体步骤

提取蛋白质的具体步骤
提取蛋白质是生物学研究中常见的实验操作,下面将介绍一种常用的蛋白质提取方法。

我们需要准备样品。

样品可以是细胞、组织或血清等,根据实验需要选择相应的样品。

第一步是细胞破碎。

将样品加入破碎缓冲液中,用超声波或高压细胞破碎机进行破碎,使细胞膜破裂释放细胞内的蛋白质。

第二步是离心。

将破碎后的混合液进行离心,以分离出蛋白质。

离心条件可以根据实验需要进行调整,一般为12000转/分钟,离心时间为15分钟。

第三步是蛋白质沉淀。

将上一步得到的上清液转移至新的离心管中,加入沉淀剂(如三氯醋酸或酒精等),使蛋白质沉淀。

沉淀剂的添加量要根据实验需要进行调整,一般为上清液体积的1/4。

第四步是离心沉淀。

将蛋白质沉淀进行离心,以分离出蛋白质。

离心条件与前面相同。

第五步是去除上清液。

将上清液倒掉,保留蛋白质沉淀。

第六步是蛋白质溶解。

将蛋白质沉淀加入蛋白质溶解缓冲液中,通过振荡或轻微加热使蛋白质完全溶解。

第七步是蛋白质浓缩。

可以利用浓缩管或离心浓缩器对蛋白质溶液进行浓缩,使蛋白质浓度增加。

第八步是蛋白质纯化。

根据实验需要选择相应的蛋白质纯化方法,常见的有离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。

将纯化后的蛋白质用适当的缓冲液储存或直接用于后续实验。

通过以上步骤,我们可以从样品中提取到目标蛋白质。

这是一种常用的蛋白质提取方法,可以根据实验需要进行相应的优化和改进。

红细胞膜制备

红细胞膜制备

两种提取红细胞膜蛋白方法的比较在制备抗血型抗原单克隆抗体时,为了提高红细胞血型抗原的免疫效果,获得更多的阳性克隆,我们比较了两种提取红细胞膜蛋白的方法。

1 材料和方法1.1 低渗溶血法粗提红细胞膜蛋白1.1.1 方法一 略有改良 取25 ml A(或B ) 型抗凝混合血加0.01 mol/L PBS ( pH7.4),离心3000 r/min ,20 min ,弃上清和上清下的白细胞、血小板层。

用相当于红细胞压积3倍的预冷PBS(pH7.4)洗涤3次(4 ℃ 5 000 r/min,15 min) 。

加预冷的0.01 mol/L Tric-HCl(pH7.4)与红细胞(V V=401)∶∶混合,4℃放置2 h 。

再以9 000 r/min 离心20 min ,弃上清(重复3~5次)至无肉眼可见的红细胞为止。

沉淀物加0.01 mol/L PBS(pH7.4)置-20℃保存。

1.1.2 方法二 略有改进 4 ml A(或B)型血加40 ml NS,离心2 000 r/min,20 min,洗3次。

沉淀物加入40 ml 预冷蒸馏水,离心5 000 r/min,10 min ,洗4次。

因沉淀物中仍有少量红细胞,故加40 ml 0.01 N 冰醋酸,置4 2 h ℃后离心9 000 r/min ,15 min 。

沉淀物加4 ml NS 混匀后,再加0.2 ml 0.1 N NaOH ,生 物 秀室温30 min,离心转速同上,弃上清后加4 ml NS,用0.1 N HCl(约0.1 ml)调pH 至7.4。

紫外分光光度计测蛋白含量。

1.2 红细胞膜抗原的活性测定1.2.1 血凝抑制试验 将提取的A(或B)型红细胞膜蛋白倍比稀释,分别加相应抗体(原液~1128∶倍比稀释),震摇后置室温1 h ,再加入2%A 或B 型红细胞,水平振荡20 min,室温静置1 h 观察结果。

另用A 或B 型红细胞代替A 或B 型红细胞膜蛋白作为对照。

细胞膜蛋白的提取方法

细胞膜蛋白的提取方法

细胞膜蛋白的提取方法
生物侠们,还在实验室奋战吗?还在为科研经费不够发愁吗?今天我就给各位通宵达旦的大侠们带来一个福音。

下面就让我替他给你讲讲,抓紧时间啊!
首先你需要一株需要提前膜蛋白的细胞、NP40、氯化钠、Tris-Hcl、SDS、脱氧胆酸钠和PMSF,东西齐全了,就开始配裂解液吧。

下面是配方哦!
RIPA Buffer For100ml:
150mM NaCl5ml3M NaCl
50mM TrisHCl pH8.05ml1M TrisHCl pH8.0
1mM EDTA pH8.00.2ml0.5M EDTA pH8.0
1%NP-405ml20%NP-40
0.1%SDS1ml10%SDS
0.1%Deoxycholate100mg Deoxycholate
那东西都齐全了,那么来开始讲步骤吧!
1.收集细胞,将1000转离心收集的(最好低温哦)细胞悬于裂解液中20分钟;
2.就12000离心吧,收集沉淀哦;
3.在加入裂解液;
4.然后超声10-15次,每次2秒,间隔15秒;
5.再12000低温离心,收集上清,开始做实验咯!。

提取细胞总蛋白的原理

提取细胞总蛋白的原理

提取细胞总蛋白的原理细胞总蛋白是指在细胞裂解液中含有的所有蛋白质的总和。

提取细胞总蛋白是生物学研究中非常基础且重要的实验操作,可以用于研究细胞生物学、分子生物学和生物化学等多个领域。

下面我将详细介绍细胞总蛋白提取的原理及其步骤。

细胞总蛋白提取的原理:细胞总蛋白提取的原理主要基于细胞膜的破裂和蛋白质的释放。

细胞膜是由脂质双层和蛋白质组成的,通过物理(如超声波、剪切力等)或化学(如洗涤剂、酸碱溶液等)方法可以破坏细胞膜的完整性,使细胞内的蛋白质释放到溶液中。

细胞总蛋白提取的具体步骤:1. 细胞培养和收获:首先需要选择合适的细胞种类,并将其培养在培养基中。

当细胞达到一定数量和生长状态时,使用适当的方法将细胞收获到离心管中。

2. 细胞裂解:将收获的细胞沉积物加入适量的细胞裂解缓冲液中,并进行细胞的破碎和破裂。

可以使用物理方法如超声波震荡、剪切力等,也可以使用化学方法如洗涤剂(如Triton X-100、NP-40等)或酸碱溶液来破坏细胞膜。

3. 离心:在细胞裂解液中存在着细胞碎片、细胞器和细胞核碎片等杂质。

通过高速离心将这些不溶性物质沉淀下来,得到澄清的上清液。

4. 蛋白质沉淀:将上清液中的蛋白质沉淀下来,有多种方法可以进行,如酒精沉淀法、醋酸沉淀法、盐析法等。

通常情况下,使用酒精沉淀法可以得到较高的蛋白质纯度。

5. 脱脂:将蛋白质沉淀通过洗涤去除各种杂质和溶解剂,以净化蛋白质。

6. 干燥:蛋白质沉淀溶于适量的蛋白溶液中,并将其沉淀沉淀,通过气体吹干或真空干燥的方法干燥蛋白质。

7. 储存:将干燥的细胞总蛋白保存在低温(-20或-80)条件下,以防止蛋白质的降解和氧化。

细胞总蛋白提取的注意事项:1. 在进行细胞裂解时,要选择适当的条件和方法,以保证细胞膜的完整性破裂,并确保蛋白质的完整释放。

2. 在提取过程中要避免发生蛋白质的降解和氧化,可以添加蛋白酶抑制剂和抗氧化剂等。

3. 在细胞提取过程中要注意无菌操作,避免细菌或其他污染物的存在。

细胞膜蛋白wb制样

细胞膜蛋白wb制样

细胞膜蛋白wb制样细胞膜蛋白WB制样细胞膜蛋白是细胞膜上的一类重要蛋白质,它们在维持细胞结构完整性、参与细胞信号传导、调控细胞内外物质的转运等方面起着重要的作用。

为了研究细胞膜蛋白的结构、功能及其相互作用,科学家们开发了各种实验方法,其中细胞膜蛋白的免疫印迹(Western Blotting,WB)是一种常用而有效的技术手段。

细胞膜蛋白WB制样是指在WB实验中,对待测细胞膜蛋白进行样品制备和分离的过程。

下面将详细介绍WB制样的步骤和注意事项。

第一步是细胞膜蛋白的提取。

细胞膜蛋白广泛存在于细胞的膜结构中,因此需要通过细胞膜的裂解来获得细胞膜蛋白。

常用的方法有超声波破碎、冻融法等。

提取过程中需要添加蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂,以保护膜蛋白的完整性。

第二步是蛋白质的定量。

在WB实验中,需要知道待测蛋白的浓度,以便在后续步骤中加载适当的样品量。

常用的蛋白定量方法有BCA 法、Lowry法等。

第三步是蛋白质的电泳分离。

WB实验通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行蛋白质的分离。

在电泳过程中,蛋白质会按照其分子量大小在凝胶中迁移,从而实现蛋白质的分离。

第四步是蛋白质的转印。

将分离得到的蛋白质从凝胶上转移到聚乙烯膜(PVDF)或硝酸纤维膜(NC)上,以便进行后续的免疫检测。

转印可以通过湿式或半干式方法进行。

第五步是膜上蛋白的阻断。

在进行免疫检测之前,需要将膜上的非特异性结合位点进行阻断,以避免免疫试剂的非特异性结合。

常用的阻断剂有非脂奶粉、BSA等。

第六步是膜上蛋白的免疫检测。

将特异性的一抗与待测蛋白进行特异性结合,然后再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗结合,形成特异性的免疫复合物。

最后,通过添加显色底物,产生显色反应,从而观察待测蛋白的存在与数量。

细胞膜蛋白WB制样过程中需要注意以下几点。

首先,实验过程中需要保持洁净,避免污染。

其次,蛋白质的处理过程中需要加入蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂,以保护膜蛋白的完整性。

鉴定膜蛋白的实验方法及步骤

鉴定膜蛋白的实验方法及步骤

鉴定膜蛋白的实验方法及步骤全文共四篇示例,供读者参考第一篇示例:膜蛋白是位于生物膜上的一种蛋白质,它在细胞内外沟通信息,调节物质的运输和细胞的形态结构等功能。

鉴定膜蛋白的方法和步骤对于研究细胞生物学和生物化学具有重要意义。

下面将介绍一种常用的鉴定膜蛋白的实验方法及步骤。

实验方法:1. 细胞培养和膜蛋白提取:需要将感兴趣的细胞株培养至对数生长期,然后采用适当的方法将细胞破碎并获得含有膜蛋白的细胞膜。

2. SDS-PAGE分析:将膜蛋白样品进行SDS-PAGE电泳,将蛋白分离出来。

3. 免疫印迹分析:将膜蛋白从SDS-PAGE凝胶上转移到聚丙烯酰胺膜上,然后用特异性的抗体探测膜蛋白。

4. Western blot分析:用二抗结合辅助探测靶蛋白。

5. 膜蛋白鉴定:根据Western blot结果,确定膜蛋白的存在与否,并分析其表达水平。

实验步骤:1. 提取膜蛋白:将细胞经过适当处理(如超声波破碎、离心等)后,得到含有膜蛋白的细胞膜,采用适当的方法(如亚硝酸铝沉淀法)沉淀膜蛋白。

2. 蛋白定量:用BCA或Bradford方法测定蛋白浓度。

3. SDS-PAGE电泳:将膜蛋白样品加入含有SDS的样品缓冲液中,加热变性,然后在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。

4. Western blot:将凝胶电泳后的蛋白转移到PVDF或nitrocellulose膜上,用特异性抗体探测膜蛋白的存在。

5. 二抗结合:将与特异性抗体结合的二抗与酶标记共同作用于蛋白,然后用化学发光或显色底物观察膜蛋白。

通过上述实验方法及步骤,可以较为准确地鉴定膜蛋白的存在与表达水平,为深入研究膜蛋白的生物学功能和调控机制提供重要的实验数据。

希望以上内容对您有所帮助。

第二篇示例:膜蛋白是生物体中存在的一种具有重要功能的蛋白质,它主要存在于细胞膜中,起着传递信号、运输物质等重要作用。

鉴定膜蛋白的实验方法和步骤对于研究膜蛋白的功能和结构具有重要意义。

下面将介绍一种常用的鉴定膜蛋白的实验方法及步骤。

细胞膜蛋白的提取

细胞膜蛋白的提取

细胞膜蛋白的提取
细胞膜蛋白的提取可以通过以下步骤进行:
1. 细胞收集:从所需的细胞类型中收集足够数量的细胞。

可以使用细胞培养方法培养细胞,或者从活体组织中分离细胞。

2. 细胞破碎:将细胞用适当的方法破碎,以释放细胞内的蛋白。

可以使用机械方法(如超声波破碎器或高压细胞击碎器)或化学方法(如洗涤液或界面活性剂)来破碎细胞。

3. 蛋白质提取:使用适当的缓冲液或溶液将细胞破碎物悬浮并离心,以去除细胞碎片和细胞核。

随后,可以使用不同的方法来提取膜蛋白,例如溶解细胞膜并提取蛋白。

4. 蛋白质纯化:使用不同的技术来纯化细胞膜蛋白。

这包括以蛋白质的特定性质为基础的方法,例如亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等。

5. 蛋白质浓缩:将纯化的细胞膜蛋白浓缩到所需的浓度。

可以使用蛋白质浓缩技术,例如氨基酸纤维柱、浓缩管或旋转蒸发器等。

6. 蛋白质鉴定:利用蛋白质检测方法,如SDS-PAGE、Western blotting或质谱分析等,确定提取的蛋白质的纯度和数量。

细胞膜蛋白的提取过程需根据实验目的和具体需求来选择和优化各个步骤。

膜蛋白的分离方法

膜蛋白的分离方法

膜蛋白的分离方法
膜蛋白是一类位于细胞膜上的蛋白质,它们在细胞的代谢、信号传递、物质运输等方面起着重要作用。

以下是一些常见的膜蛋白分离方法:
1.超速离心法:利用超速离心机产生的强大离心力,将细胞膜和膜蛋白分离开来。

这种方法常用于制备纯净的细胞膜和膜蛋白。

2.电泳法:通过电泳技术,可以根据膜蛋白的电荷性质和分子量大小,将其分离开来。

电泳法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)等。

3.层析法:层析法是一种基于膜蛋白物理化学性质差异的分离方法。

常用的层析技术包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。

4.浮选分离法:利用浮力密度的差异,通过离心使不同密度的膜蛋白在溶液中分层,从而实现分离。

5.免疫沉淀法:基于抗体与抗原的特异性结合,使用特异性抗体将目标膜蛋白从混合物中沉淀出来。

6.密度梯度离心法:根据膜蛋白的密度差异,将其在密
度梯度介质中进行离心分离。

7.膜蛋白提取试剂盒:市面上有一些商业化的膜蛋白提取试剂盒,它们通常结合了多种分离技术,简化了膜蛋白的提取过程。

需要根据具体的实验需求和膜蛋白的特性选择合适的分离方法。

在膜蛋白分离过程中,需要注意保持膜蛋白的活性和稳定性,避免蛋白质的变性和降解。

膜蛋白的提取与分离资料

膜蛋白的提取与分离资料

膜蛋白的提取与分离膜蛋白的分离一、简介:1细胞质膜资料1895年,Overton从研究细胞透性得出"细胞膜由连续的脂类物质组成"。

1925年Gorter&Grendel:用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总面积,提出:"细胞膜是由双层脂分子组成"。

1935年Danielli&Davson:从测定膜的表面张力得出细胞膜的"三明治结构模型",即蛋白质-脂-蛋白质。

1959年Robertson:用电镜观察生物膜提出"单位膜模型",将膜的分子结构与超微机构统一起来厚度:2(暗)+3.5(亮)+2(暗)=7.5细胞质膜的主要功能概括如下:(1)为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境;(2)选择性的物质运输,包括代谢底物的输入与代谢产物的排除,其中伴随着能量的传递;(3)提供细胞识别位点,并完成细胞内外信息跨膜传递;(4)为多种酶提供结合位点,使酶促反应高效而有序地进行;(5)介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接;质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。

2膜蛋白虽动物细胞主要有9种膜脂,而膜蛋白的种类繁多,多数膜蛋白分子数目较少,但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。

根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式,膜蛋白可分为两大类型:外在膜蛋白、内在膜蛋白。

(1)外在膜蛋白为水溶性蛋白,靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合,因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来,膜结构并不被破坏。

(2)内在膜蛋白与膜结合非常紧密,一般讲只有用去垢剂(detergent)使膜解后才可分离出来。

获得大量有生物学活性的质膜蛋白对我们显得非常的重要。

附注:使用分级抽提方法获得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具备多跨膜区的整和膜蛋白,膜蛋白,到目前为止,仍然是蛋白组学的一个瓶颈,不管采用2-D技术也好,ICAT乃至proein microarray都还不能有效解决这一问题。

膜蛋白纯化方法范文

膜蛋白纯化方法范文

膜蛋白纯化方法范文膜蛋白是一类存在于细胞膜上的重要蛋白质,起着许多重要的生物学功能。

为了研究膜蛋白的结构和功能,需要对其进行纯化。

然而,膜蛋白的纯化相对困难,主要是由于其高度疏水的性质和复杂的表达、折叠和定位过程。

本文将介绍几种常用的膜蛋白纯化方法。

1.高速离心:高速离心是最常用的初步膜蛋白纯化方法之一、该方法利用差速离心将细胞破碎,得到胞浆和质膜颗粒的混合物。

然后通过多次离心,逐步提高离心速度,最终得到膜蛋白的富集颗粒。

2.界面活性剂提取法:界面活性剂提取法是一种广泛应用于膜蛋白纯化的方法。

该方法通过在非离子型或阳离子型界面活性剂存在下将膜蛋白从膜上溶解转移到溶液中。

通常选用的界面活性剂包括十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠和短链磷脂。

4.高效液相色谱:高效液相色谱是一种常用于膜蛋白纯化的分离技术。

该方法利用柱上填充的固定相,通过控制溶液中的成分在固定相和流动相之间的分配,实现膜蛋白的分离纯化。

常用的高效液相色谱包括离子交换色谱、凝胶过滤色谱、逆流色谱等。

5.电泳分离:电泳是一种通过电场作用将膜蛋白根据其大小和电荷分离的方法。

电泳可以分为凝胶电泳和非凝胶电泳两种。

凝胶电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-等。

非凝胶电泳主要包括等电聚焦电泳和二维电泳。

除了这些传统的膜蛋白纯化方法之外,还有一些新的技术在膜蛋白纯化中得到了应用,例如固相提取、膜抓捕技术、质谱分析等。

这些新技术的应用,为膜蛋白纯化带来了更高的效率和准确性。

总结起来,膜蛋白的纯化方法有很多,每种方法都有其适用的场景和特定的优缺点。

研究人员可以根据具体的实验需求和条件选择合适的纯化方法,以获得高质量的膜蛋白样品。

完整版膜蛋白提取

完整版膜蛋白提取

1别离组织膜蛋白的方法1、取组织,参加10ml Buffer A 于冰上充分匀浆.2、J6-HC离心机800rpm , 4 c离心10min后,所得上清液转入超速离心管.3、100000g , 4c离心1hr.弃去上清,沉淀用适量的Buffer B重悬,冰上孵育2hr后分装至EP 管, Eppendorf 台式离心机10000rpm , 4 c离心30min.4、收集所得上清液即为膜组份.Buffer A : 0.32M 蔗糖,5mM Tris-HCl (PH 7.5), 120mM KCl , 1mM EDTA,1mM EDTA,0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.Buffer B : 20mM HEPES (PH 7.5 ) , 10% 甘油,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA,0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.2取约0.1g肝组织,参加2ml粉碎缓冲液,冰浴中超声粉碎,每次20秒,间隔30秒,共3 次,4° c 105xg条件下离心2小时,上清液为胞浆蛋白,沉淀局部参加1ml胞膜蛋白提取液,超声粉碎,4.c 105xg条件下离心2小时,上清液为胞膜蛋白.样品蛋白含量测定采用酚试剂法.3我们实验室提取膜蛋白的方法如下:1.将细胞种于T75或T175的培养瓶中培养数天,细胞铺满瓶底后,吸去培养液.将PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%) 参加量以覆盖细胞为止,置于培养箱或在超净台内消化3〜5分钟,如仍未脱落瓶底,用吸管吹打,使细胞完全脱落.2.收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中,1000rpm离心10分钟,去上清液.3. 按2.5毫升(T75 ) /每瓶或5毫升(T175/每瓶参加冰冷的匀浆液(HEPES:50mM,PH7.4,MgCl2:3mM,EGTA:1mM )于离心管中,将溶液和沉淀转移到匀浆器中,匀浆.4.将匀浆液转入离心管中, 参加适量的Tris - HCl (50mM, PH7.4)4oC, 18000rpm (40000g) 10分钟.在沉淀中参加同前量的匀浆液,再匀浆,匀浆后参加适量的tris-HCl buffer. 4度18000rpm(40000g)离心,共离心三次.5.在最后一次离心彳#到沉淀中按250微升每瓶(T75)或500微升每瓶(T175)参加tris-HClbuffer,匀浆,取50微升匀浆液测量蛋白浓度.6.按实验要求,将匀浆分装于1毫升的Eppendoff管中,其于-80oC冰箱中待用.主要基于膜蛋白分子量较大,在40000g时易沉降来别离.做膜蛋白的免疫荧光, 可以用荧光抗体染色, 然后用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察,具体的protocol可以找到,就不多说了.需要注意的是,要弄清楚你所使用的一抗结合部位是在膜蛋白的胞外结构域还是胞内结构域,如果是胞外,可以直接染色;如果在胞内,那么需要用无水甲醇在-20度处理10min,使细胞膜通透,然后再用抗体孵育,这样抗体才能进入细胞内与蛋白结合. 一般对膜蛋白的提取都是采用梯度离心或者高速离心的方法别离,可是我们现有的离心机都无法到达所需要的转速,所以我们试着采用分布溶解分布沉淀的方法.1)预冷的pbs洗去组织血液,除去结缔组织、脂肪.2) 4 C剪碎,加bufferA玻璃匀浆器匀浆至无大块状物,10 C超声波10min ,重悬,再破碎5—10min.3)12000rpm 离心10min,沉淀用bufferB 重悬,20 C超声波10min.4)12000rpm 离心10min,沉淀用bufferC 抽提.5)12000rpm离心10min,所得上清含有9%的膜蛋白.6)12000rpm离心10min,沉淀加bufferD沸水煮5min , 12000rpm离心10min,上清含有1%的膜蛋白. bufferA: 40mM Tris basebufferB: 8M urea ,100mM DTT, 40mM Tris basebufferC: 6-7M urea, 0.2mmol/L PMSF,40mM Tris basebufferD: 1% SDS, 50mM DTT,25%Glycerol,in 0.4M Tris-HCl pH8.8我们做的是动物组织的膜蛋白,提出来电泳条带还可以,只是我们没有专一膜蛋白抗体来检测提出来的是否是膜蛋白.但是这个方法是可行的5三、蛋白提取操作步骤I实体组织蛋白的提取1、组织样本(200〜300mg)尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织,于冰上剪碎;2、组织样本中参加1mL Lysis Buffer (注:使用前,每mL Lysis Buffer参加1科L蛋白酶抑制剂和1科L 1M DTT ),置玻璃均浆器冰上均质30〜50次(或超声破碎细胞, 每次30 S ,3〜4次,每次间隔1 min),置于冰上冷却.均质或超声破碎细胞后应镜检,细胞破碎率不小于90%;3、将均浆液转移至冷的离心管中,于4C, 3000 rpm离心10 min,弃沉淀;4、取上清转移至新冷离心管中,于4 C , 14 000 rpm离心30 min ,所得上清转至新管中, 即为胞浆蛋白,分装冷冻保存;5、取沉淀,参加1mL冷的抽提Buffer,涡旋振荡混匀后,4c放置10〜15min;【注:因抽提Buffer在室温时会分层,请务必于4c混匀后参加】6、4 ℃ , 3000rpm离心5min ,取上清转移至新管(注意勿将沉淀带入上清),进行下步提取;7、置于37 c水浴10min;8、室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层〔含膜蛋白〕;【注:建议使用进口透明性较好的微量离心管,可见下层为含膜蛋白的有机相. 上下两层因均为透明,只在交界处有一折光线,需仔细观察才可见到.或室温静置30分钟〜1小时亦可见分层.以下亦同.】9、取下层,参加500d L冰冷灭菌水,4c放置5min; 10、置于37 c水浴10min; 11、室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层〔含膜蛋白〕;12、取下层,参加500d L冰冷灭菌水,4c放置5min;13、置于37 c水浴10min;14、室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层〔含膜蛋白〕;15、最终得到的下层即为膜蛋白提取物,BCA法测定蛋白含量〔因残留有机相可能影响测定结果,此含量为相对参考值〕,分装冷冻保存.6用RIPA强配方,把脱氧胆酸钠浓度调整至1.0%,同时参加NP-40和Triton X-100 ,浓度均为1%.我刚做了一个7次跨膜蛋白,LHR的WB.7提取总蛋白的方法不能用于膜蛋白的提取, 提供一个常用的方法:先别离膜,在提取膜蛋白. 这类方法在园子里有不少介绍. 我们实验室曾经采用蔗糖梯度超速离心别离膜,据说效果还可以.您可以试一下.呵呵——8细胞破碎后,先低速离心,除去未破碎的细胞和大的细胞碎片.保存上清,超速离心,可获得细胞膜.然后用detergent溶液萃取,就可以得到膜蛋白溶液了.9我有新的问题了...哪位仁兄有好的提取细胞膜蛋白的裂解液配方...我的膜蛋白总提不出来.我的细胞是HEPG2;目的蛋白是LDL受体;我的配方是这样的:4%CHAPS , 8 mol/L urea, 0.1 mmol/L leupeptin, and 1.5 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride但是总提不出来....急! ! ! ! !呵呵,CHAPS提取膜蛋白水平较差,尝试参加1%ASB-14 ,或者参加1 % Triton X-100,与CHAPS联合抽提.另外最好参加2M thiourea.祝好运1.6% Triton X-100, 5 mol/L urea, 0.1 mmol/L leupeptin, and 1.5 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride ;2M thiourea; thiourea很贵吗我现在没有,又要急着用,能不能不用thiourea??thiourea不是很贵,merck250g才300多rmb.电泳时可以考虑用ASB-14 , sb3-10.没有的话,提取最好加点NP-40, 2M thiourea还是要的,要是有TBP就更好了.NP lysis buffer.NP 配方,stock solution 20ml (50mM Tris-HCL (PH8.0), 5mMEDTA, 0.05%NaN3, 0.14M NaCL, 100mM NaF), 1% Nonidet P40, 0.2TIU/ml aprotinin, 1.5uM pepstatin A, 20mM Iodoacetamide.NP配好后分装,-80度保存.用之前,参加NaV和PMSF.混匀后立即置于冰上.10如果你研究的蛋白表达比拟丰富没有必要提取膜蛋白,直接用RIPA裂解液裂解后离心取可溶性蛋白变性做WB就可以了;如果你蛋白的含量低或抗体特异性很差的话,你应该用试剂盒或超速离心提取膜蛋白,可以起到富集和纯化的作用,使你更容易得到好的结果!11RAPI的裂解液只能说是强的非变性裂解液,而算不上是强的变性裂解液.提取膜蛋白一般都在变性条件下才可以.所以,你应该改用其他更适合的强的变性裂解液,如含SB3-10、DM、ASB-14等膜助溶剂,或者SDS-Bolied loading bufffer,2-D 裂解液7M thiourea+2M urea 也可以12组织膜蛋白提取:所在操作冰上进行(1)取组织,用PBS冲洗干净组织上的血液.参加10ml Buffer A ,用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆.每次30秒,重复3-5次.(2)离心机1000rpm , 4 C离心10min后,所得上清液转入超速离心管.(去掉大块组织及结缔组织)(3)100000g, 4c离心1hr,弃去上清.(此为胞浆蛋白,假设只提取胞浆蛋白,可用10000rpm, 4 度,30分钟离心,取上清即可).沉淀用适量的Buffer B重悬,4度过夜后,分装至EP管, Eppendorf 台式离心机10000rpm, 4 C 离心30min.(4)收集所得上清液即为膜组份.Buffer A :0.32M 蔗糖,5mM Tris-HCl (PH 7.5), 120mM KCl , 1mM EDTA, 1mM EGTA,0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.Buffer B 20mM HEPES (PH 7.5), 10% 甘油,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM , PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.所得蛋白分装EP管(每管约50ul),取一管测蛋白浓度,其它放入-70度深冻冰箱保存.如果要定量的话,最好能立即根据浓度,参加上样缓冲,煮沸, 4度保存.反复冻融蛋白会降解,浓度不准.13我用来抽提大鼠脑组织细胞膜蛋白方法:取两只大鼠的整个脑组织,参加10ml Buffer A 于冰上充分匀浆.J6-HC离心机800rpm , 4 C离心10min后,所得上清液转入超速离心管.100000g, 4c离心1hr.弃去上清,沉淀用适量的Buffer B重悬,冰上孵育2hr后分装至EP管,Eppendorf台式离心机10000rpm, 4 C 离心30min.所得上清液即为膜组份.Buffer A : 0.32M 蔗糖,5mM Tris-HCl 〔PH 7.5〕,120mM KCl , 1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mMPMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.Buffer B : 20mM HEPES 〔PH 7.5〕, 10%甘油,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin .冰上预冷.CHAPS〔一种离子去污剂〕是提取膜蛋白的常用试剂一般用10mMol的浓度即可,你可以试试加到你的Buffer中,看效果如何.不过此药品很贵!lysis buffer的选择依赖于你所研究蛋白质的位置和性质:1〕细胞浆蛋白〔可溶性〕:Tris Buffer2〕细胞浆蛋白〔结合到细胞骨架〕:Tris-Triton buffer3〕膜结合蛋白:Np-40或RIPA4〕核蛋白:RIPA5〕线粒体蛋白:特殊的抽提裂解液6〕全细胞蛋白:Np-40 or RIPAWestern blotAdipose tissue membrane protein was extracted from approx. 20mg of adipose tissue. PAGE was performed according to Laemmli [ 8]. A portion of 2 g of adipose t issue membrane protein was applied per lane. In addition, 10 q of mononuclear cell membrane protein 〔corresponding to 1.7 106 mononuclear cells〕 was applied and used as a positive control for verification of blotting, incubation and detection. Tank blotting to nitrocellulose was performed according to standard protocols, with transfer for 3h at 70V and 15 C.°The blots were incubated with 1 闵/ml rabbit anti-〔human b2-adrenoceptor〕 IgG 〔Santa Cruz Biotechnology Inc.〕, and were then re-incubated with alkaline phosphatase-labelled goat anti-rabbit antibody. Detection was performed using DDAO [9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one-7-yl)] phosphate (Pro-Q Western Blot Stain Kit; Molecular Probes Inc.) on a Fujifilm FLA-3000 instrument.Quantification of b2-adrenoceptor protein was performed by determining the fluorescence intensity of b2-adrenoceptor-antibody-immunoreactive bands. The concentration of b2-adrenoceptor protein is expressed as the intensity of the immunoreactive bands of the tissue samples in relation to the intensity of the immunoreactive bands of the mononuclear cell membrane protein internal standard. Like others before us trying to isolate the b2-adrenoceptor [9], we observed several immunoreactive bands on our Western blots ( Figure 1). On all blots we found a single major band at 57kDa and several smaller immunoreactive bands (38-52kDa). Theb2-adrenoceptor is known to have a molecular mass of 64kDa and to be very fragile, so the immunoreactive bands on our blots must represent proteolytic degradation products and/or secondarily modified b2-adrenoceptor. When trying toquantify the receptor it is therefore uncertain whether to include all visible bands [total band area (T)] or to include only the single major band (S). We have done both. Figure 1 shows the area included in determining the intensity of the single major band and total band area intensity.All blots were loaded with the same amount of membrane protein per well, but since we wished to determine the level of protein expression in relation to individual cells, the concentration is expressed as intensity of b2-adrenoceptor protein per ng of DNA. The coefficient of variation based on 13 double determinations was 28% for total band area determinations and 29% for single major band determinations14凯基膜蛋白提取试剂盒凯基膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒一、描述:本试剂盒提供独特的组份提取细胞及组织中的膜蛋白.其原理是裂解细胞后,先离心别离出质膜粗提物,再利用特殊的抽提Buffer,选择性地别离提取膜蛋白,抽提Buffer含一种特殊的去污剂,在4c时所有的蛋白质均可都溶于抽提Buffer,但在37c时,抽提Buffer分为水相和去污相;此时亲水性蛋白溶于水相,疏水的膜蛋白溶于去污剂相中,根楣该性质别离出膜蛋白.产物不仅含细胞膜蛋白,也含胞器质膜蛋白.提取方法简单,可靠, 快速.获得的膜蛋白纯度高,可用于PAGE电泳、Western Blot、免疫共沉淀等后续研究. 二、试剂盒组份三、蛋白提取操作步骤I实体组织蛋白的提取1、组织样本〔200〜300mg〕尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织,于冰上剪碎;2、组织样本中参加1mL Lysis Buffer 〔注:使用前,每mL Lysis Buffer参加1科L蛋白酶抑制剂和1 ^L 1M DTT 〕,置玻璃均浆器冰上均质30〜50次〔或超声破碎细胞,每次30 S ,3〜4次,每次间隔1 min〕,置于冰上冷却.均质或超声破碎细胞后应镜检,细胞破碎率不小于90%;3、将均浆液转移至冷的离心管中,于4C, 3000 rpm离心10 min,弃沉淀;4、取上清转移至新冷离心管中,于 4 C , 14 000 rpm离心30 min ,所得上清转至新管中, 即为胞浆蛋白,分装冷冻保存;5、取沉淀,参加1mL冷的抽提Buffer,涡旋振荡混匀后,4c放置10〜15min;【注:因抽提Buffer在室温时会分层,请务必于4c混匀后参加】6、4 ℃ , 3000rpm离心5min ,取上清转移至新管〔注意勿将沉淀带入上清〕,进行下步提取;7、置于37 c水浴10min;8、室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层〔含膜蛋白〕;【注:建议使用进口透明性较好的微量离心管,可见下层为含膜蛋白的有机相. 上下两层因均为透明,只在交界处有一折光线,需仔细观察才可见到.或室温静置30分钟〜1小时亦可见分层.以下亦同.】9、取下层,参加500d L冰冷灭菌水,4c放置5min;10、置于37 c水浴10min;11、室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层〔含膜蛋白〕;12、取下层,参加500d L冰冷灭菌水,4c放置5min;13、置于37 c水浴10min;14、室温,13 000rpm离心5min ,样品分成上层和下层〔含膜蛋白〕;15、最终得到的下层即为膜蛋白提取物,BCA法测定蛋白含量〔因残留有机相可能影响测定结果,此含量为相对参考值〕,分装冷冻保存.四、SDS PAGE电泳操作步骤1、进彳T PAGE电泳前,取该提取物,每100 dL膜蛋白提取物,参加约300 dL的溶解Buffer 和约100 dL三氯乙酸〔TCA〕试剂, 混匀后置冰上20〜30 min后,13 000rpm ,离心15 min ,尽可能除去上清;2、沉淀参加1mL丙酮,室温静置10min后,13 000rpm离心15 min;3、弃上清,沉淀真空旋干或置冰上枯燥约10 min 〔敞开离心管盖〕,参加适当体积的LoadingBuffer 〔使用前每100 ^L Loading Buffer参加2〜5dL疏基乙醇〕溶解,彻底分散〔枪头反复吹吸或剧烈涡旋〕;【注:参加Loading Buffer后如有局部难溶物,可取上清继续上样;如参加Loading Buffer 后澳酚蓝转呈黄色,此为少量TCA残留所致,不影响电泳结果.请参照Marker标准.】4、上样进行SDS PAGE电泳.五、考前须知:1、所有的试剂及器具均需预冷后使用.细胞或组织量需到达要求.2、抽提Buffer 4 C时,为混悬状态,请于此温度下混匀后吸取参加粗提物中.3、室温25c〜37c时,抽提Buffer需静置30分钟以上可看到分上下两层,其中约9/10 至4/5为上层水相,下层只占1/10至1/5为有机相.4、因产品采用不透明的包装瓶,因此无法观察到上述分层现象,可将该BUFFER倒入玻璃烧杯或试管中静置30分钟〜1小时可见分层.5、TCA试剂具强腐蚀性,操作时请带适宜的手套并注意防护.六、储存蛋白酶抑制剂-200C, Loading Buffer室温保存,其余40C,保存一年。

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中间涡旋振荡混匀 2 次。 5. 再次高速涡旋振荡 5 秒,然后在 4℃,500×g 条件下离心 3 分钟,弃沉淀。 6. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管,加入 10ul 试剂 B,充分混匀。 7. 37℃水浴 10 分钟。 8. 在 37℃ 1000×g 离心 5 分钟。 9. 此时溶液分为两层,小心吸取分离出管底部大约 20ul 液体。 10. 用适量稀释液 C 稀释该溶液,即得膜蛋白样品。 11. 将上述蛋白提取物定量②后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验③。
1. 提取液制备:每 200ul 蛋白提取液 A 和 C 中分别加入 2ul 蛋白酶抑制剂混合物, 混匀后置冰上备用。
2. 取 5-10×106 个细胞①,在 4℃,500×g 条件下离心 2-3 分钟,小心吸取培养基, 尽可能吸干,收集细胞。
3. 用冷 PBS 洗涤细胞两次,每次洗涤后尽可能吸干上清。 4. 在细胞沉淀中加入 200μl 冷的提取液 A,高速涡旋振荡 15 秒,置冰上 20 分钟,
使用本产品发表的部分新文献:
● Ge Zhao, Siyuan Li, Wei Zhao et al.
Phage Display against Corneal Epithelial Cells
Produced Bioactive Peptides That Inhibit Aspergillus Adhesion to the Corneas
产品号 BB-3108 BB-3103 BB-3401 BB-3721 BB-3151 BB-3124 BB-3152 BB-3301 BB-3311 BB-3703
细胞膜蛋白提取试剂盒
产品组成:
产品组成 规格
提取液 A 提取液 B 膜蛋白稀释液 C 蛋白酶抑制剂混合物
BB-3116-1 50T 10ml
500ul 10ml 250ul
BB-3116-2 100T 20ml 1ml 20ml 500ul
储存条件: 蛋白提取液 2-8℃保存;蛋白酶抑制剂-20℃保存;稀释液 C 室温保存。
有效期: 一年。
产品简介: 贝博细胞膜蛋白提取试剂盒提供全套试剂,适用于从各种原代或传代细胞样本中提取
膜蛋白,提取的膜蛋白纯度高,不含核膜蛋白和胞浆蛋白。提取过程简单方便,可在 1 小时 内完成。制备的膜蛋白保持天然活性,而且绝少交叉污染。提取的蛋白可用于 Western Blotting、转录活性分析、Gel shift 凝胶阻滞实验、免疫共沉淀、酶活性测定等蛋白研究。 使用方法:
产品号 BB-3101 BB-3102 BB-3411 BB-3501 BB-3121 BB-3122 BB-3123 BB-3125 BB-3105 BB-3702
产品 磷酸化蛋白富集试剂盒 膜蛋白提取试剂盒 BCA 蛋白定量试剂盒 蛋白 Marker 细菌膜蛋白提取试剂盒 植物总蛋白提取试剂盒 植物膜蛋白提取试剂盒 蛋白酶抑制剂混合物 磷酸酶抑制剂混合物 SDS-PAGE 上样 Buffer
PLoS ONE
2012 Volume 7, Issue 3,
(IF=4.4ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ1)
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