环境生物技术实验讲义

实验一细菌淀粉酶和过氧化氢酶定性测定

一、实验目的

①了解过氧化氢酶试验的反应原理和用途。

②了解淀粉酶试验的反应原理和用途。

③通过对淀粉酶和过氧化氢酶的定性测定，加深对酶和酶促反应的感性认识。

二、实验原理

酶是微生物机体内生物合成的一种生物催化剂，它是高分子蛋白质，具有催化生物化学反应加速进行，并具有传递电子、原子和化学基团的作用。微生物的酶按它所在细胞的部位分为胞外酶、胞内酶及表面酶。本实验对胞外酶中的两种即淀粉酶和过氧化氢酶(亦叫接触酶)进行定性测定。

细菌淀粉酶能将遇碘呈蓝色的淀粉水解为遇碘不显色的糊精，并进一步转化为糖，淀粉被酶催化分解后用碘检测不到其变色现象；过氧化氢酶能将过氧化氢快速分解为水和氧气，能用肉眼很容易的观测到产生的气泡。

三、实验仪器和试剂

①试管(15mm-150mm)5支、试管架1个、培养皿(90mm)3套、接种环。

②肉膏胨淀粉琼脂培养基(1L) : 蛋白胨10g、Nacl 5g、牛肉膏5g、可溶性淀粉2g、琼脂15g、蒸馏水定容到1000ml 121℃灭菌20min。

③4％淀粉溶液1滴瓶:4g可溶性淀粉加水至100ml

④革氏碘液1滴瓶:碘1g、KI 2g、蒸馏水300ml （将I与KI先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。

⑤9％过氧化氢1滴瓶：30％过氧化氢30ml 蒸馏水70ml

⑥枯草杆菌和大肠杆菌斜面各一支。

⑦活性污泥

四、实验方法

(一)生活污水活性污泥混合液中淀粉酶的测定

①取3支干净的试管，按1、2、3对照编号。放在试管架上备用。

②在1号、2号试管内分别加入5ml、10ml的活性污泥混合液，再在1号和2号试管中分别加10 ml和5 ml蒸馏水。在对照管内加15 ml 蒸馏水。

③在1号、2号、3号及对照管中分别加入4％的淀粉液4滴(淀粉液的用量，在做预备实验时根据样品中淀粉酶含量多少而定)，迅速摇匀并记下反应的初始时间。

④在上述3个管内分别加4滴碘液(碘液用量在预备实验时酌定)，迅速摇匀，这时各管均呈蓝色。

⑤观察结果。注意各管的变化，记下各管蓝色完全消失时的时间(即淀粉酶和淀粉反应完全的时间)，并对结果进行分析。

(二)细菌淀粉酶在固体培养基中的扩散实验

①将肉膏胨淀粉琼脂培养基加热融化，待冷至45℃左右倒入无菌培

养皿内(每皿约10 ml)，共倒3个，静置待冷凝即成平板。

②在无菌操作条件下，用接种环分别挑取枯草杆菌、大肠杆菌和活性污泥各一环分别在3个平板上点种5个点。倒置于37℃恒温箱内过夜培养。

③观察结果，取出碘液，分别在3个平板内菌落周围滴加20ul碘液，观察菌落周围颜色的变化。若在菌落周围有一个无色的透明圈，说明该细菌产生淀粉酶并扩散到基质中去。若菌落周围仍为蓝色，说明该细菌不产生淀粉酶。

(三)过氧化氢酶的定性测定

①将配备的斜面培养基接种枯草杆菌、大肠杆菌37℃恒温箱内过夜培养。

②用滴管吸取过氧化氢滴加入到菌落上，观察菌落是否有气泡。

五、实验报告

把所观察到的现象记录下来，进行分析。

六、思考题

①淀粉酶定性测定中对照应呈什么颜色?为什么?各菌落呈什么颜色?为什么?

②各菌落滴加过氧化氢后呈什么现象?说明什么问题?

实验二处理生活污水的活性污泥微生物总DNA的提取一、实验目的：

①掌握环境样品DNA提取技术。

②掌握琼脂糖电泳的检测原理和方法。

二、实验原理：活性污泥是一种以好氧性细菌为主体的微生物和水中的悬浮物质、胶体物质混杂在一起形成的肉眼可见的絮状颗粒，它是废水生物处理过程的主体。

环境样品的微生物总DNA的提取和纯化方法主要由两部分组成：1.温和裂解细胞及溶解DNA的技术，包括物理、化学或酶解作用裂解细胞，是DNA释放出来。2.在环境样品DNA得到充分释放后，通常采用几种化学和酶学方法中的任一种来去除杂蛋白、RNA及其他的大分子。

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应使不同大小的DNA分子分离，把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。溴化乙锭（EB）在紫外光照射下发射荧光，EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物。

三、实验仪器和试剂：

仪器：核酸电泳系统，凝胶成像分析系统，离心机，移液器，水浴锅，

涡旋振荡器，EP管。

试剂：

1、0.1%磷酸钠缓冲液（PH 8.0）100ml ：1M Na2HPO4 93.2ml、1M NaH2PO4 6.8 ml，加热配制。

2、溶菌酶。

3、20% SDS 100ml：20g SDS 加灭菌水定容至100ml，加热。

4、70%乙醇：70ml无水乙醇，加灭菌水30ml。

5、TE缓冲液（PH 8.0）：1M Tris-cl 500ul，0.2M EDTA 250ul，灭菌水49250ul

6、异丙醇，

7、8mol/LKAc溶液：392.56g KAC 加灭菌水500ml，121℃灭菌20min。

8、1kb DNA分子量标准。

9、1%琼脂糖：0.5g 琼脂糖加5ml 10×TBE，45ml水。

10、10×TBE：Tris-base 54g、Boric Acid 27.5g、Na2EDTA 4.65g 加蒸馏水定容至500ml，用HCL调PH 8.3

11、核酸上样缓冲液：10×ladder

四、实验方法：

1、取1g活性污泥，离心12000rpm 3min 去上清，灭菌水洗涤2

次，10000rpm 3min,去上清。加1ml 0.1mol/L PH8磷酸钠缓冲

液,漩涡震荡器震荡20min。

2、加溶菌酶5mg，使终浓度为2.5mg/ml，振荡5min,37℃水浴

30min。