正常和肿瘤组织细胞的培养

正常和肿瘤组织细胞培养

正常组织细胞培养：上皮细胞的体外培养；血管内皮细胞的体外培养；

肾小管上皮细胞的培

养；巨噬细胞的培养；

淋巴细胞的培养

肿瘤细胞培养

不同组织细胞和器官的结构和功能、生长特性不同，在体外培养中所需

的分离方法和生长条件也不同。

1、上皮细胞的体外培养：

许多器官上的上皮细胞具有特定的功能，如肾和肠道上皮细胞具有吸收功能，肝和胰上皮细胞的分泌功能，肺上皮细胞的气体交换功

能；

上皮组织还常发生肿瘤。

上皮细胞的基本特征：

1.上皮组织的形态结构：群体依赖性（population dependence)；接触

抑制（contact inhibition)

2.上皮细胞的极性：贴壁依赖性细胞-贴壁生长

生长基质

3 . 上皮细胞间的连接

体外培养的上皮组织细胞的生长生物学

1. 形态学结构：均质性、透明性很强，结构不明显

2. 体外培养上皮组织的生长与增殖特征

(1) 体外培养的特殊条件：防范微生物污染；生长基质的支持；

特殊的培养基（M199 RPMI1640 DMEM Fam F12 无血清培养

基）；去成纤维细胞

防范微生物污染

根据上皮组织分布的特性，位于体表或衬贴消化道、呼吸道内等处的上

皮组织，直接暴露或同外环境相接触，组织本身带有各种病原微生物或

受其污染的机会较多。要求在组织取材时就严格灭菌；分离、种植、培

养等诸多操作步骤上都要设法消除可能会出现的微生物污染。培养中所

使用的各种液体，包括细胞保存液、分离液以及培养基等需添加抗生

素，抗生素浓度比其它组织培养高。

生长基质的支持

皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长，即所谓的贴壁依赖性细胞。

在培养器皿表面包被生长基质，如胶原或其它细胞外基质成分等，模拟体内的基膜结构，不仅特别有利于上皮细胞的贴附和生长，也有利于培养细胞的分化．使细胞极性表现更为明显。

特殊的培养基

M199和RPMI1640培养基仅适用于上皮组织的短期培养和维持其生存，对上皮组织的长期培养和促增殖作用并不明显。

DMEM和HamFl2培养基用于上皮组织培养时有其特殊作用。可促进上皮细胞的贴附；维持上皮细胞在体外培养状态的分化。HamFl2培养基的特殊性特别适用原代上皮细胞的培养，培养基成分中添加微量元素的无机离子，更加利于细胞的生长和代谢。

在实际培养时，将DMEM与HamFl2按一定比例混合用于上皮组织培养。

培养液特殊添加剂

常用的促细胞生长因子及使用的终浓度

添加剂终浓度添加剂终浓度

BSA 10-5mol/ml EGF 5ng/ml

transferrin 5-10 g/ml FGF 5ng/ml

insulin 5 pg/ml NGF 5ng/ml

氢化可的松 10-5mol/ml

去除成纤维细胞

上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。取材分离细胞时会带入少量结缔组织成分，常常造成成纤维细胞与上皮细胞混和生长。由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附能力强的特点，很容易“疯长”为培养物中的优势细胞群，从而干扰或抑制上皮细胞的生长，成为上皮细胞的“细胞污染源”。

因此在上皮细胞的取材、分离、种植和传代的培养过程中，要特别注意上皮细胞的纯化，去除和抑制成纤维细胞的生长。

(2) 体外培养上皮细胞的形态学变化

体外培养上皮组织细胞的观察与检测

1. 一般形态学观察

光镜：形态、轮廓、生长情况等。细胞规则、明亮而饱满、细胞轮廓不清

电镜：桥粒、形态结构特征、细胞间关系

培养液pH变化：颜色变化？

培养物的污染情况：透明度变化？

2. 组织化学与免疫组织化学观察与检测

酶类：碱性磷酸酶；琥珀酸脱氢酶

特异性抗原标记物：角蛋白、上皮细胞膜抗原；VIII因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白

二、血管内皮细胞的体外培养

人脐静脉内皮细胞的培养

1.主要材料：组织来源：婴儿脐带

培养用液： M199+20%FCS；D-Hanks； 0.1%胶原酶溶液

2.培养方法：

分离细胞培养法

1 ). 将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。

（注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃）

2 ). 用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的。PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。

3 ). 用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml 的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。

4 ). 消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50 ml无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。

5 ).将收集液离心（2000转/分）3分钟，去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置CO2培养箱中培养，两至三天可见细胞长成单层。

5.讨论：

(1) 关于接种材料的制备：取材与消化；消化酶、浓度、时间

(2) 排除成纤维细胞：传代去除法：加肝素培养法(90u/ml)；刮

除法

(3) 关于培养液 (4) 关于传代培养

6. 内皮细胞的鉴定：

(1) 光镜检查 (2) 透射电镜检查：W-P小体

(3) VIII因子相关抗原的免疫组化检测

三、肾小管上皮细胞的培养

1. 主要材料：

a. 细胞来源：

b. 无血清培养液：

基础培养液： DMEM/HamF12(1:1)

添加物：胰岛素 5g/ml；转铁蛋白5 g/ml；硒 5 g/ml；氢化可的松36ng/ml；

T3 4 ng/ml； EGF 10 g/ml

c. 消化液： 0.2%胰蛋白酶

d. 细胞筛网： 80和100目

2.原代培养：

切取1cm3外层肾皮质、剪碎成1mm3；80目研磨冲洗、于100目上收集肾小管节段；0.2%胰蛋白酶消化、调整细胞数；接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶进行培养；每隔3~4天，更换培养液

3.传代培养：

4. 培养结果： 3d：长出细胞； 5~7d ：进入对数生长期； 7~9d：融合成单细胞层

5.鉴定：抗角蛋白抗体染色（+）

6.注意事项： a. 分离方法：b. 鉴定方法：

四、巨噬细胞的培养

巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。

巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用。

1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml（勿注入肠