Solexa-测序技术原理介绍_20120715

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Solexa测序原理及实验流程

Solexa测序原理及实验流程(2011-04-19 09:45:04)Solexa 高通量测序原理Solexa 方法是利用单分子阵列测试 genotyping ，此种测序法首先是将 DNA 从细胞中提取，然后将其打断到约 100 － 200bp 大小，再将接头连接到片段上，经 PCR 扩增后制成 Library 。

随后在含有接头的芯片（ flow cell ）上将已加入接头的 DNA 片段绑定在 flow cell 上，经反应，将不同片段扩增。

在下一步反应中，四种荧光标记的染料应用边合成边测序的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。

互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。

多余的核苷被移走。

这样每个单链 DNA 分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来提供检测信号。

针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个标记会释放出荧光。

荧光信号被 CCD 采集， CCD 快速扫描整个阵列检测特定的结合到每个片断上的碱基。

通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。

Solexa 的这种方法，可在一个反应中同时加入 4 种核苷的标签，采用边合成边测序（SBS － sequencing by synthesis），可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。

并具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点，此反应可以同时检测上亿个核苷酸片断 , 因此在同一个芯片或几个芯片上花费很少（只需常规方法的 1 ％）的成本就可测试全基因组。

实验流程1. 文库制备将基因组DNA打成几百个碱基（或更短）的小片段，在片段的两个末端加上接头(adapter)。

2. 产生DNA簇利用专利的芯片，其表面连接有一层单链引物，DNA片段变成单链后通过与芯片表面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片上。

第二代测序技术介绍

第二代测序技术介绍第二代测序技术，也被称为高通量测序技术，是指在测序过程中同时进行多个DNA分子的测序，从而大大提高了测序的速度和效率。

相对于第一代测序技术，第二代测序技术具有更高的通量、更低的成本和更快的速度，在基因组学、生物信息学、医学和生物学等领域有着广泛的应用。

Illumina（Solexa）测序是目前应用最广泛的第二代测序技术。

它基于细胞自组装技术，通过将DNA片段固定在玻璃基质上，并利用化学物质来控制DNA的扩增和添加荧光标记的核苷酸，实现对DNA片段的扩增和测序。

Illumina测序技术具有高通量、高准确性和低成本的特点，适用于基因组、转录组和表观组测序。

Ion Torrent测序是一种基于半导体技术的第二代测序技术。

它利用DNA聚合酶酶活性引发的质子释放来检测DNA的序列，并通过电信号的变化来记录测序结果。

相较于其他技术，Ion Torrent测序具有简单、快速和低成本的优点，适用于小型测序项目和临床应用。

454测序是第二代测序技术中的一种经典方法。

它基于乳酸菌酶（Luciferase）酶活性，将测序反应中的核苷酸加入到DNA链的末端，在光信号的测量下实现测序。

由于454测序采用的是无法扩增的方法，因此其通量较低，但在研究复杂序列、病毒学和微生物学等领域仍有一定的应用。

与第一代测序技术相比，第二代测序技术具有几个重要的优点。

首先，第二代测序技术可以同时测序多个DNA分子，大大提高了测序的通量和效率。

其次，第二代测序技术的成本更低，可以用于大规模的测序项目。

第三，第二代测序技术的速度更快，可以在较短的时间内完成测序。

最后，第二代测序技术对样本的要求更低，可以从少量样本中获取足够的DNA序列信息。

总之，第二代测序技术的出现和发展为生物信息学和基因组学领域的研究提供了巨大的机会和挑战。

通过不断的技术创新和优化，第二代测序技术将进一步推动基因组学和生物学等领域的发展，为人类健康和疾病研究提供更多的解决方案。

illumina-solexa原理

Illumina-Solexa技术是一种广泛应用于基因组学和生物信息学领域的测序技术，它通过读取生物个体的基因组序列数据，从而实现对生物体的遗传结构和进化历史等方面的研究。

本文将详细介绍Illumina-Solexa技术的原理、应用和未来发展趋势。

一、原理Illumina-Solexa技术的基本原理是基于DNA测序仪的原理。

测序仪通过将DNA分子进行打断、标记和序列读取，实现对基因组的测序。

具体来说，Illumina-Solexa技术主要包括以下几个步骤：1.样本制备：将样本DNA样品进行打断、分离和标记，以便于测序仪进行检测。

2.测序反应：将标记后的DNA分子进行测序反应，通过测序仪的检测系统，实现对DNA分子的序列读取。

3.数据解析：将测序仪获取的序列数据进行分析和解析，得到基因组的序列信息。

Illumina-Solexa技术具有较高的测序深度和覆盖度，可以实现对生物体全基因组的深度测序，从而获得更加准确和全面的遗传信息。

二、应用Illumina-Solexa技术在基因组学、遗传学、生物信息学等领域得到了广泛的应用。

具体来说，Illumina-Solexa技术可以应用于以下几个方面：1.遗传性疾病研究：通过Illumina-Solexa技术对遗传性疾病患者的基因组进行测序，可以发现与遗传性疾病相关的基因突变和遗传变异，为遗传性疾病的预防、诊断和治疗2.进化生物学研究：通过对不同物种的基因组进行比较分析，可以研究物种的进化关系、物种起源和演化过程。

3.基因表达研究：Illumina-Solexa技术可以对基因表达谱进行高通量测序和分析，从而了解不同细胞或组织中基因的表达情况，为研究细胞或组织的生理状态提供依据。

4.生物多样性研究：通过对生物多样性的样本进行Illumina-Solexa 技术测序，可以了解物种的遗传结构和分布情况，为生物多样性的保护和管理提供依据。

三、未来发展趋势随着测序技术的不断发展，Illumina-Solexa技术也将在未来得到更加广泛的应用。

Illumina Solexa NGS

建库
即样本制备过程，将DNA打断到大小适宜的片段，在DNA片段两端加上测序接头，完成建库工作。
首先准备基因组DNA（100—200ng），然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA 反转成cDNA，然后再片段化并加上接头。片段的大小（Insert size）对于后面的数据分析有影响，可根据需要来选择。对于基
Illumina Solexa NGS
DNA二代测序Solexa技术
Illumina Solexa
Solexa技术最早由两位剑桥大学和Sanger的科学家创立，利用专利核心技术 “DNA簇”和“可逆性末端终结”，达成自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。 Illumina作为测序行业的龙头企业，于2006年收购Solexa公司，获得新一代高通量测序技术，从而成为目前市场上的主流测序满足Small RNA 测序的读长要求，且数据读取量大，性价比高，因此Solexa在Small RNA测序方面得到广泛的应用
(1) PAGE胶纯化特定大小的小RNA分子； (2) 5′接头连接和纯化； (3) 3′接头连接纯化； (4) RT-chnoli基延伸测序（Single Base Extension and Sequencing）
完成好扩增的DNA片段紧密结合在flowcell上，加入带有荧光信号的dNTP，检测与 DNA片段结合的dNTP信号来获得碱基信息。簇扩增及测序同时进行。即在碱基延伸过程中，每个循环反应只能延伸一个正确互补的碱基，根据四种不同的荧光信号确认碱基种类，保证最终的核酸序列质量，经过多个循环后，完整读取核酸序列二 RNA是一类高度保守的长度在18-30 nt的RNA分子，主要包括miRNA、siRNA、piRNA。是生物体内一类重要的调控分子，参与细胞生长、发育、代谢、基因转录和翻译等诸多生物学过程，在疾病的发生发展转归的病理过程中也具有非常重要的作用，是一类新的极具开发潜质的生物标志物和药物靶标。

Hiseq测序原理

Flow cell 引物接头对比
Single-Read Sequencing
1.Single-Read Sequencing（SR, 单向测序）指只检测基因片段一端的基因信息。
1.样品杂交（cBot）
2.桥式PCR （cBot）
3.加测序引物（cBot）
SR测序（Hiseq）
碱基读取（Hiseq）
Hiseq测序简介
胡小利 2011-3-17
主要内容
1.Hiseq测序原理 2.Hiseq测序平台的整体架构 3.个人感想
测序原理
Solexa是一种基于边合成边测序技术（Sequencing-By-Synthesis， SBS）的新型测序技术。通过单分子阵列实现在小型芯片（Flow Cell）上进行桥式PCR反应。通过可逆阻断技术实现每次只合成一个碱基，再利用相应的激光激发荧光集团，捕获激发光，从而读取碱基信息。
Paired-End Sequencing
1. Paired-End Sequencing （PE, 双向测序）指只检测基因片段两端的基因信息。
1.样品杂交（cBot）
2.桥式PCR（ cBot ）
3.加测序引物（ cBot ）
4.PE测序（Hiseq）
Indexed Sequencing
Flow cell
宽25mm×长75mm
cBot
可逆阻断技术
Hiseq
Sequencing by synthesis
Solexa测序类型
1.Single-Read Sequencing（SR）单向测序
2.Paired-End Sequencing（PE）双向测序
3.Indexed Sequencing 混合样品测序

北京师范大学生物化学课件---solexa测序原理及应用

第 5 页共 15 页
目标基因组片段化
新一代高通量 DNA 测序技术
片段拼接
补洞
新一代 DNA 测序技术在全基因组测序应用中的技术路线
二、全基因组表达谱分析：
第 6 页共 15 页
基于新一代测序技术的表达谱分析原理
和附近的另外一个引物互补，被“锚定”住，形成“桥“(bridge)； 5、在测序芯片上同时有上千万 DNA 单分子发生以上的反应； 6、4 中形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在测序芯片表面再次进行扩增，形
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成双链；

7、双链经变性成单链，再次形成桥，成为下一轮扩增的模板继续扩增反应；
Solexa 技术的基本原理: 1、基因组 DNA 被随机打断成为小的 DNA 片断；并在 DNA 片断的两端连上接头
(adapter)； 2、Solexa 测序专用的测序芯片（flow cell）表面连接有一层单链引物（Primer）,单链状
态的 DNA 片断与芯片表面的引物通过碱基互补被一端“锚定”在芯片上； 3、通过扩增反应使得单链 DNA 成为双链 DNA； 4、双链再次变性后成为单链，其一端“锚定”在测序芯片上，另外一端（5’或 3’）随机
Solexa 技术介绍： Solexa 技术最早由两位剑桥大学的化学家创立，利用专利核心技术“DNA 簇” 和“可逆性末端终结”，达成自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序，具有高准确性，高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势。可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。
其他应用：DNA 甲基化分析，Metagenomics 等。
一、基因组测序和重测序： 1、经典案例

二代基因测序原理

二代基因测序原理接下来，文库构建是将DNA片段连接到适当的DNA测序模版上，以建立DNA文库。

这通常涉及到DNA片段的断裂、连接到适配体和文库放大。

适配体是一种包含特定序列的DNA片段，用于辅助连接和模版扩增的引物。

在文库构建完成后，进行模版扩增。

这一步骤使用PCR技术，通过引物扩增文库中的DNA片段，生成大量的模版DNA。

PCR扩增周期的次数决定了特定DNA片段的拷贝数。

随着模版DNA量的增加，进入测序阶段。

二代基因测序技术主要有Illumina（原称Solexa）、Ion Torrent（美国盖奥因生物公司）和454测序（Roche）等，其中Illumina是最常用的一种。

Illumina测序平台以反应塔阵列为基础，使用化学方法进行核酸链延伸和显色标记。

首先，单个DNA模板附着到玻璃底片的合成警告员上，随后通过PCR进行扩增。

随着DNA扩增的进行，每个DNA模板会产生大量分子，每一个分子都将与一个反应塔阵列中的探针相匹配。

然后，每一个DNA模板上的反应塔中都会加入一个不完全互补的碱基，只能链延伸一次。

在每个循环的末尾，使用碱基的特定颜色标记已添加的碱基。

通过检测每个循环中的荧光信号，可以确定加入的碱基。

最后，数据分析是测序结果的处理和分析阶段。

这一步骤主要包括序列质量控制、序列拼接、序列比对和变异检测等过程。

数据分析的目标是从原始的测序数据中得出有效的生物学信息。

总结起来，二代基因测序的原理基于DNA的扩增和测序。

通过逐步处理DNA样本，建立文库，进行模版扩增，测序和数据分析，可以高效地获得大量的基因组信息。

这种技术的广泛应用已经推动了基因组学、转录组学和表观基因组学等领域的发展，并为疾病的研究和药物的开发提供了重要的基础。

Solexa测序原理及流程_--华大基因

Solexa测序原理及流程
深圳华大基因研究院
Agenda
DNA样品制备 Cluster Formation
Binding to flowcell Bridge Amplification
SBS (Sequencing By Synthesize)
One Cycle One Base
P5
3’ddN
O
ttactatgccgctggtggctctagatgt aatgatacggcgaccaccgagatctaca
s(T)10
agtgtagatctcggtggtcgccgtatcatt
gaagagctcgtatgccgtcttctgcttgaaaaaaaaaa
NaIO4
DNA insert
Melt and hybridize 3’ to primers
5’
1st
PCR oligo 2
P7
round
PCR 5’
3’
3’ 5’
3’ extension
3’
3’
5’
3’ extension
Insert
3’ 5’
3’ 5’
P7
P5
5’ 3’
SBS oligo
P7 反向互补序列
5’ 3’ 5’
Pair End
DNA样品制备
Cluster formation
Cluster Formation
Bridge Amplification Cycle
DNA synthesization
P7 P5
SBS oligo
Sequencing By Synthesization
三种特殊序列

solexa培训的资料

通过生物信息学方法对取得的序列信息进行拼接。
基于SBS的Solexa测序技术
3’-
…-5’
5’-
GTATTTTCGGCACAG
A
G
A
C
T C
T TG
Cycle 1:按顺序加入反应试剂合成第一个碱基清除未反应的碱基和试剂激发碱基荧光并收集荧光信号去除阻断基团和荧光基团
Cycle 2-n: 重复前面的步骤
Solexa仪器说明
Solexa仪器说明
直观图
特殊处理图
6 Solexa的优势
高通量：一次单通道的测序可以得到不低于 200 万条
的序列
低成本：每20个碱基只需花费一分钱，是传统Sanger
技术花费的1/100。
高分辨率：可以检测测序得到的miRNA单个碱基差异高精准度：数字的检测信号，从几个到数十万个copy
成复制链。
2.1.1 Cluster Station流程
剩下的复制链其一端“固定”在芯片上，另外一
端随机和附近的另外一个引物互补，被“固定” 住，形成“桥”(bridge) 。
形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在芯
片表面进行扩增，形成双链。
双链经变性成单链，再次形成桥，并作为下一轮
扩增的模板继续扩增反应。
精确计数
操作简便：不需重复实验多用途：基因测序；重测序；mRNA；Small RNA；
甲基化DNA；多样品测序……
谢谢!
ห้องสมุดไป่ตู้
SOLEXA
新一代的基因测序技术
上机组
1 SOLEXA测序原理
Solexa 是一种基于边合成边测序技术

新一代基因测序技术原理和应用

新一代基因测序技术原理和应用基因测序技术是解读生物基因组的重要方法之一，对于深入了解生物基因的结构和功能起着至关重要的作用。

近年来，随着科学技术的不断发展，新一代基因测序技术的出现，进一步提高了测序速度与准确度，为基因研究和应用提供了更多可能性。

一、新一代基因测序技术的原理新一代基因测序技术相比传统的Sanger测序技术，采用了高通量并行测序的方法，能够在短时间内同时测定大量的DNA序列，大大提高了测序的效率和准确度。

目前，常用的新一代基因测序技术主要包括Illumina/Solexa 测序、ABI SOLiD测序、454测序和Ion Torrent测序等。

1. Illumina/Solexa测序原理Illumina/Solexa测序是目前应用最广泛的测序技术之一。

其原理主要基于DNA合成过程中的核酸链延伸和荧光信号的检测。

首先，DNA样本经过片段化处理，生成短小的DNA片段。

随后，这些片段会与具有固定引物的光纤芯片上的端子进行连接。

接下来，在PCR反应中进行扩增，生成成千上万个复制物。

之后，将芯片放入Illumina测序仪中，通过循环终止法进行测序。

在每个循环中，通过在碱基末端发行碱基的可逆终止法，每次只释放一种具有特定荧光标记的碱基，并通过激光检测其荧光信号。

最终，通过分析测序结果的荧光信号，可以获得DNA序列。

2. ABI SOLiD测序原理ABI SOLiD（Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection）测序技术是一种通过链接寡核苷酸和检测碱基的方法进行测序。

其核心原理是通过两个同时存在的碱基标记对DNA进行测序。

首先，DNA片段经过端修复，再通过连接引物的方法进行适配体制备。

然后，在适配体上引入特定的引物序列，将这些标记不同的适配体引物链接到DNA片段上。

在测序过程中，利用红外线激光对适配体的碱基进行激发，并通过信号检测系统检测每个碱基的颜色和强度，进而确定序列。

高通量测序：第二代测序技术详细介绍

在过去几年里，新一代DNA 测序技术平台在那些大型测序实验室中迅猛发展，各种新技术犹如雨后春笋般涌现。

之所以将它们称之为新一代测序技术（next-generation sequencing），是相对于传统Sanger 测序而言的。

Sanger 测序法一直以来因可靠、准确，可以产生长的读长而被广泛应用，但是它的致命缺陷是相当慢。

十三年，一个人类基因组，这显然不是理想的速度，我们需要更高通量的测序平台。

此时，新一代测序技术应运而生，它们利用大量并行处理的能力读取多个短DNA 片段，然后拼接成一幅完整的图画。

Sanger 测序大家都比较了解，是先将基因组DNA 片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。

对于每个测序反应，挑出单克隆，并纯化质粒DNA。

每个循环测序反应产生以ddNTP 终止的，荧光标记的产物梯度，在测序仪的96 或384 毛细管中进行高分辨率的电泳分离。

当不同分子量的荧光标记片断通过检测器时，四通道发射光谱就构成了测序轨迹。

在新一代测序技术中，片断化的基因组DNA 两侧连上接头，随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR 克隆阵列（polony）。

每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。

之后进行引物杂交和酶延伸反应。

由于所有的克隆都是系在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行。

同样地，每个延伸所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，来获取测序数据。

酶拷问和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片段。

Solexa 高通量测序原理--采用大规模并行合成测序法(SBS, Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端终结技术（Reversible Terminator Chemistry）--可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。

--具有高精确度、高通量、高灵敏度和低成本等突出优势--可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究----将接头连接到片段上，经PCR 扩增后制成Library 。

SOLEXA建库和测序过程介绍

SOLEXA建库和测序过程介绍Solexa是一种高通量测序技术，由Illumina公司开发。

它使用独特的建库和测序方法，可以同时处理大量的DNA分子，并生成数百万个序列读数。

以下是Solexa建库和测序过程的详细介绍。

建库过程：1.DNA提取：将所需测序的样本中的DNA提取出来。

可以使用常见的DNA提取方法，如酚氯仿法或商用DNA提取试剂盒。

2.DNA片段化：将提取出的DNA片段化为较短的片段。

这可以通过使用特定的切割酶来实现，也可以通过超音波处理或者热处理来实现。

3.适配体连接：为了将DNA片段固定在测序平台上，需要在DNA的两端添加适配体。

适配体是一个带有特定序列的短DNA片段，可以与测序平台上的引物结合。

适配体连接可以通过使用特定的适配体和连接酶来实现。

4.PCR扩增：适配体连接后，需要对样本中的DNA片段进行PCR扩增，以便将其扩增到足够的数量，以进行后续的测序。

PCR反应使用特定的引物，它们与适配体上的序列互补。

5.大规模扩增：得到的PCR产物经过反复的PCR扩增步骤，以确保有足够的DNA片段供测序使用。

这一步通常要进行多次循环扩增。

6.库净化：将扩增产物进行净化，去除引物和未使用的PCR试剂。

7.文库质检：通过使用生物分析仪或聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法，对建立好的DNA文库进行质检，以确定其质量和浓度。

测序过程：1.空腔测序：将建立好的DNA文库装载到测序芯片上。

这些芯片由许多小腔组成，每个小腔内含有许多DNA团块。

2.序列扩增：使用PCR扩增方法，将每个小腔内的DNA团块扩增成数百万个DNA聚集体。

3.测序：在测序芯片上通过添加特定的DNA引物和荧光标记的核苷酸，进行测序。

这时，在每个小腔里的DNA聚集体中会生成一个较短的DNA片段，它带有一个特定的荧光标记。

4.荧光图像捕获：使用荧光成像系统，对测序芯片上的荧光标记进行图像捕获。

每一个荧光标记代表一个特定的DNA核苷酸。

5.数据分析：通过计算机软件对图像进行分析和处理，以确定每个小腔里的DNA片段的序列。

Solexa-测序技术原理介绍_20120715

Paired End
片段杂交
OH OH
U
P7 P5
Grafted flowcell
芯片上的接头
U
U
Template Hybridization
模板杂交
U
U
Initial extension
第一链的延长
U
U
Denaturation
变性
扩增成簇
U
U
1st cycle denaturation
变性
U
U
基于平板胶的测序技术
96通道毛细管阵列
双脱氧终止法测序反应原理
• 原理：
–原料：DNA聚合酶、DNA模板、单链寡核苷酸引物、 4种dNTP及 4种ddNTP的测序反应体系
脱氧核苷酸和双脱氧核苷酸
双脱氧终止法测序反应原理
• 测序过程：
–DNA聚合酶在模板链指导下，不断地逐个将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延伸，合成出新的与模板互补的 DNA链。
• 如何读到DNA片段的碱基信号？
–通过扩增来增加DNA的数量来放大信号 –有足够多的DNA合成反应中止于同一个碱基
• 如何读到DNA片段的连续碱基信号？
–让合成反应的中止依次出现在每个碱基上
• 如何读到一批DNA片段的连续碱基信号？
–在不同模板的反应间建立有效的隔离方式
Contents
• Sanger 测序技术原理
变性
扩增
diol diol
1st cycle 变性
diol diol
1st cycle 退火
n=35 总数
diol diol
1st cycle 延长
diol diol

solexa测序原理

A p p l i c a t i o n NN o t e :D N A S S e q u e n c i n gClonal Single Molecule Array ™TechnologySequencing templates are immobilized on a proprietary flow cell surface designed to present the DNA in a manner that facilitates access to enzymes while ensuring high stability of sur-face-bound template and low non-specific binding of fluorescently labeled nucleotides. Solid phase amplification is employed to create up to 1,000 identical copies of each single mole-cule in close proximity (diameter of 1 micron or less). Since the process does not involve photolithography, mechanical spotting or positioning of beads into wells, the Clonal Single Molecule Array technology can achieve densities of up to 10 million single molecule clusters per square centimeter.Sequencing-by-SynthesisSolexa’s Sequencing-By-Synthesis (SBS) utilizes four proprietary fluorescently labeled modified nucleotides to sequence the millions of DNA clusters present on the flow cell surface. These nucleotides, specially designed to possess a reversible termination property, allow each cycle of the sequencing reaction to occur simultaneously in the presence of all four nucleotides (A, C, T,G). In each cycle, the polymerase is able to select the correct base to incorporate, with the nat-ural competition between all four alternatives leading to higher accuracy than methods whereonly one nucleotide is present in the reaction mix at a time. Sequences where a particular base is repeated one after another (e.g., homopolymers) are addressed like any other sequence and with high accuracy.Analysis PipelineThe Solexa sequencing approach is built around a very large number of short sequence reads.Deep sampling of more than ten-fold even coverage is required to generate a consensus and thus ensure high confidence in determination of genetic differences. Such differences are identi-fied by comparison of sequence reads to a reference. Deep sampling allows the use of weighted “majority voting” and statistical analysis, similar to conventional methods, to identify homozy-gotes and heterozygotes and to distinguish sequencing errors. Each raw read base has an assigned quality score so that the software can apply a weighting factor in calling differences and generating confidence scores.The suite of software from Solexa will enable users to align sequences to a reference in rese-quencing applications. Developed in collaboration with leading researchers, Solexa’s software suite includes the full range of data collection, processing, and analysis modules to streamline collection and analysis of data with minimal user intervention. The open format of the software allows for easy access to the data at various stages of processing and analysis using simple application program interfaces.本页已使用福昕阅读器进行编辑。

基因组测序原理

参考文献：岳桂东高强高通量测序技术在动植物研究领域中的应用生命科学 2012年第42卷陈勇柳亦松曾建国，植物基因组测序的研究进展生命科学研究 2014.2 杨晓玲施苏华唐恬新一代测序技术的发展及应用前景生物技术通报 2010年第10期周晓光任鲁风李运涛张猛俞育德, 于军下一代测序技术: 技术回顾与展望生命科学
原理: 利用合成测序理论，将样本DNA的单链分子绑定在该仪器特有的没有背景荧光的玻璃表面，通过加入荧光标记的核苷酸和聚合酶到单分子阵列中，核苷酸会特异性结合到DNA分子的结合位点上通过激光激发结合在DNA子上的荧光标记的核苷酸，从而使标记物发出荧光，相机以15ms速度快速扫描整个阵列，检测特异性结合到DNA 片段上的荧光碱基之后，结合的核苷酸会被移除，然后，进入下一次结合。优缺点：不需要PCＲ扩增，所以能反映样本的真实情况，通量也较高，但由于该技术限制可读的DNA片段长度平均仅为32bp，而且其高度精密的显微镜不仅造成其仪器庞大价格昂贵，而且对环境要求高升级困难。
优点：纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，测序的准确度可达 99.8%以上，对于长达1000bp的单链DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子而言，无需进行扩增或标记就可以使用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜快速地进行DNA测序成为可能。
三代测速技术的比较
第一代测序技术：凭借其长的序列片段和高的准确率, 适合对新物种进行基因组长距框架的搭建以及后期GAP填补, 但是成本昂贵, 而且难以胜任微量 DNA 样品的测序工作。第二代测序技术： 454 适合对未知基因组从头测序, 搭建主体结构, 但在判断连续单碱基重复区时准确度不高。Solexa具有通量高、片段短、价位低的特点,适合于小片段如miRNA 的研究。 SOLID 具有双碱基编码系统的纠错能力以及较高的测序通量, 但无法在基因组拼接中的广泛应用。

Sanger&Solexa测序原理和流程

最终结果是通量的飞跃——从点到面
测序的发展方向质量Fra bibliotek通量读长成本
Quality file(Fasta)
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报告1：Solexa测序原理、实验流程课件

1、Prepare genomic DNA sample
利用物理方法将待测样品DNA随机打断成
100-200bp的片段，在打断后的DNA片段的两端加上接头，解开双链。

2、Attach DNA to surface
Solexa在测序时利用微注射系统将已经加过
接头的单链待测片段随机结合到Flow Cell的内表面，每一个Flow Cell又被分成８条Lane，每条 Lane的内表面上能通过共价键的形式随机固定单链接头序列和带接头的单链待测DNA片段。
通过变性，释放出互补的单链，固定到附近
的固相表面。

6、Complete amplification
通过不断的循环，就会在Flow cell 的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。

7、Determine first base
加入DNA聚合酶、被荧光标记的dNTP和接头引物，开始第一轮测序。

3、Bridge amplification
在Flow cell内加入未标记的dNTP和酶，起始固相桥扩增。

4、Fragments become double-stranded
所有的单链桥型待测片段通过酶的作用，被
扩增成双链桥片段。

5、Denature the double-satanded molecules
Solexa测序原理、实验流程以及现在常用的微生物群落功能基因检测的方法
第一部分
Solexa测序原理、实验流程
Solexa简介
Illmina 公司包含有HiSeq 和MiSeq 测序平台，基于Solexa 技术，其

基本原理是单分子簇边合成边测序(Sequencing by Synthesis，SBS)

3.测序反应原理与介绍

测序反应三要素
1、引物标准工作浓度是3.2p。客户自带引物通常是其他不同浓度的，因此需稀释成标准工作浓度 2、模板DNA 模板DNA分为菌提质粒和PCR产物 3、BigDye
引物稀释
1、稀释引物公式：加水量=（引物原体积X 原浓度∕3.2）-引物原体积。 2、用枪计量引物体积，并转入新离心管。 3、按上式计算出加水量，稀释引物。 4、若引物为合成1OD干粉时，则直接加 1000uL水稀释为5p。 5、引物5pM的不用稀释，直接吸到新离心管中用，若引物较少也可以稀释到3.2p。
2、菌液
（1）自带引物：≥15个反应，抽取4~8个，合格后方可继续测序（2）通用引物： a.≥30个且≤96个反应，抽取4~8个反应试测 b.同一客户≥96个反应，分在2个以上96孔板上，每板随机抽取4~8个反应试测，一整板的可以抽取8个试测（3）若样品系列较多(每个系列大于10个反应)，则每个系列都应抽取到
测序反应原理与介绍
主讲人：李锐 2012.4.12
目录
第一部分：测序反应原理第二部分：测序反应要素第三部分：测序反应流程
PCR的定义： PCR（polymerase chain reaction) ：聚合酶链式反应，又称体外 DNA扩增技术。
PCR反应原理
该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的 DNA互补链。