教案实验四 黑曲霉发酵生产柠檬酸
黑曲霉产柠檬酸
柠檬酸发酵工艺条件的优化摘要柠檬酸（2-羟基丙烷三羧酸），是重要的工业原料。
可从植物原料中提取，也可由糖进行发酵制得。
实验研究了不同硫酸铵浓度分别对黑曲霉摇瓶发酵和实罐发酵生产柠檬酸的影响。
在菌浓度、发酵过程PH、酸度、残糖、温度在发酵过程中的变化几个方面对实罐和摇瓶发酵进行了相关比较。
结果表明：1）摇瓶发酵的最适硫酸铵浓度为0.4%；实罐发酵最适硫酸铵浓度为0.5%，实罐发酵时硫酸铵浓度过高将产生大量泡沫不利发酵；2）实罐发酵与摇瓶发酵在起始含糖量、菌浓度及发酵温度相同的情况下，随发酵进行，摇瓶发酵的温度更稳定，两者的菌浓度、残糖、PH值变化规律高度一致，酸度变化规律基本一致。
另外实验还就温度对黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响作用进行了探讨，结果表明实罐发酵的最适温度约为35℃，温度过高会导致发酵液水分流失过多而使发酵失败。
1. 课题背景1.1柠檬酸简介柠檬酸（citric acid）是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。
柠檬酸又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸、2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸.分子式：C6H8O7 （相对分子质量：192.13）物理性质：无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有涩味。
极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大。
化学性质：从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质。
加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。
柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。
1.2柠檬酸用途柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。
另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。
黑曲霉产柠檬酸最适发酵条件的探讨
Ｉ０ ）１
Ｃｕ Ｓ０４ ｈＳ １ Ｏｄ ８３ ５ ０５ ５
００ ５
Ｓ： ５ ８８ ３
０２ ５
Ｓ１ ４ ９６ ８
０５ ０
’８ ２ ｇ２ ６
１Ｏ ０
４５ ６ ９８ ５
空白
’８ ３ ９０ ０
１材料与方法 ．
１ １ 验 材 料 ．实 １ １ １ 验 菌 种 ．． 实
黑 曲霉 （ｓ ｅ ｇ １ｕ ｎ ｇ ｔ ２ ６ Ａ ｐ ｒ ｉ ｌ ｓ ｉｅ ） ０ ０
已 １ ｏ４ Ｓ Ｍ ｇＳ Ｏｄ
８４ ５ ８４ ８
’８ ３ ’８ Ｏ
４ １’ ６
７４ １ ’６ ４
’ ｌ ８０ ９
８０ ： ８５５
Ｍｕ ２ ＣＩ
ｐ Ｈ值调整 为 ６ ７ 发酵温度 为 ３ ℃左右 ， ．， ４ 最佳碳源 为蔗糖 ， 最佳氮源为 （Ｈ ） Ｓ ４ 大多数 金属离子在低浓度和高浓度具有不 同的影响作用。以上各条件的 Ｎ４２０ ， 确 定 对柠 檬 酸 的大 规 模 工业 生产 有 重 要 意 义 。
【 键词 】 黑 曲霉 关 柠檬酸 发 酵 条件 添 加 剂 ， ５０×１４个 ／ ｌ接 入 菌 种 ， 床 转 速 ３ ０ 按 ． ０ ｍ 摇 ０ ｒ／ｍ ｎ 温 度 ３ ℃ ｉ， ４ 培 养 ４ ｈ后 记 录产 酸情 况 。 ８
ＦｅＳ ２ Ｏ４
８ｌ ｌ
１ ５
８０ ２
６５ ６
９１ １
７５ ０
９０ ３
８３ ５
８＇ ２
８６ ５
８２：
７９５
Ｆｅ ０ｄ ｓ
９４ ５
９６ ８
９３ １
９１ ４
８３ ３
８２ ５
１ １２培 养 基 ．． 斜 面 种 子 培 养 基 （ 糖 ３ ｇＮ Ｎ 。ｇ Ｍ Ｓ ７ ２ ０ ５ ，Ｃ ０ ５ ， 蔗 ０ ， ａＯ３ ，ｇ Ｏ Ｈ０ ． ｇ Ｋ １ ． ｇ Ｆ Ｓ ７ ２ ００ ｇ ，２Ｐ４ｇ 琼 脂 １ｇ 蒸 馏 水 ｌ０ ｍ ， Ｈ ．） Ｐ Ａ液 ｅＯ．Ｈ０ ． ｌ ４ ＫＨ Ｏｌ ， ３， Ｏ ０ ｌ ｐ ７ ２ ，Ｄ 体 培养 基 （ 铃 薯 ２０克 ， 萄 糖 ２ 马 ０ 葡 ０克 ， 脂 ２ 琼 Ｏ克 ， 水 至 １０ 加 ０ ０毫 升 ） 发 ，
实验4 柠檬酸发酵
实验4 柠檬酸发酵及提取及精制1.实验目的与要求：了解利用黑曲霉生产柠檬酸的原理与流程，掌握柠檬酸的发酵生产方法。
了解树脂提纯及精制柠檬酸的方法，进一步学习并掌握离子交换法的操作过程。
2.实验主要内容：本实验以糖为发酵原料，黑曲霉为产生菌。
黑曲霉产柠檬酸多，耐酸力强。
ph1.6～1.7时尚能生长。
且酸度大时产生葡萄糖酸、草酸等副产物较少，故进行柠檬酸发酵时，培养液以在pH2-3为宜。
在一般发酵中，均产生多种酸，其中，低碳链的直链脂肪酸如甲酸、乙酸等称为挥发酸，而乳酸、柠檬酸等称为非挥发酸。
挥发酸和非挥发酸的总和称总酸。
酸的测定方法常采用中和法、电位滴定法及比色法等。
若待测液色泽很深，可采用外指示剂法。
本试验用中和法测定柠檬酸发酵中的总酸。
柠檬酸的定性检验用Deniges 试剂。
发酵完后，利用树脂对柠檬酸进行提纯及精制。
3.实验所需仪器设备：三角瓶、酸式滴定管、烧杯、吸管、水浴锅、恒流泵、树脂交换柱、收集器、旋转蒸发仪、酒精灯、滤纸、漏斗、碱滴定管、铁台、蝴蝶夹、酚酞指示剂、布氏漏斗、抽滤纸、抽滤水泵、离心机和离心管、滴管、天平、玻璃棒、牛角勺、广泛pH 试纸4.实验所需试剂（每班所需试剂量）：阴离子交换树脂2000g、阳离子交换树脂2000g、碳酸钙500g、硫酸500g1、黑曲霉斜面菌种3支、硝酸铵200g，KH2P04 200g，MgS04 250g，蔗糖2000g， HCl500ml、NaOH500ml 、H2S04ml5.实验步骤：（1）树脂预处理分别称取一定量的树脂(阳离子交换树脂和阴离子交换树脂)，清洗漂去杂质，放在交换柱中，先用1mol／LNaOH，后用水洗，再用1mol／L HCl，最后用水洗至pH≥4。
每次所用溶液体积为树脂体积的3倍，流速的大小为柱截面积，两种树脂的预处理方法相同。
（2）柠檬酸发酵1）接种取柠檬酸发酵培养液3瓶，用接种环向每瓶接入黑曲霉孢子2～3环，25―28℃摇床培养5～7d。
黑曲霉生产柠檬酸的发酵工艺流程
黑曲霉生产柠檬酸的发酵工艺流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢!本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!黑曲霉生产柠檬酸的发酵工艺流程1. 引言柠檬酸是一种广泛应用于食品、医药、化工等领域的重要有机酸，在工业生产中，利用微生物发酵生产柠檬酸已成为一种常见的方法。
实验24黑曲霉发酵生产柠檬酸
实验24⿊曲霉发酵⽣产柠檬酸⿊曲霉发酵⽣产柠檬酸柠檬酸（citric acid ）⼜名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid ）、2--羟基丙烷-1，2，3-三羧酸（2-hydroxy propane-1，2，3-tricarboxylic acid ）。
商品柠檬酸有两种形式：⼀种为⽆⾊透明，有光泽的含⼀个结晶⽔的晶体，其分⼦式为C 6H 807·H 2O,相对分⼦质量为210.14。
另⼀种为⽆⾊半透明全对称晶体的⽆⽔柠檬酸，分⼦式为C 6H 8O 7，相对分⼦质量192.13。
柠檬酸因⽆毒、⽔溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被⼴泛应⽤于⾷品、医药、化⼯、化妆品、清洗（洗涤）、建筑等⼯业部门。
1893年前，⼈们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。
1893年后发现微⽣物可产⽣柠檬酸，1951年美国Miles 公司⾸先采⽤深层发酵法⽣产柠檬酸。
我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵⽣产柠檬酸，60年代开始采⽤薯⼲粉直接深层发酵法⽣产柠檬酸。
能够产⽣柠檬酸的微⽣物很多，青霉、⽑霉、⽊霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的⼀些菌株都能够利⽤淀粉质原料或烃类⼤量积累柠檬酸。
⾄今世界上消费的柠檬酸主要采⽤发酵法，⽽最具商业竞争优势的是采⽤⿊曲霉（Asp.niger ）、⽂⽒曲霉(Asp.Wentii )和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。
⽬前国内外普遍采⽤⿊曲霉的糖质原料发酵⽣产柠檬酸。
本实验以薯⼲粉或⽟⽶粉为原料，采⽤⿊曲霉，通过深层液体（摇瓶）发酵产⽣柠檬酸。
柠檬酸发酵液经过滤除去菌丝体和残存杂质，过滤液中加⼊碳酸钙中和，⽣成柠檬酸钙沉淀。
将获得柠檬酸钙再⽤稀硫酸酸解⽣成柠檬酸和硫酸钙沉淀⽽制得粗制柠檬酸液，粗制柠檬酸液再经活性碳脱⾊、离⼦交换脱盐制得精制柠檬酸液。
精制柠檬酸液经真空浓缩、结晶制得符合英国药典BP-98版标准的⽆⽔或⼀⽔柠檬酸。
产柠檬酸黑曲霉菌种的分离及初筛选
产柠檬酸黑曲霉菌种的分离及初筛选一、实验目的1.了解和掌握柠檬酸发酵菌种黑曲霉的菌种特性和分离方法。
2.初步掌握菌种筛选方法设计。
二、实验原理柠檬酸主要用于食品工业，作为酸味料广泛用于饮料、果酱、水果糖、冰淇淋等，还用于制药、化工、塑料等工业。
能用于生产柠檬酸的菌种有毛霉、青霉、曲霉，其中尤以黑曲霉产生柠檬酸的能力最强，且能利用多种碳源，是生产中最常见的菌种。
黑曲霉广泛存在于自然环境中，空气、水、土壤中都有该菌存在。
本实验根据野生柠檬酸发酵菌种耐酸性的特点，从土壤中分离纯化以获得柠檬酸发酵的野生菌种。
三、仪器与试剂高压灭菌锅、恒温培养箱、干燥箱、超净工作台、恒温摇床、培养皿、三角瓶、烧杯、接种棒、试管、量筒、滤纸、酒精灯等。
四、方法与步骤指示剂法（变色圈法）（一）菌种分离平板采用察氏-多氏琼脂培养基加入0.04%溴甲酚绿：蔗糖30g NaNO3 2g MgSO4·7H2O 0.5gKH2PO4 1g KCl O.5g FeSO4·7H2O 0.01g溴甲酚绿0.4g 琼脂20g 蒸馏水1000ml PH自然。
土壤浸出液稀释以后，涂在上述培养基制成的平板上，于30℃培养。
由于产酸，菌落周围会出现黄色变色圈。
在变色圈还未互相连成一片时，测量变色圈直径（C）与菌落直径（H）之比。
取C/H比例较大者，并且具有黑曲霉特征的菌落挑出接到斜面上（点接法，点接在斜面中部偏下方），筛选时要考虑菌种耐高温、抗杂菌污染及原料。
（二）初筛一般初筛培养基可进行如下选择和设计（1）薯干粉直接发酵：25%薯干粉蒸煮后，用液化型淀粉酶（如枯草杆菌淀粉酶）液化，升温灭酶灭菌后，加入α-萘粉1mg/1或氯化十六烷基吡啶胺1mg/1.（2）水解糖发酵：水解糖稀释至含葡萄糖150g/1，加入NH4NO32g/1,MgSO4·7H2O O.5g/1，一氟乙酸钠50mg/1。
（3）葡萄糖母液发酵：母液稀释至含葡萄糖150g/1，加入NH4NO31～2g/1，一氟乙酸钠50mg/1。
黑曲霉利用香蕉提取物生产柠檬酸
中文译文黑曲霉利用香蕉提取物生产柠檬酸摘要：将香蕉提取物作为碳源进行柠檬酸生产的实验。
使用的是微生物黑曲霉菌株。
对不同类型的生物反应器进行了测试：泡沫柱反应器和搅拌反应器，对于搅拌反应器两种不同类型的叶轮在不同转速的条件下进行了研究：六片桨叶的涡轮桨和赖特宁架A310涡轮。
在测试过程中对各个参数进行了测量：生化性能（生物量w/v 和霉的直径）、化学性能（总糖和柠檬酸的浓度）和物理性能（溶解氧分压DOT ；氧摄取率OUR ；粘性；气体/液体的体积传质系数，a K L )。
结果表明柠檬酸的产量与微生物的形态有严格的联系；霉必须以颗粒的形式生长，如在泡沫柱反应器总提供温和的环境中进行；另外，随着机械的搅拌，霉的颗粒状态被破坏，霉的形态变为丝状，并且柠檬酸的产量明显减少。
对发酵结果进行讨论，以达到更好的了解影响扩大生产规模的主要因素。
关键词：柠檬酸、黑曲霉、混合、泡沫柱反应器、搅拌器、叶轮、农业产品、物理参数注释：L C 溶解氧浓度（千克/立方米）*L C 平衡溶解氧浓度（千克/立方米）LS C 校准溶解氧浓度（千克/立方米）D 叶轮直径（mm ）D 颗粒的平均直径mmDOT 溶解氧分压DOT* 平衡溶解氧分压cdt dDOT ⎥⎦⎤⎢⎣⎡ 溶解氧分压的变化在图表2区域c 中(1/s)a DOT 溶解氧分压在图表2的区域a 中va G 平均流速梯度a K L 体积传质系数（1/s)N 搅拌转速（每分钟转数）P N 功率数Q N 抽号OUR 氧摄取率（千克/立方米·小时）P 柠檬酸浓度（千克/立方米）0P 体积功耗（瓦/立方米）Q 体积气体流速RI 流变指数S 底物浓度（千克/立方米）T 时间（秒，小时，天）T 温度（℃）X 生物量浓度(千克/立方米）S X Y / 生物产量S P Y / 柠檬酸产量液体表观粘度备注：o 初始条件f 最后条件简介：最近在先进的工业国家，柠檬酸消耗量的增加主要是在食品和制药工业（约占到总需求的70%）方面，以及用于生物降解，用于生物降解的这种性能表明柠檬酸能够代替磷作为洗涤剂从而能控制环境的污染。
黑曲霉的次级产物的提纯
淮北师范大学信息学院07生物工程实验课题：利用黑曲霉生产柠檬酸的实验设计方案设计成员：万纹纹王磊陈晨夏柱宝指导老师：高翔利用黑曲霉生产柠檬酸的实验设计方案实验步骤： 筛选 → 诱变 → 培养基条件 → 发酵→ 产品分离纯化 一、 菌种的筛选：1、 土壤采样：采样人： 万纹纹 王磊 陈晨 夏柱宝 采样时间：采样地点： 环境条件：用取样铲，将表层5cm 左右的浮土除去，取5～25cm 处的土样10～25g ，装入事先准备好的塑料袋内扎好。
应在三处不同的地点进行采样，将采集好的样品带回实验室备用。
2、 倒平板： 将PDA 培养基加热融化，待冷却至55-60℃倒平板15皿。
PDA 培养基配方：马铃薯 200g 蔗糖 20g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 自然3、 制备土壤稀释液：各称土样10g ，迅速倒入带玻璃珠的90mL 无菌水的三角瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)，振荡约20min ，使土样充分打散，用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后在用无菌吸管从此试管中吸取1ml 加入另一盛有9ml 无菌水的试管里，混合均匀，以此类推制成110-、210-、310-、410-、510-、610-不同稀释度的土壤溶液。
4、 涂布：将倒好平板的底面用记号笔标上410-、510-和610-三种稀释度，然后用无菌吸管分别由410-、510-和610-三管土壤稀释液中各吸取0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温静置5-10min ，使菌液吸附进培养基。
5、 培养： 将涂布好的平板倒置于35℃的培养箱中培养3-5d.6、 挑菌落：黑曲霉形态特征：在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。
孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐，菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成1层或2层小梗，小梗顶端产生一串串分生孢子。
一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法
一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法在工业生产中，柠檬酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、化工等领域。
而黑曲霉是目前最主要的柠檬酸生产微生物，因其高效、高产等优点而备受青睐。
然而，对于黑曲霉发酵生产柠檬酸的方法，如何提高其产量一直是一个备受关注的问题。
本文将从深度和广度的角度，探讨一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法。
一、原理解析在进行黑曲霉发酵生产柠檬酸时，关键的生产环节是发酵过程。
而要提高柠檬酸的产量，需要从以下几个方面进行优化：发酵菌株的选取、培养基的配方、发酵条件的控制等。
1. 发酵菌株的选取在选择发酵菌株时，需要考虑其对柠檬酸产量的影响。
一般来说，通过筛选高产菌株，可以有效提高柠檬酸的产量。
选择某些高柠檬酸产量的黑曲霉菌株，能够在一定程度上提高发酵产酸量。
2. 培养基的配方培养基的配方是影响柠檬酸产量的重要因素之一。
通过优化培养基的氮源、碳源、矿物盐等成分比例，可以为黑曲霉提供更适宜的生长环境，从而增加柠檬酸的产量。
添加适量的葡萄糖、氨基酸等营养物质，可以刺激黑曲霉的生长，提高柠檬酸的产量。
3. 发酵条件的控制发酵过程中的温度、pH值、氧气供应等条件的控制对柠檬酸产量也有着重要的影响。
合理的温度和pH值可以促进黑曲霉的生长和柠檬酸的产生，而充足的氧气供应则能提高发酵效率，进而增加柠檬酸的产量。
二、实践应用上述原理虽然看似简单，但在实际应用中却需要综合考虑各个因素，并进行合理的优化。
在进行黑曲霉发酵生产柠檬酸时，可以通过以下方法来提高产量：1. 优化菌株选取首先需要对已有的黑曲霉菌株进行筛选，选择出高产柠檬酸的菌株。
这需要借助研究机构或者实验室的支持，通过采用分子生物学技术等手段进行筛选和改良。
2. 调整培养基配方针对不同菌株、不同生产条件，可以优化培养基的配方，以满足黑曲霉生长和柠檬酸产量的需求。
在生产实践中，可以根据具体情况进行调整，以获得最佳效果。
3. 控制发酵条件在实际生产过程中，通过精确控制发酵过程中的温度、pH值和氧气供应，可以更好地满足黑曲霉生长和柠檬酸产量的需求。
柠檬酸发酵
柠檬酸发酵【实验目的】 1. 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。
2. 了解并记录黑曲霉培养过程中培养基中基质的变化与产物的形成情况；【实验原理】黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP）和HMP 途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化生成乙酸和二氧化碳，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬合成酶的作用下生成柠檬酸。
黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环变成“马蹄形”，代谢流汇集于柠檬处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。
【实验用品】1. 实验主要仪器摇床；离心机；超净工作台；恒温培养箱；灭菌锅；分析天平；蒸发器；分光光度计；容量瓶；滤布；布氏漏斗；滴定管；水浴锅；试管、烧杯、500ml 三角瓶等若干0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，pH 计，3,5 二硝基水杨酸试剂，0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，pH 计，3,5 二硝基水杨酸试剂，葡液(A 液：1％结晶紫95％酒精溶液：B 液：1％草酸铵溶液。
取A液20mL，B 液80mL混合，静置48 小时后使用2. 材料菌种黑曲霉【方法步骤】1.柠檬酸发酵菌种培养基1升（蔗糖合成培养基：蔗糖140g， NH4NO3 2g， KH2PO4 2g， MgO4.7H2O 0.25g， FeCl3.6H2O 0.02g， MnSO4.4H2O 0.02g，麦芽汁20ml，用水定溶至1000ml）分装、灭菌。
1.4 接种活化的黑曲霉孢子（约0.5%）接种入培养基中，在33-36℃，200-300r/min的摇床中20h左右，培养后菌体浓度应达60万～150万/ml，菌丝球为致密形的，菌球直径不应超过0.1mm，菌丝短，且粗壮，分支少，瘤状，部分膨胀为优。
黑曲霉发酵柠檬酸
黑曲霉发酵生产柠檬酸（中北）生物技术18083108 陈园园摘要：黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。
广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，是重要的发酵工业菌种。
大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬酸的能力，而黑曲霉的产酸能力更强。
黑曲霉从土壤中分离培养，土壤来源有要求。
黑曲霉和黑根霉菌种用于发酵产柠檬酸，了解产物发酵生产的机理，柠檬酸发酵的发酵条件，掌握发酵过程步骤，了解产物提取的几种方法，学习利用沉淀法提取柠檬酸的原理，掌握沉淀法提取柠檬酸的方法是本次实验的目的要求。
关键词：黑曲霉、黑根霉、柠檬酸实验材料和试剂：样品：新鲜土壤样品（来源于食堂垃圾堆处）培养基：查氏培养基、马铃薯培养基无菌水：带有玻璃珠装有20mL无菌水三角瓶试剂：400U/mL庆大霉素液、10％苯酚、酚酞指示剂、碳酸钙、0.1M NaOH 、0.1M H2SO4 实验器材：无菌培养皿、培养箱、无菌吸管、无菌离心管、电子天平、记号笔、玻璃涂棒、酒精灯、火柴、圆底烧瓶、抽滤瓶、玻璃棒、抽滤设备、冰箱实验步骤一．黑曲霉、黑根霉菌种的分离和培养1.黑曲霉的分离培养①土壤样品的采集用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好灭菌容器内扎好。
编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。
一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。
②制平板：在融化好的查氏培养基中加入链霉素0.2mL/瓶制3块PDA培养基、3块查氏培养基平板。
③制备土壤稀释液：1. 称取土壤2g，放入18mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，同时加入3滴10％苯酚溶液，振荡5min，即为稀释10－1的土壤悬液。
2. 另取无菌离心管2支，用记号笔编上10－2、10－3、10－4，再加入0.9mL无菌水。
取10－1的土壤稀释液，吸取0.1mL加入第一只离心管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10－2土壤稀释液。
黑曲霉发酵提取柠檬酸
黑曲霉发酵提取柠檬酸实验一黑曲霉保藏菌的复苏实验目的：了解黑曲霉保藏菌的生长状况和保藏菌的活化处理过程。
实验原理：能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉及葡萄孢霉中的一些菌株都能够利用淀粉质原料大量积累柠檬酸。
目前国内主要利用黑曲霉（Aspergillus niger）通过固体发酵或液体深层发酵生产柠檬酸。
发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是微生物产生糖化霉首先将淀粉转变为葡萄糖，葡萄糖经过糖酵解途径（EMP）转变为丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬酸合成酶的作用下乙酰辅酶A和草酰乙酸合成为柠檬酸。
产生的柠檬酸经碳酸钙作用形成柠檬酸钙沉淀，再经稀硫酸作用释放出柠檬酸。
实验步骤：1、观察保藏菌的生长状况，记录PH2、黑曲霉复苏培养基的配制（1）、分别称取蔗糖30g，KNO3 1g, K2HPO4 1g, 麸皮10%，MgSO4.7H2O 0.5g, KCL 0.5g, FeSO4.7H2O 0.01g, 于500ml搪瓷缸中。
（2）、加蒸馏水100ml，调节pH至7.0-7.2（3）、牛皮纸包扎，灭菌3、保藏菌的活化扩增（1）配制5ºBe’麦芽琼脂培养基（2）20℃麦芽汁，糖度为5（3）加0.7%的琼脂（4）加热，使其沸腾（5）分装与试管中，每管约3ml（6）包扎灭菌，制成斜面培养基（7）在超净工作台上划菌，包扎（8）置于28~30℃培养箱中培养实验要求：分析复苏和保藏培养基的区别，原因，营养成分的差异和操作的目的和意义。
并加注参考文献。
实验二黑曲霉一级种子的制备实验目的：了解种子扩大培养的程序，比较复苏均至一级种子的生境变化。
实验原理：黑曲霉在生长过程中不仅需要有充足的营养成分，而且还需要一定的氧气环境等。
通过拌菌等增加菌种与培养基营养成分的充分接触，获得良好的生长。
实验步骤：1、观察活化的保藏菌生长状况，并记录。
2、在超净工作台上，将2-4管/组，活化的保藏菌分别加入约3mL双蒸水。
黑曲霉生产柠檬酸的发酵工艺流程
黑曲霉生产柠檬酸的发酵工艺流程1.首先，选择适当的黑曲霉菌种作为发酵的起始种。
First, choose the appropriate Aspergillus Niger strain as the starting culture for fermentation.2.将黑曲霉菌种接种到含有适量碳源和氮源的发酵基质中。
Inoculate the Aspergillus Niger strain into a fermentation medium containing suitable amounts of carbon and nitrogen sources.3.确保发酵基质的pH值在合适的范围内，通常为3.0至6.0。
Ensure that the pH of the fermentation medium is within the appropriate range, typically between 3.0 and 6.0.4.控制发酵温度在25°C至35°C之间，提供适宜的温度条件。
Control the fermentation temperature between 25°C and 35°C to provide suitable conditions for growth.5.确保发酵过程中的通气充足，以促进微生物的生长和代谢活动。
Ensure adequate aeration during the fermentation processto promote microbial growth and metabolic activity.6.在发酵过程中定期监测黑曲霉的生长情况和产酸量。
Regularly monitor the growth of Aspergillus Niger and the production of citric acid during the fermentation process.7.当黑曲霉的生长达到高峰并且产酸量稳定时，进行收获。
利用黑曲霉发酵产生柠檬酸
利用黑曲霉发酵生产柠檬酸摘要：柠檬酸是目前以微生物发酵生产的重要有机酸之一，它的用途非常广泛，需求日益增长。
目前国内柠檬酸年产量约2.5×105吨，其中半数以上供出口之用。
80年代，我国国内的柠檬酸消费急剧上升，速度远远超过了西方发达国家。
随着人民生活水平的提高，对食品和饮料等含柠檬酸制品的需求量猛增，但就人均消费量来看，我国的柠檬酸消费还是很低的，以用于食品和饮料的柠檬酸为例，我国的人均消费量远低于美国和日本，市场潜力巨大，因此增加柠檬酸生产不仅可以满足国内日益增长的需要，也是换取外汇的重要手段之一。
柠檬酸是葡萄糖经柠檬酸循环而形成的最有代表性的代谢产物，早已发展成大规模的商用生产。
常用的菌种是黑曲霉，产酸浓度在每升发酵液中＞150g。
关键词：黑曲霉，柠檬酸，三羧酸循环1、柠檬酸用途柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。
另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。
它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。
柠檬酸的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极为广泛而有良好的发展前景。
2、黑曲霉黑曲霉，子囊菌亚门，丝孢目，丛梗孢科中的一个常见种。
广泛分布于世界各地。
食品工业上用作发酵菌种，如用于食醋生产制曲、麸曲法白酒生产制曲、柠檬酸发酵等，主要是利用此黑曲霉分泌产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能；在生物肥料工业上，黑曲霉具有裂解大分子有机物和难溶无机物，便于作物吸收利用，改善土壤结构，增强土壤肥力，提高作物产量的效果。
3、柠檬酸循环（citric acid cycle，CAC）又称三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA），Krebs循环，由诺贝尔获奖者（1953年）、德国学者H.A.Krebs于1937年提出。
黑曲霉发酵生产柠檬酸生产工艺的优化
黑曲霉发酵生产柠檬酸生产工艺优化摘要柠檬酸（2-羟基丙烷三羧酸），是重要的工业原料。
可从植物原料中提取，也可由糖进行发酵制得。
实验研究了不同硫酸铵浓度分别对黑曲霉摇瓶发酵和实罐发酵生产柠檬酸的影响。
在菌浓度、发酵过程PH、酸度、残糖、温度在发酵过程中的变化几个方面对实罐和摇瓶发酵进行了相关比较。
结果表明：1）摇瓶发酵的最适硫酸铵浓度为0.4%；实罐发酵最适硫酸铵浓度为0.5%，实罐发酵时硫酸铵浓度过高将产生大量泡沫不利发酵；2）实罐发酵与摇瓶发酵在起始含糖量、菌浓度及发酵温度相同的情况下，随发酵进行，摇瓶发酵的温度更稳定，两者的菌浓度、残糖、PH值变化规律高度一致，酸度变化规律基本一致。
另外实验还就温度对黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响作用进行了探讨，结果表明实罐发酵的最适温度约为35℃，温度过高会导致发酵液水分流失过多而使发酵失败。
关键词：黑曲霉，柠檬酸，硫酸铵，实罐，摇瓶AbstractCitric acid(2-hydroxytricarboxylic acid), is an important industrial raw material. It can be extracted from plant materials or be obtained by fermentation of sugar. In this treatise, we studied the different impacts to the fermentations in erlenmeyers and fermenters which were made by the different concentration of the ammonium sulfate. We compared the differences between the fermentation in erlenmeyers and fermenters by analyzing the concentration of the bacteria, the PH during the fermentation process, acidity, residual sugar and the temperature changes during the fermentation process. The results showed that: 1) the optimum concentration of ammonium sulfate for the fermentation in erlenmeyer is 0.4% while the optimum concentration of ammonium sulfate for the fermentation in fermenters is 0.5%.when the concentration of ammonium sulfate is too high, the fermentation cannot be succeed for the large number of foam. 2) when the initial sugar content, bacteria concentration and fermentation temperature are under the same circumstances, the fermentation in the erlenmeyer has more stable fermentation temperature. Both the two methods of fermentations have the same variation in the concentration of the bacteria ,residual sugar, PH value and changes of acidity. Another experiment also studied the influence to the fermentation in the fermenter made by temperature. The result showed that the production of citric acid from the fermentation of Aspergillus niger is the highest when the temperature is 35℃,when the temperature is too high , fermentation will fail for the excessive loss of water. Keywords：citric acid, Aspergillus niger, fermentation, erlenmeyer, fermenter, ammonium sulfate1. 课题背景1.1柠檬酸简介[1]柠檬酸（citric acid）是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。
产柠檬酸用黑曲霉的选育
产柠檬酸用黑曲霉的选育产柠檬酸用黑曲霉的选育摘要：利用已有菌种进行分离复壮、斜面培养、麸曲培养，然后发酵，检测产生柠檬酸的量，选择产酸能力较高的菌种，在选出菌种的基础上重复此步骤，挑选出产酸能力最大的菌种，通过实验结果，表明第二次选育的菌种的产酸能力比第一次选育出的种子能够提高75.88％。
关键词：黑曲霉薯粉柠檬酸菌种选育引言柠檬酸又名枸橼酸，外观为白色颗粒状或白色结晶粉末，无臭，有强烈的酸味，它存在于天然果实中，其中以柑桔、菠萝、柠檬、无花果等含量较高。
早期柠檬酸是以天然果实为原料加工而成，1893年德国微生物学家Wehmen发现二种青霉菌能够积累柠檬酸，1951年美国Miles公司首先采用深层发酵大规模生产柠檬酸。
我国1968年用薯干为原料采用深层发酵法生产柠檬酸成功，柠檬酸生产由于工艺简单、原料丰富、发酵水平高，至20世纪70年代中期，已初步形成了生产体系。
柠檬酸行业是我国生物农业中的一个重要行业，广泛用于食品、医药、生物工程、精细化工等行业，具有极其广阔的发展前景，而黑曲霉是生产柠檬酸最为重要的菌种，它的产酸能力将直接影响柠檬酸的产量，因此黑曲霉的选育将会产生极大的经济效益。
1)国内外黑曲霉菌种选育研究概况。
产柠檬酸黑曲霉已经历了几十年的诱变(induced mutation)筛选，对常用的诱变处理具有一定的抗性。
中科院有人尝试把离子束应用于产柠檬酸黑曲霉的诱变，并取得了一定效果。
在此影响下，有人做过用低能离子束注入黑曲霉来优化菌种的产酸能力。
李文玲等也曾经用Co<sup>60</sup>～γ射线诱变产柠檬酸的黑曲霉菌种，也取得了很大的成果。
欧美是除中国以外全球第二大柠檬酸主产区，柠檬酸生产企业的经济和技术实力比较雄厚，一般都是集技术开发、工业设计和生产一体化的跨国集团企业，相比中国柠檬酸行业，在技术和管理上具有很大的优势，在菌种的选育方面也比我们的经验丰富。
本文研究的育种方法从我国的国情出发，方法简单易学，效果显著，在目前生产分散，技术水平低的实际情况下具有一定的借鉴和推广意义。
利用黑曲霉发酵产生柠檬酸
利用黑曲霉发酵生产柠檬酸摘要：柠檬酸是目前以微生物发酵生产的重要有机酸之一，它的用途非常广泛，需求日益增长。
目前国内柠檬酸年产量约2.5×105吨，其中半数以上供出口之用。
80年代，我国国内的柠檬酸消费急剧上升，速度远远超过了西方发达国家。
随着人民生活水平的提高，对食品和饮料等含柠檬酸制品的需求量猛增，但就人均消费量来看，我国的柠檬酸消费还是很低的，以用于食品和饮料的柠檬酸为例，我国的人均消费量远低于美国和日本，市场潜力巨大，因此增加柠檬酸生产不仅可以满足国内日益增长的需要，也是换取外汇的重要手段之一。
柠檬酸是葡萄糖经柠檬酸循环而形成的最有代表性的代谢产物，早已发展成大规模的商用生产。
常用的菌种是黑曲霉，产酸浓度在每升发酵液中＞150g。
关键词：黑曲霉，柠檬酸，三羧酸循环1、柠檬酸用途柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。
另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。
它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。
柠檬酸的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极为广泛而有良好的发展前景。
2、黑曲霉黑曲霉，子囊菌亚门，丝孢目，丛梗孢科中的一个常见种。
广泛分布于世界各地。
食品工业上用作发酵菌种，如用于食醋生产制曲、麸曲法白酒生产制曲、柠檬酸发酵等，主要是利用此黑曲霉分泌产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能；在生物肥料工业上，黑曲霉具有裂解大分子有机物和难溶无机物，便于作物吸收利用，改善土壤结构，增强土壤肥力，提高作物产量的效果。
3、柠檬酸循环（citric acid cycle，CAC）又称三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA），Krebs循环，由诺贝尔获奖者（1953年）、德国学者H.A.Krebs于1937年提出。
从发酵液中提取柠檬酸的工艺设计
从发酵液中提取柠檬酸的工艺设计本次实验主要是从黑曲霉发酵液中提取柠檬酸（如图1）。
柠檬酸为无色半透明晶体或白色颗粒或白色结晶性粉末。
其钙盐在冷水中比热水中易溶解，此性质常用来鉴定和分离柠檬酸。
是食品加工业中很重要的食品添加剂，也广泛应用于医药、染料及其他工业。
工业上柠檬酸由蔗糖发酵制得。
黑曲霉、米曲霉均可产柠檬酸。
图1 柠檬酸的结构式1 实验目的采用离子交换色谱法提取柠檬酸。
2 实验材料米曲霉发酵液、701型阴离子交换树脂、732型阳离子交换树脂、活性炭、色谱柱、真空设备、水浴锅、过滤纱布、烧杯、玻璃棒、5%氨水、。
3 实验原理经过过滤的柠檬酸发酵清液通过活性炭脱色，先由阴离子交换柱交换，并用碱(NaOH或NH4OH)进行洗脱，即将交换在树脂上的柠檬酸以柠檬酸钠(或铵)的形式洗脱下来，再由H型阳离子交换剂转型除杂，将柠檬酸钠转为柠檬酸之后，浓缩液结晶，得到高质量的柠檬酸产品。
吸附：3R2NH2OH＋C6H8O7－（R2NH2）3C6H5O7＋ 3H2O洗脱：（R2NH2）3C6H5O7＋3NH4OH－3R2NH2OH＋（NH4）3C6H5O7转型：3R2SO3H＋（NH4）3C6H5O7－3R2SO3NH4＋ C6H8O74 工艺流程图（4）把柠檬酸铵液加入到732型阳离子交换树脂色谱中进行转型处理，得到柠檬酸液。
同样确定各项参数的最佳值，测量洗脱液的体积V2，柠檬酸的浓度C2。
（5）把柠檬酸液转入到烧杯中，放入水浴锅中，低压浓缩。
可以通过查找文献或者自己通过试验来确定水浴温度、真空度、时间的最佳值。
（6）冷却结晶，将浓缩液转入烧杯中，于最适温度下搅拌，待出现晶核，停止搅拌，再移入4度冰箱冷却结晶约t，抽滤获得柠檬酸晶体，烘干后称重柠檬酸质量m。
可以通过查找文献或者自己通过试验来确定温度和冷却结晶时间的最佳值。
（7）纯度检测和确定柠檬酸的回收率。
4第四章柠檬酸、谷氨酸发酵机制教学教案
柠檬酸发酵中，三个控制点
C6H12O6
控制Mn+ NH4+浓度，解
除柠檬酸对PFK的抑制
（1）点：EMP畅通无阻
控制溶氧，防止侧系
呼吸链失活
丙酮酸 + 丙酮酸
（2）点：通过CO2固定反应生成C4二羧酸
乙酰辅酶A + C4二羧酸
柠檬酸
柠檬酸发酵中，三个控制点
（3）点：柠檬酸后述的酶活性丧失或很低，
控制培养基中的Fe2+ 的浓度
第四章 柠檬酸发酵机制
第一节 概述
一、柠檬酸简介
❖
柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主
要代谢产物之一。化学名称2-羟基丙三羧酸，英文文献俗
名citric acid，分子式C6H8O7。无色或白色晶体，无臭，
味极酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反
应。
二、柠檬酸的应用概况
➢食品工业：主要作为饮品的酸味剂，用于各种清凉饮料，还有
四、柠檬酸发酵过程的控制要点
（1）控制Mn2+、NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的
抑制，使EMP畅通无阻。
（2） 控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。
（3）筛选丙酮酸羧化酶高活性菌株，培养基生物
素含量充足，提高CO2固定合成草酰乙酸能力
（4）控制培养基中的Fe2+ 的浓度及产酸发酵的pH，
使顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶失活。
混合粉剂可作宇航员、飞行员的补品。精氨酸药物用于治疗由氨中毒
造成的肝昏迷；丝氨酸药物用作疲劳回复剂；蛋氨酸、胱氨酸用于治
疗脂肪肝；L－谷氨酸与L－谷氨酰胺用于治疗脑出血后的记忆力障
碍等。
在化妆品生产中的应用。氨基酸及其衍生物与皮肤的成分相似，具
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验四黑曲霉发酵生产柠檬酸
【目的要求】
1. 掌握实验室菌种种子生产方法。
2. 掌握柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。
3. 熟悉并记录黑曲霉培养过程中培养基中基质的变化与产物的形成情况；
4. 掌握钙盐法提取柠檬酸的原理与方法。
【基本原理】
黑曲霉发酵生产柠檬酸实验中需要大量活化的孢子，其制备是采用麸皮培养基中保藏的黑曲霉孢子，在新的麸皮培养基上于适当的温度下活化并大量繁殖，从而产生大量活化孢子。
黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP）转变为丙酮酸；丙酮酸氧化脱羧形成乙酰辅酶A，然后在柠檬合成酶的作用下生成柠檬酸。
黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环不能充分进行，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。
其理论反应式为：C6H12O6+1.5O2→C6H8O7+2H2O
以薯干粉或玉米粉为原料的黑曲霉柠檬酸发酵液，除了含有大量柠檬酸外，还有大量的菌体，少量没有被黑曲霉利用的残糖、蛋白质、脂肪、胶体化合物以及无机盐类等。
柠檬酸提取就是从成分复杂的发酵液中分离提纯获得柠檬酸。
从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸的方法主要有：钙盐-离子交换法、溶剂萃取法、“吸交”法、离子色谱法等。
目前国外生产主要采用钙盐-离子交换法和溶剂萃取法；国内生产主要采用钙盐-离子交换法，“吸交”法和离子色谱法正在推广中。
钙盐法首先采用过滤或超滤除去发酵液中的菌丝体等不溶残渣，然后在澄清过滤液中加入碳酸钙（或氢氧化钙）发生中和反应，生成难溶的柠檬酸钙沉淀，利用在80-90℃下柠檬酸钙的溶解度极低的特性，通过过滤（或离心）将它与可溶性的糖、蛋白、氨基酸、其它有机酸、无机离子等杂质分离开，用80-90℃热水反复洗涤柠檬酸钙，除去残糖和其他可溶性杂质，经过滤（或离心）获得较净的柠檬酸钙，然后在洗净的柠檬酸钙中缓慢地加入稀硫酸进行酸解反应，生成柠檬酸和硫酸钙沉淀，经过滤（或离心）除去硫酸钙沉淀，获得粗制的柠檬酸。
其主要反应式为：
2C6H8O7·H2O+3CaCO3Ca3（C6H5O7）2·4H2O +3CO2 +H2O
Ca3（C6H5O7）2·4H2O+3H2SO4 +4H2O 2C6H8O7·H2O+3CaSO4·2H2O
【实验用品】
1. 实验主要仪器设备
超净工作台、恒温培养箱、灭菌锅、三角瓶（500mL）
摇床；离心机；分析天平；旋转蒸发器；分光光度计；比色管；容量瓶；滤布；布氏漏斗；滴定管；水浴锅；试管、烧杯、500ml 三角瓶等若干
2. 材料
菌种：黑曲霉（本实验室保存）
培养基：
麸皮培养基。
黑曲霉种子培养基：20%玉米粉糖化过滤液。
发酵培养基：20%葡萄糖溶液与过滤后的玉米糖化过滤液按比例混合。
2. 实验药品
0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，碳酸钙，95%乙醇，浓硫酸；0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，3,5 二硝基水杨酸试剂，葡萄糖；草酸铵结晶紫液(A 液：1％结晶紫95％酒精溶液：B 液：1％草酸铵溶液。
取A液20mL，B 液80mL混合，静置48 小时后使用) 【方法步骤】
一、麸曲的制备
1 麸皮培养基的配置
将麸皮用纱布袋装好，用自来水将麸皮反复揉洗直至洗液澄清，挤去水分至有水感而水不下滴为宜。
将洗净的麸皮装入500ml干净的锥形瓶中，装入量约为锥形瓶体积的1/5，盖好四层纱布，并用牛皮纸包好。
2 培养基灭菌
将装好的麸皮培养基以高压蒸汽灭菌法灭菌，保持121.3℃，灭菌30min。
3 接种
3.1 孢子悬浮液的制备
取保藏黑曲霉菌种，用接种环挑取少许菌落装入含有玻璃球的三角瓶中，加20ml无菌水，盖好塞子震荡数分钟，即得孢子悬浮液。
3.2 种曲的制备
吸取孢子悬浮液5ml接入麸曲培养基中，然后摊开纱布、扎好，并在掌心轻轻拍三角瓶，使孢子和培养基充分混合，于30-32℃下恒温培养1d后，再次拍匀，于35℃下培养，每隔12-24h摇瓶一次，孢子长出后停止摇瓶，这样继续培养3-4d，即成种曲。
二、摇瓶种子制备
1 摇瓶发酵培养基的配置
将玉米粉用80目筛子筛好备用，称取200g玉米粉于烧杯中，同时加入自来水800ml，即质量比自来水：玉米粉为4:1，混匀。
2 培养基的糖化
将培养基置电热板上搅拌加热，70℃加入淀粉酶2.0g，水解20min，取少量培养基加水稀释后用碘指示剂检验，与淀粉液进行对照，如变蓝表明水解糖化不完全，需补加淀粉酶继续水解至不变蓝，即糖化完全，用双层纱布过滤，即得到20%玉米水解过滤液。
3 分装、灭菌
将配制好的培养基装入摇瓶（锥形瓶）中，装入量为摇瓶总体积的1/10, 2层纱布封口，121.3℃，灭菌15-20min。
4 接种
待培养基温度降至40℃以下时，将活化的黑曲霉孢子（约为4-5片麸皮）接种入培养基中，在33-36℃，200/min的摇床中20h左右，培养后菌体浓度应达60万～150万/ml，菌丝球为致密形的，菌球直径不应超过0.1mm，菌丝短，且粗壮，分支少，瘤状，部分膨胀为优。
三、发酵培养
1 发酵培养基的配置
取20%葡萄糖溶液分别按20：1、10：1、5：1加入玉米糖化液，配成培养基。
2 分装、灭菌
取40ml混合后的培养基加入500ml摇瓶（小于总体积的1/10），2层纱布封口，121.3℃，灭菌15-20min。
3 接种
待培养基温度降至40℃以下，接入发酵种子2ml，24h前于转速100r/min，24h后于转速200-300r/min摇床上，35℃连续培养72h。
将发酵液高温灭活，待处理。
4 发酵过程检测
4.1 pH 值的检测
每隔12 小时检查pH 值。
4.2 黑曲霉菌丝形态的观察
每隔12 小时镜检黑曲霉菌丝的形态变化。
检测方法如下：
4.2.1黑曲霉镜检
方法一：直接取一滴发酵液于载玻片上，用盖玻片密封后镜检。
方法二：镜检过程：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检（染料：草酸铵结晶紫液）。
4.2.2 pH 的跟踪测定：pH 计。
4.2.3柠檬酸总酸的测定
精确吸取5ml 的发酵液过滤液于100ml锥形瓶中，加入少量的去离子水，加2-3 滴0.1%酚酞指示剂，用0.1429mol/L NaOH 溶液滴定，滴定微红色计算用去的NaOH 毫升数，计为柠檬酸的百分含量（每消耗1mlNaOH 1% 的酸度）。
四、钙盐法提取柠檬酸
1. 发酵液过滤各组将发酵液合并量取发酵液总体积，离心或过滤除去菌体及残渣，准确计量取滤液（取5ml滤液，测定柠檬酸含量）。
2. 碳酸钙中和沉淀柠檬酸与碳酸钙发生中和反应，形成难溶的柠檬酸钙沉淀，碳酸钙的添加量根据滤液中柠檬酸的重量添加，比例约为柠檬酸：碳酸钙=2.1：1。
边搅拌边缓慢加入碳酸钙，以防止产生大量气泡。
碳酸钙加完后放置90℃恒温水浴中加热，保温搅拌30分钟，趁热过滤，并用沸水洗涤柠檬酸钙沉淀。
3. 酸解将柠檬酸钙沉淀物取出，称量，加入2倍量的水，调匀，加入浓度为10%的硫酸溶液，硫酸的添加量根据碳酸钙的量计算，碳酸钙与硫酸的摩尔比为1：1.5。
加完硫酸后，搅拌30分钟，过滤，得清亮的棕黄色液体，取样测定柠檬酸的含量，并准确计量柠檬酸液体积。
4. 结晶取柠檬酸液置电热板上加热浓缩，静置析出结晶。
【实验结果】
1. 麸曲外观检查。
2、发酵培养过程中的情况变化
3. 各步提取收率
【注意事项】
1. 麸皮一定要洗净，否则易产生杂菌；
2.用碘液检验淀粉时，要用水稀释。
装入摇瓶的培养基不能太多，否则培养过程中黑曲霉所需要的氧气不充分。
3. 灭菌时注意排除消毒锅内空气，待排气孔无冷凝水滴下即可认为空气排净；
4.进行下一步操作前应用显微镜检测菌球的生长状况，若菌丝细长则说明黑曲霉已经提前进入柠檬酸发酵时期，会导致后期的柠檬酸产量降低。
5. 发酵过程中不能断氧，否则发酵失败。
【思考题】
1、实验室种子制备的原则是什么？
2、柠檬酸的粗提过程中损失的步骤有哪些？
3、从黑曲霉活化至最后进入摇瓶发酵，中间可否省略发酵种子扩大培养这一步？为什么？【实验报告】
1. 姓名、班级、学号、小组编号、试验开始日期/时间。
2. 实验报告包括实验目的、实验原理、实验步骤、注意事项、试验结果、误差分析、思考题等。