酶的生产方法

1949年，日本开始采用微生物液体深层培养方法 年 进行细菌ａ 淀粉酶的发酵生产 淀粉酶的发酵生产， 进行细菌ａ-淀粉酶的发酵生产，揭开了现代酶制剂 工业的序幕。 工业的序幕。 20世纪 年代发展起来的动、植物细胞培养技术， 世纪80年代发展起来的动 植物细胞培养技术， 世纪 年代发展起来的动、 继微生物发酵生产酶之后， 继微生物发酵生产酶之后，已成为酶生产的又一种途 径。
一、发酵产酶的一般工艺流程
无论哪种发酵法，都要做三方面的工作： 无论哪种发酵法，都要做三方面的工作： （1）从原料准备培养基； 从原料准备培养基； （2）从原始菌种准备生产菌种； 从原始菌种准备生产菌种； 发酵过程管理。 （3）发酵过程管理。
[原 料 ] 原 饼粕等原料 ↓ 按不同原料 作不同处理 淀粉质原料 ↓ 净化、 净化、粉碎 ↓ 水解 ↓ [ 淀粉糖液 淀粉糖液] ↓ 配制培养基 (灭菌 灭菌) 灭菌
将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。
固定化原生质体发酵（80年代中期发展 年代中期发展） 4、固定化原生质体发酵（80年代中期发展）
原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。
第二节 酶生物合成的基本理论
一、酶生物合成的过程
转录 翻译
DNA
RNA
蛋白质（新生多肽链） 蛋白质（新生多肽链）
加工
成熟蛋白质（ 成熟蛋白质（酶）
米曲霉，黑曲霉， 制造葡萄糖，发酵、 米曲霉，黑曲霉， 制造葡萄糖，发酵、酿酒等 葡萄糖淀粉酶 米根霉 工业的淀粉水解糖 皮革、毛皮加工，食品加工， 皮革、毛皮加工，食品加工， 枯草芽胞杆菌， 枯草芽胞杆菌，米 调味品制造、助消化、消炎、 调味品制造、助消化、消炎、 曲霉 啤酒澄清 地衣芽胞杆菌 黑曲霉， 黑曲霉，毕赤酵母 工程菌株 加酶洗涤剂
中性蛋白酶
碱性蛋白酶 植酸酶
饲料添加剂
工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
纤维素酶 半纤维素 酶 β-葡聚糖 葡聚糖 酶 异淀粉酶 里氏木霉、 里氏木霉、黑曲霉 木霉、曲霉、 木霉、曲霉、根霉 枯草芽胞杆菌， 枯草芽胞杆菌，黑曲 霉，Penicillium emersonii 产气克雷伯氏菌， 产气克雷伯氏菌，芽 孢杆菌 水洗布生产，饲料添加剂， 水洗布生产，饲料添加剂， 消化植物细胞壁 饲料添加剂， 饲料添加剂，消化植物细胞 壁，低聚木糖生产
3、霉菌
黑曲霉：糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡 黑曲霉 萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、橙皮苷酶等。 米曲霉： 米曲霉：氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等。 红曲霉： 红曲霉：α-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。 青霉： 青霉：葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶、纤维素酶 等。 木霉： 木霉：纤维素酶。 根霉： 根霉：糖化酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶，脂肪酶、果胶酶、 纤维素酶、半纤维素酶等。 毛霉： 毛霉：蛋白酶、糖化酶、α-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、 凝乳酶等。
啤酒酿造，饲料添加剂 啤酒酿造， 淀粉加工
乳糖酶
乳酸酵母，米曲霉， 乳酸酵母，米曲霉， 乳品工业（处理牛乳和乳清） 乳品工业（处理牛乳和乳清） 黑曲霉， 黑曲霉，米根霉 曲霉、 曲霉、欧文氏菌 水果加工，果汁、果酒澄清， 水果加工，果汁、果酒澄清， 麻类纤维脱胶
果胶酶
工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
↓ [ 发酵液 ] ↓ ↓ ↓下游加工 ↓ 各种精制酶制剂} {各种精制酶制剂}
[ 成品曲 ]
{固体粗酶制剂} 固体粗酶制剂}
酶发酵生产的一般工艺流程图
保藏菌种
试管斜面培养（活化） 试管斜面培养（活化）
摇瓶扩大培养 种子罐培养 培养基 发酵罐 分离纯化 酶 无菌空气
二、酶生产菌种 （一）产酶菌种的要求
葡萄糖阻遏ß 葡萄糖阻遏ß-半乳糖苷酶的生物合成 果糖阻遏a 果糖阻遏a-淀粉酶的生物合成
B1 E A2 × B2
重点） 第三节 微生物发酵产酶工艺（重点）
发酵法生产酶制剂， 发酵法生产酶制剂，就是给酶的生产菌种提供适当的营养 和生长环境，使生产菌大量增殖，同时合成所需要的酶， 和生长环境，使生产菌大量增殖，同时合成所需要的酶，然后 由发酵所得物料制成酶产品。 由发酵所得物料制成酶产品。 现代酶制剂的大规模生产以深层液体发酵法为主。 现代酶制剂的大规模生产以深层液体发酵法为主。
三、酶发酵生产的类型 液体深层发酵： 1、液体深层发酵：
液体培养基，经灭菌、冷却后，接入产酶细胞，在一定条件 下发酵。
2、固体培养发酵
培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌 株，在一定条件下发酵。 。
固定化细胞发酵（70年代后期发展 年代后期发展） 3、固定化细胞发酵（70年代后期发展）
2、筛选 由自然界采集样品，如土壤、 动植物体等， 由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进 行分离筛选 。
）、常用的产酶微生物 （二）、常用的产酶微生物 1、细菌
大肠杆菌 谷氨酸脱羧酶、天冬氨 酸酶、青霉素酰化酶、天冬 酰胺酶、β-半乳糖苷酶、限 制性核酸内切酶、DNA聚合酶、 DNA连接酶、核酸外切酶等。
枯草杆菌 α-淀粉酶、蛋白酶、 β-葡聚糖酶、5‘-核苷酸酶、碱 性磷酸酶。
2、放线菌
链霉菌： 链霉菌：葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、碱 性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。
4、酵母
啤酒酵母：丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等。 啤酒酵母 假丝酵母： 假丝酵母：脂肪酶、尿酸酶、尿囊酸酶、转化酶、醇脱氢 酶等。
工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
酶 产酶微生物 枯草芽胞杆菌 地衣芽胞杆菌 米曲霉 用途
α-淀粉酶 淀粉酶
淀粉液化，织物退浆， 淀粉液化，织物退浆，消化 助剂， 助剂，加酶洗涤剂
分泌或定位
胞内
胞外
二、酶生物合成的调节
按酶生物合成的速度把细胞中合成的酶分为两类： 按酶生物合成的速度把细胞中合成的酶分为两类： 组成酶—恒定（速度、浓度） 组成酶—恒定（速度、浓度） 诱导酶— 诱导酶—
(适应型酶、 调节型酶)
在外界环境因素诱导下合成速 度急增， 度急增，酶浓度成百上千倍增 加
酶合成的基因调控类型：诱导和 酶合成的基因调控类型：诱导和阻遏
1、酶合成的诱导作用
加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象， 加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为 诱导作用。 诱导作用。 诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。 诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。 例：乳糖诱导ß-半乳糖苷酶的合成 乳糖诱导ß 淀粉诱导a 淀粉诱导a-淀粉酶的合成
2、酶合成的阻遏 （1）终产物阻遏
指酶催化反应的产物或代谢途 径的末端产物使该酶的生物合成受 到阻遏的现象。 到阻遏的现象。
色氨酸过量时会阻遏催化色氨酸合成的相关酶
× E A→→ →→ →B
分解代谢物阻遏（营养源阻遏） （2）分解代谢物阻遏（营养源阻遏）
是指某些物质经过分解代谢产生的物质 A1 阻遏其他酶合成的现象。 阻遏其他酶合成的现象。
二、应用微生物来开发酶的优点 1、微生物种类多，酶种丰富； 、微生物种类多，酶种丰富； 2、微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶； 、微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶； 3、微生物培养基来源广泛，价格便宜； 、微生物培养基来源广泛，价格便宜； 4、可采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程； 、可采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程； 5、可利用以基因工程为主的近代分子生物学技术选 、 育菌种，增加酶的产率和开发新酶种。 育菌种，增加酶的产率和开发新酶种。
酶的生产
酶的生产方法； 酶的生产方法； 酶生物合成的基本理论； 酶生物合成的基本理论； 发酵产酶的工艺条件及控制； 发酵产酶的工艺条件及控制； 酶发酵动力学； 酶发酵动力学； 固定化细胞和原生质体发酵产酶． 固定化细胞和原生质体发酵产酶．
酶的生产方法
1894年，美籍日人高峰让吉首先从米曲霉中制备 年 得到高峰淀粉酶（ａ 淀粉酶、他卡酶）， （ａ-淀粉酶 ），用作消化 得到高峰淀粉酶（ａ 淀粉酶、他卡酶），用作消化 剂，开创了近代酶的生产和应用的先例。 开创了近代酶的生产和应用的先例。 1908年，德国的罗姆（Rohm）用动物胰脏制得胰 年 德国的罗姆（ ） 用于皮革的软化。 酶，用于皮革的软化。 1908年，法国的波伊定（Boidin）制备得到细菌 年 法国的波伊定（ ） 淀粉酶，用于纺织品的退浆； 淀粉酶，用于纺织品的退浆； 1911年，华勒斯坦（Wallerstein）从木瓜中获得 年 华勒斯坦（ ） 木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。 木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。
第一节 酶的生产方法 凝乳酶 牛胃→凝乳酶 牛胃
一、酶的生产方法 1、提取法 采用各种技术，直接从动、 采用各种技术，直接从动、植物细胞或组织中将 酶提取出来。提取法虽简单易行， 酶提取出来。提取法虽简单易行，但受原材料来源的 限制。 限制。 2、化学合成法 世纪60年代中期出现的新技术 是20世纪 年代中期出现的新技术。 世纪 年代中期出现的新技术。 只能合成那些已知化学结构的酶；成本比较高。 只能合成那些已知化学结构的酶；成本比较高。 目前仍然停留在实验室内合成的阶段。 目前仍然停留在实验室内合成的阶段。
（1）产酶量高； 产酶量高； （2）繁殖快，发酵周期短； 繁殖快，发酵周期短； （3）产酶稳定性好，不易退化，不易被感染； 产酶稳定性好，不易退化，不易被感染； （4）能够利用廉价原料，容易培养和管理； 能够利用廉价原料，容易培养和管理； （5）安全性可靠，非致病菌。 安全性可靠，
新开发的酶必须按规定进行下表的各项检查 试验动物 急性中毒 鼠,大白鼠 大白鼠 口服 4周 周 大白鼠 12月 月 狗 致癌试验:24月 致癌试验 月 两重啮齿动物 畸胚组织发生试验(24月 畸胚组织发生试验 月) 两重啮齿动物 生产病原性试验 四种动物 皮肤刺激性试验(肤 眼 兔子,人 皮肤刺激性试验 肤,眼) 兔子 人 抗原性 人 项目
脂肪酶 葡萄糖氧 化酶 葡萄糖异 构酶 青霉素酰 化酶
（三 ）生产菌种的来源
1、买，专利 向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。 向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。
中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）； 中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）； 中国典型培养物保藏中心（CCTCC，又称武大保藏中心）。 中国典型培养物保藏中心（CCTCC，又称武大保藏中心）。 中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC）； 中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC）； 中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC） 中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC） 美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC） 美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC） 荷兰微生物菌种保藏中心（CBS） 荷兰微生物菌种保藏中心（CBS） 德国微生物菌种保藏中心（DSMZ） 德国微生物菌种保藏中心（DSMZ） 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 英国国家典型菌种保藏所（NCTC）
胰脏→胰酶 胰脏 胰酶 血液→凝血酶 血液 凝血酶 木瓜→木瓜蛋白酶 木瓜 木瓜蛋白酶
3、微生物发酵法 世纪50年代以来生产酶的主要方法 是20世纪 年代以来生产酶的主要方法。 世纪 年代以来生产酶的主要方法。 利用微生物细胞的生命活动合成所需酶的方法称 为发酵法。 为发酵法。 酶的发酵生产是现在酶生产的主要方法。 酶的发酵生产是现在酶生产的主要方法。
[ 原始菌种 ] ↓ 试管斜面培养(活化) 试管斜面培养 ↓ 摇瓶等分级扩大培养 ↓ 种子罐培养 ↓ [ 发酵罐 液体发酵 ] 发酵罐(液体发酵 液体发酵)
[ 麸皮等原料 ] ↓ [ 配制培养基 配制培养基] 灭菌) (灭菌)
[ 发酵池 固体发酵 ] 发酵池(固体发酵 固体发酵)
↓ ↓
培养
wenku.baidu.com{液态酶制剂} 液态酶制剂}
转化酶 啤酒酵母、 啤酒酵母、假丝酵母 制造转化糖
凝乳酶
米赫毛霉,大肠杆菌和真 米赫毛霉 大肠杆菌和真 制造乳酪 菌生产的重组酶 曲霉、根霉、 曲霉、根霉、酵母等 青霉、 青霉、曲霉 凝结芽胞杆菌， 凝结芽胞杆菌，白色链 霉菌 细菌、霉菌、 细菌、霉菌、放线菌 加酶洗涤剂，油脂加工， 加酶洗涤剂，油脂加工， 生物化工 食品去氧、除葡萄糖， 食品去氧、除葡萄糖，测 定葡萄糖 生产果葡糖浆 制造6-氨基青霉烷酸 制造 氨基青霉烷酸