pUC19 DNA的限制酶切位点图

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限制性酶酶切位点图谱ydl

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ClonExpress_MultiS多片段一步克隆定向克隆无缝克隆快速克隆试剂盒说明书

Vazyme biotech co., ltd.
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１／产品概要
ClonExpressTM快速克隆技术 ClonExpressTM技术是一种简单、快速并且高效的DNA定向克隆技术，可将插入片段PCR 产物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR 引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp～20 bp)。这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在ExnaseTM的催化下，仅需反应 30 min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。 ClonExpressTM MultiS是新一代的重组克隆试剂盒，该试剂盒中包含有专门针对多片段重组反应而优化的反应缓冲液和重组酶ExnaseTM MultiS。使用该试剂盒，可以一次实现多至五个插入片段的顺序拼接克隆。此外，ExnaseTM MultiS还兼容常规酶切、PCR反应体系。克隆载体酶切产物或PCR产物以及插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆，极大的简化了实验步骤。产品优点 -简单、快速、高效 -适用于向几乎任何载体的任何位点进行多片段拼接克隆 -无需考虑插入片段自身携带的酶切位点 -可一次实现多至五个插入片段的顺序拼接克隆 -线性化克隆载体和PCR产物可不进行纯化直接克隆应用范围 -多片段拼接克隆 -全基因合成
图二：第一片段的正向扩增引物和第三片段的反向扩增引物设计示意注：如最终引物长度超过40 bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。

基于Xcm I酶切的pUC19-T载体的构建

基于Xcm I酶切的pUC19-T载体的构建孙程龙;李业伟;王颖;宫婷;扈荣良【摘要】[ Objective] The paper aimed to construct a new T vector based on plasmid pUC19 digested with Xcm Ⅰ. [ Method] Two complementary oligonucleotide chains containing two Xcm Ⅰ sites were synthesized. After denaturation and renaturation, the adaptor was cloned into plasmidpUC19 between the Hind Ⅲ and BamH Ⅰ sites. The new plasmid, pUC19-HB-T vector, was digested with Xcm Ⅰ to derive a T-vector with 3' end overhanging a T base. [ Result] The constructed pUCI9-HB-T vector was efficient incloning PER products, with an efficiency of 95％ at least.[ Conclusion] A new Xcm Ⅰ-based pUCI9-HB-T vector was constructed, which could be applied to cloning of PER products and other microbiology operations.%[目的]构建以pUC19质粒为基础可利用Xcm I内切酶制备的T载体.[方法]化学合成2条含有双Xcm I酶切位点的互补寡聚核苷酸链,经过变性、复性后克隆入PUC19质粒的Hind Ⅲ和BamH I位点之间,通过Xcm I酶切后得到一个线性化的带有3'末端突出一个T碱基的T载体.[结果]经TA克隆验证,制备的pUC19-HB-T载体对PCR产物的克隆率达到95%以上.[结论]构建的pUC19-HB-T载体可用于PCR产物的克隆、测序及后续分子生物学操作.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)017【总页数】3页(P10182-10184)【关键词】T载体;Xcm I限制性内切酶;TA克隆【作者】孙程龙;李业伟;王颖;宫婷;扈荣良【作者单位】吉林大学畜牧兽医学院,吉林,长春,130062;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林,长春,130122;吉林大学畜牧兽医学院,吉林,长春,130062;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林,长春,130122;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林,长春,130122;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林,长春,130122;吉林农业大学动物科技学院,吉林,长春,130122;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林,长春,130122【正文语种】中文【中图分类】S132PCR作为分子生物学的一项基本技术，是目前体外DNA扩增最常用的方法，而PCR产物的克隆是对其进行鉴定、扩增以及实现PCR产物多种用途的必经之路。

实验二质粒pUC19限制性酶切及电泳检测

实验二质粒pUC19限制性酶切及电泳检测采用分子生物学软件查找质粒DNA的酶切位点，然后利用限制性内切酶对质粒DNA进行酶切反应，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离和凝胶成像系统进行分析鉴定。

本实验要求：1．掌握质粒DNA的限制性内切酶酶切分析，了解内切酶的性质。

2．学习DNA的电泳检测。

原理限制性内切酶（restriction enzyme）存在于细菌细胞中，起防御噬菌体感染的作用。

由于它们对DNA的剪切作用，因此内切酶可作为分子生物学研究者的“剪刀”广泛应用于基因操作中。

限制性核酸内切酶可分为三类，重组DNA技术中常用的限制性核酸内切酶为Ⅱ类酶。

绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如Eco RⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。

内切酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA 片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3')；有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如Eco RⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

本实验是对提取的质粒pUC19进行酶切分析。

首先需要应用分子生物学软件分析质粒的酶切位点，推荐使用的软件有：Primer Premier 5.0、Vector NTI、DNAMAN和NEB-cutter等。

DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。

在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。

琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。

在电场中，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率由DNA的分子大小、构象等因素决定。

亚克隆ppt课件

2. 涉及到酶的操作时,一律在冰上操作
3. 使用移液器吸取酶时，tip头只能刚刚插入液面吸取
4. 如果有多个反应，酶、buffer、水等应配制
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成mixture再分装
BamH I：
G▼GATT C C CTAA▲G
Kpn I:
G GTAC▼C C▲CATG G
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含外源DNA片段的载体(M812) 的限制性内切酶消化目的载体（pUC19)
不同的酶对上述因素的敏感程度不同
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典型的限制性内切酶作用的缓冲体系成分包括：
氯化镁、氯化钠/钾、Tris盐酸盐、 β－巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）牛血清白蛋白（BSA）
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注意 1. 注意阅读商家提供的产品说明书，了解所使
用工具酶的浓度和最适作用条件，不要用错了buffer和作用的温度等
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质粒电泳检测
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本科生试验图片
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利用质粒克隆外源DNA片段的主要步骤
质粒载体的抽提，外源DNA的准备琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量亚克隆载体与外源DNA的限制性内切酶消化 (目的片段的回收，亚克隆载体的去磷酸化) 载体与外源DNA的连接感受态细胞的制备连接子转化感受态细胞重组子的转化及筛选、鉴定
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质粒DNA质量检测
1. DNA纯度：吸光值检测：检测260nm、280nm吸光值，紫外分光光度计A260/A280=1.8－1.9； 1.8 最佳，低于1.6说明有蛋白质，大于1.9说明有 RNA。
2. 质量检测：琼脂糖凝胶电泳：一般有三条带（超螺旋、开环、线型三种构型），点样孔附近无DNA带（无染色体DNA污染）。
6
质粒DNA的提取

pUC19K质粒的构建及其在布鲁氏菌突变株构建中的应用

了布鲁氏菌外膜蛋白 om p25基因 BM E I1249的突变株。根据 2. 1所述的原理 ,首先分别将 N 端和 C 端同源臂扩增出来 ,依次插入到 pUC19K的两个多克隆位点 ,得到突变载体 pUC19KΟNC (结果略 ) 。然后将该重组质粒电转化到布鲁氏菌中 ,用卡那抗性筛选出抗性克隆。 PCR 鉴定突变株 ,结果显示突变株和野生株均能扩增出布鲁氏菌属保守序列 16S基因 ,表明皆为布鲁氏菌 ; 用鉴定引物 KanaΟIΟF 与 BME I1249 ΟIΟR 组合在突变株能够扩增出预期大小的特异片段 ,而野生株扩增为阴性 ,初步表明卡那抗性基因正确替换了 BM E I1249 基因 (图 3) 。然后又对扩增产物进行了序列测定 ,序列分析显示与预期完全一致 ,表明突变株构建成功 (结果略 ) 。
1. 2 试剂盒、酶和试剂 PCR 产物纯化、琼脂糖凝胶回收及质粒提取的试剂盒均购自 Promega公司 ,限制性内切酶购自 TaKaRa 公司 , T4 DNA 连接酶购自 NEB 公司 ,其它试剂为国产分析纯。 1. 3 pUC19K载体的构建根据 pBBR1MCSΟ2 质粒中卡那抗性基因的序列 , 用 PR IMER 5软件设计一对引物 pUC19KΟF和 pUC19K ΟR。其中上游引物 pUC19KΟF的 5′端添加 B am H I、X ho I 和 A pa I酶切位点 , 下游引物 pUC19KΟR 的 5′端添加 S a l I、EcoRV、X ba I和 M lu I酶切位点。上下游引物的最外侧切点分别是 B am H I和 S a l I,用于将整个片段克隆到 pUC19质粒。利用这对引物从 pBBR1MCSΟ2 中扩增卡那抗性基因 , PCR 产物用 B am H I和 S a l I酶切后与相同酶切处理的 pUC19 质粒连接 ,连接产物转化 DH5α 得到重组质粒 pUC19K。利用单酶切的方法分析添加的多克隆位点 ,确认正确后送测序公司测序。 1. 4 突变盒的构建根据外膜蛋白 om p25 基因 (BME I1249 ) 及两侧的序列 ,设计扩增同源臂 N 端和 C端的引物 ,扩增 N 端同源臂的引物为 BME I1249 ΟN ΟF 和 BM E I1249 ΟN ΟR , 5′端酶切位点为 Kpn I和 X ho I; 扩增 N 端同源臂的引物为 BME I1249ΟCΟF和 BM E I1249ΟCΟR , 5′端酶切位点为 S a l I 和 H ind III。分别扩增 N 端和 C端同源臂后 ,先将 N 端片段插入到 pUC19K 的 Kpn I 和 X ho I 位点 , 得到 pUC19KΟN;然后将 C 端片段插入到 pUC19KΟN 的 S a l I 和 H ind III位点 ,得到含有突变盒的质粒 pUC19KΟNC。质粒 pUC19KΟNC经 PCR 和酶切鉴定正确之后 ,测序确定序列的正确性。

《基因工程与细胞工程》质粒DNA的限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切图谱实验

《基因工程与细胞工程》质粒DNA的限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切图谱实验【实验目的】1、掌握实用的分子生物学基本操作技术；2、提高处理DNA样品的操作技能；3、学会使用限制性内切酶对DNA样品进行酶切；4、学会配制琼脂糖凝胶；5、学会使用电泳技术分析和鉴定DNA分子。

【实验原理】1、质粒DNA的限制性酶切DNA的酶法操作是DNA重组技术中一项最常用的工具。

特别是一系列限制性内切核酸酶的使用，能够在特异性位点切割DNA，对从分子水平上认识基因的结构与功能和进行重组DNA技术研究是非常有用的。

限制性内切酶来源于细菌，能够在特异性的目标序列中（即限制性酶切位点）切割双链DNA，从而产生特定的DNA片段（即限制性酶切片段）。

内切酶是细菌限制与修饰体系中的一员，能够使细菌细胞免受外源性DNA的侵害，即通过切割噬菌体DNA中的特异性位点来限制细菌噬菌体的繁殖，从而抑制噬菌体对细菌细胞内的入侵。

细菌通过修饰限制酶的识别位点来防止限制酶破坏其自身的DNA，通常是利用对识别位点中1个碱基的甲基化修饰来实现的。

历年来，从细菌细胞内分离纯化的限制性内切酶的种类在不断增加，并越来越多的被分子生物学家应用到DNA的体外操作中。

每种限制酶都能识别1段特异的DNA序列，其中最常见的是长度为4-6 bp的回文序列（反向重复序列）。

同时，不同种类的限制酶在识别的切割位点是不同的，有些可能是在识别位点的中间切开，产生平末端（钝末端）；而另一些限制酶可能是将识别位点错位切开，生成5’或3’突出末端（黏性末端）。

表2列举了本实验中所使用的2种限制酶的识别位点和切割位点。

表2 2种限制酶的识别位点和切割位点注：↓或↑：表示酶切位点。

2、DNA限制性内切酶酶切图谱（1）图谱简介DNA限制性内切酶酶切图谱，又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。

在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP（限制性片段长度多态性）技术更是建立在它的基础上。

ClonExpress_MultiS多片段一步克隆定向克隆无缝克隆快速克隆试剂盒说明书

TM
环状质粒扩增特异 PCR制备有明显非特异性扩增预线性化质粒、基因组、cDNA
胶回收
表一：线性化克隆载体的使用方式注：直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4 μl (重组反应总体积的1/5) 。
４．２线性化克隆载体制备选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。我们推荐您尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。当载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在
图二：第一片段的正向扩增引物和第三片段的反向扩增引物设计示意注：如最终引物长度超过40 bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。

05/ 06
PCR结束后，取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性。 ClonExpressTM MultiS重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板不是与克隆载体抗性相同的环状质粒，且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。 PCR扩增产物DNA纯度较低，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行较大片段 (>5kb) 克隆实验时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对扩增产物进行胶回收纯化以提高DNA纯度。插入片段扩增产物的使用方式可查阅表二。
注意: 我们推荐您在PCR仪或者水浴锅等温控比较精确的仪器上进行反应。重组效率在反应30 min左右达到最高，反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率。
扩增特异
有明显非特异性扩增
表二：扩增产物推荐使用方式注：直接使用扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4 μl (重组反应总体积的1/5)。 * 当线性化克隆载体为酶切制备时，插入片段扩增产物经DpnI消化结束后应置于85℃加热20 min将DpnI 失活，以避免重组反应时残留DpnI 对克隆载体的降解。

重组质粒的PCR实验

重组质粒的PCR实验李笃财 201200140048 生科一班一．实验目的1．学习利用PCR产物回收试剂盒回收PCR产物；2．掌握基因克隆的基本操作过程3．了解利用T载体进行PCR产物克隆的基本原理4．进一步巩固PCR扩增及电泳检测技术二．实验原理（一）重组质粒酶切鉴定将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。

（二）PCRPCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。

这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。

本次实验旨在通过学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。

1.聚合酶链式反应原理PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法。

反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增。

置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新链。

由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。

PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。

限制酶酶切位点

限制酶酶切位点限制酶酶切位点是一种常见的分子生物学技术，用于在DNA或RNA分子中特定的序列上进行切割。

酶切位点是酶识别的特定序列，一旦找到该序列，酶便会在该位置切割DNA或RNA分子。

限制酶酶切位点在基因工程和分子生物学研究中起着至关重要的作用，下面将详细介绍限制酶酶切位点的相关知识。

酶切位点是由限制酶识别的特定DNA或RNA序列决定的。

限制酶是一类能够识别并切割DNA或RNA特定序列的酶，也被称为内切酶。

限制酶通常识别的切割位点是对称的，可以是4-8个碱基对长。

常见的限制酶有EcoRI、HindIII、BamHI等。

限制酶酶切位点的限制酶识别序列通常具有一定的保守性，也就是说，相同的限制酶通常会识别相似的序列。

例如，EcoRI识别的酶切位点序列为5'-GAATTC-3'，其中GAATTC为限制酶识别序列，5'和3'分别表示DNA的两个末端。

限制酶酶切位点的限制酶识别序列通常具有一定的特异性，也就是说，相同的限制酶通常只会识别特定的序列。

例如，EcoRI只会识别5'-GAATTC-3'序列，而不会识别其他序列。

限制酶酶切位点的选择对于实验的设计非常重要。

在分子生物学实验中，科研人员常常需要在特定的DNA或RNA序列上进行切割，以便进一步进行下游实验，如限制酶切割后的DNA片段的连接、测序等。

因此，选择适当的限制酶和相应的酶切位点非常关键。

限制酶酶切位点的选择需要考虑多个因素。

首先，需要考虑实验所需的切割位点是否存在于DNA或RNA序列中。

其次，需要考虑限制酶的切割效率和特异性。

一些限制酶可能对特定的序列有更高的切割效率，而对其他序列的切割效率较低。

此外，还需要考虑限制酶的切割位点的位置是否适合实验的要求。

在实际应用中，科研人员常常需要将限制酶切割后的DNA片段进行连接，以构建重组DNA分子。

在这种情况下，选择具有兼容的酶切位点的限制酶非常重要。

兼容的酶切位点是指两个限制酶切割产生的DNA片段的末端具有相同的序列。

重组质粒的酶切鉴定及PCR实验

重组质粒的酶切鉴定及PCR实验陈倩倩（交流生） 118627140313一，实验目的1，检验重组质粒的插入片段的大小2，学习PCR技术的使用二，实验原理PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。

反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。

Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。

平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。

反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。

大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。

短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。

史上最全限制性内切酶酶切位点汇总

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常见分子试验限制性内切酶酶切位点大全

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ClonExpress MultiS多片段一步克隆定向克隆无缝克隆快速克隆试剂盒说明书

TM
环状质粒扩增特异 PCR制备有明显非特异性扩增预线性化质粒、基因组、cDNA
胶回收
表一：线性化克隆载体的使用方式注：直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4 μl (重组反应总体积的1/5) 。
４．２线性化克隆载体制备选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。我们推荐您尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。当载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在
clonexpressmultis多片段一步克隆定向克隆无缝克隆快速克隆试剂盒说明书
ClonExpressTM MultiS
One Step Cloning Kit
Vazyme Biotech Co., Lt/Sales: sales@ 技术支持/Support: support@ 技术服务/Service: service@
ClonExpressTM MultiS试剂盒中提供pUC19 control vector, linearized (50 ng/μl)和Control insert Mix (0.5 kb, 10 ng/μl; 1 kb, 20 ng/μl; 2 kb, 40 ng/μl)各5 μl，需要时可进行阳性对照反应，每次反应各加1 μl。体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡 (请勿剧烈震荡
产品概要产品组成贮藏条件实验方案参考实例注意事项常见问题与解决方案

-DNA定点突变
２／产品组成
组分
5 × CE MultiS Buffer ExnaseTM MultiS pUC19 control vector, linearized (50 ng/μl) Control insert Mix (0.5 kb, 10 ng/μl; 1 kb, 20 ng/μl; 2 kb, 40 ng/μl)

限制性酶的酶切位点

各种限制性酶的酶切位点Enzyme Name SequenceAatI AGG!CCTAatII GACGT!CAccI GT!MKACAccII CG!CGAccIII T!CCGGAAcyI GR!CGYCAflI G!GWCCAflII C!TTAAGAflIII A!CRYGTAhaI CC!SGGAhaII GR!CGYCAhaIII TTT!AAAAluI AG!CT AlwI GGATCNNNN! AlwI !NNNNNGATCC AlwNI CAGNNN!CTGAocI CC!TNAGGAocII GDGCH!C AosI TGC!GCAAosII GR!CGYCApaI GGGCC!CApaLI G!TGCACApyI CC!WGGAquI C!YCGRGAseI AT!TAATAspI GAANN!NNTTCAspI G!GTACCAspI GACN!NNGTCAsuI G!GNCC AsuII TT!CGAAAvaI C!YCGRGAvaII G!GWCCAvaIII ATGCA!TAvrI !CYCGRGAvrII C!CTAGGAxyI CC!TNAGGBalI TGG!CCABamHI G!GATCCBanI G!GYRCCBanII GRGCY!CBanIII AT!CGATBbeI GGCGC!CBbiII/AcyI GR!CGYCBbvI GCAGCNNNNNNNN!BbvI !NNNNNNNNNNNNGCTGCBbvII GAAGACNN!BbvII !NNNNNNGTCTTCBcefI ACGGCNNNNNNNNNNNN!BcefI !NNNNNNNNNNNNNGCCGTBclI T!GATCABcnI CC!SGGBglI GCCNNNN!NGGCBglII A!GATCTBinI !NNNNNGATCC BinI GGATCNNNN! BsePI !GCGCGCBsmAI !GTCTCBsmAI !GAGACBsmI GAATGCN!BsmI G!CATTCBspI GDGCH!CBspHI T!CATGABspMI ACCTGCNNNN!BspMI !NNNNNNNNGCAGGTBspMII T!CCGGABsrI ACTGGN!BsrI C!CAGTBssHII G!CGCGCBstBI TT!CGAABstEII G!GTNACCBstI G!GATCCBstNI CC!WGGBstPI G!GTNACCBstUI CG!CGBstXI CCANNNNN!NTGGBstYI R!GATCYBsuI CC!TNAGGCcrI C!TCGAGCfoI GCG!CCfrI R!CCGGYCfrI G!GNCCCfrI Y!GGCCRClaI AT!CGATCviJI RG!CY CvnI CC!TNAGGDdeI C!TNAGDpnI GA!TC DraI TTT!AAADraII RG!GNCCYDraIII CACNNN!GTGDsaI C!CRYGGEaeI Y!GGCCREagI C!GGCCGEarI !CTCTTCEarI !GAAGAGEclXI C!GGCCGEcoI TAC!GTAEcoI GGTCTCN!EcoI !NNNNNGAGACCEcoI G!GWCCEcoIII AGC!GCTEcoI C!GGCCGEcoI !CTGAAGEcoI !CTTCAGEcoI CC!TNAGGEcoNI CCTNN!NNNAGGEcoOI RG!GNCCYEcoRI G!AATTCEcoRII !CCWGGEcoRV GAT!ATC EcoTI C!CWWGGEcoTI ATGCA!TEcoTI GRGCY!C EheI GGC!GCCEspI GC!TNAGCFinI !GTCCCFinI !GGGACFnuHI GC!NGCFokI GGATGNNNNNNNNN!FokI !NNNNNNNNNNNNNCATCCFspI TGC!GCAGdiII !NNNNNYGGCCGGdiII CGGCCRN!GsuI !CTCCAGGsuI !CTGGAGHaeI WGG!CCWHaeII RGCGC!YHaeIII GG!CC HapII C!CGGHgaI GACGCNNNNN!HgaI !NNNNNNNNNNGCGTCHgiAI GWGCW!CHgiEII !ACCNNNNNNGGTHhaI GCG!CHinI GR!CGYCHinPI G!CGCHincII GTY!RACHindIII A!AGCTT HinfI G!ANTCHpaI GTT!AACHpaII C!CGGHphI GGTGANNNNNNNN!HphI !NNNNNNNTCACCKpnI GGTAC!CKspI CTCTTCN!KspI !NNNNGAAGAGMaeI C!TAGMaeII A!CGTMaeIII !GTNACMboI !GATC MboII GAAGANNNNNNNN!MboII !NNNNNNNTCTTCMfeI !CAATTGMflI R!GATCYMluI A!CGCGTMmeI !TCCRACMmeI !GTYGGAMnlI CCTCNNNNNNN!MnlI !NNNNNNNGAGGMroI T!CCGGAMseI T!TAAMspI C!CGGMstI TGC!GCAMstII CC!TNAGGMvaI CC!WGGNaeI GCC!GGCNarI GG!CGCCNciI CC!SGGNcoI C!CATGGNdeI CA!TATGNdeII !GATCNheI G!CTAGCNlaIII CATG!NlaIV GGN!NCCNruI TCG!CGANsiI ATGCA!TNsp()I RCATG!YNsp()V TT!CGAANspBII CMG!CKGNspII GDGCH!CNspIII C!YCGRGNspIV G!GNCC NunII GG!CGCCPaeR C!TCGAGPalI GG!CCPflMI CCANNNN!NTGGPleI GAGTCNNNN!PleI !NNNNNGACTCPmaCI CAC!GTGPpuMI RG!GWCCYPstI CTGCA!GPvuI CGAT!CGPvuII CAG!CTGRsaI GT!ACRsrI G!AATTCSacI GAGCT!CSacII CCGC!GGSalI G!TCGACSauAI !GATCSauI G!GNCC SauI CC!TNAGGScaI AGT!ACTScrFI CC!NGGSduI GDGCH!CSecI C!CNNGGSexI !CTCGAGSfaNI GCATCNNNNN!SfaNI !NNNNNNNNNGATGCSfiI GGCCNNNN!NGGCCSinI G!GWCCSmaI CCC!GGGSnaBI TAC!GTASnaI !GTATACSpeI A!CTAGTSphI GCATG!CSplI C!GTACGSspI AAT!ATTSstI GAGCT!CSstII CCGC!GGSstIII !ACGTStuI AGG!CCTStyI C!CWWGGStySJI !GAGNNNNNNGTRCStySJI !GYACNNNNNNCTCTaqI T!CGATaqII GACCGANNNNNNNNNNN!TaqII !NNNNNNNNNTCGGTCTaqII CACCCANNNNNNNNNNN!TaqII !NNNNNNNNNTGGGTGThaI CG!CGTspI !GTSACTspEI !AATT TthI GACN!NNGTCTthII CAARCANNNNNNNNNNN!TthII !NNNNNNNNNTGYTTGTthHBI T!CGAVspI AT!TAATXbaI T!CTAGAXcyI C!CCGGGXhoI C!TCGAGXhoII R!GATCY XmaI C!CCGGGXmaIII C!GGCCGXmnI GAANN!NNTTCXorII CGAT!CG。

ClonExpress MultiS多片段一步克隆定向克隆无缝克隆快速克隆试剂盒说明书

注意: 1. 线性化克隆载体的使用量应在50～200 ng之间。当使用上述公式计算DNA最适使用量超出这个范围时，直接选择最低/最高使用量即可。 2. 插入片段DNA使用量应大于10 ng。当使用上述公式计算DNA最适使用量低于这个值时，直接使用 10 ng即可。 3. 线性化克隆载体和插入片段扩增产物不进行DNA纯化直接使用时，加入总体积应不超过反应体系体积的1/5，即4 μl。

Vazyme biotech co., ltd.
使用说明书
Version 3.2
目录 Catalog
１／产品概要
ClonExpressTM快速克隆技术 ClonExpressTM技术是一种简单、快速并且高效的DNA定向克隆技术，可将插入片段PCR 产物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR 引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp～20 bp)。这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在ExnaseTM的催化下，仅需反应 30 min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。 ClonExpressTM MultiS是新一代的重组克隆试剂盒，该试剂盒中包含有专门针对多片段重组反应而优化的反应缓冲液和重组酶ExnaseTM MultiS。使用该试剂盒，可以一次实现多至五个插入片段的顺序拼接克隆。此外，ExnaseTM MultiS还兼容常规酶切、PCR反应体系。克隆载体酶切产物或PCR产物以及插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆，极大的简化了实验步骤。产品优点 -简单、快速、高效 -适用于向几乎任何载体的任何位点进行多片段拼接克隆 -无需考虑插入片段自身携带的酶切位点 -可一次实现多至五个插入片段的顺序拼接克隆 -线性化克隆载体和PCR产物可不进行纯化直接克隆应用范围 -多片段拼接克隆 -全基因合成

pUC19 DNA的限制酶切位点图

限制性酶酶切位点图谱ydl

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基于Xcm I酶切的pUC19-T载体的构建

实验二 质粒pUC19限制性酶切及电泳检测

亚克隆ppt课件

pUC19K质粒的构建及其在布鲁氏菌突变株构建中的应用

《基因工程与细胞工程》质粒DNA的限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切图谱实验

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重组质粒的PCR实验

限制酶酶切位点

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实验二质粒pUC19限制性酶切及电泳检测