高效毛细管电泳HPEC

3. 毛细管凝胶电泳 凝胶的网络结构对溶质具 有分子筛的作用，可分离质荷 比相同但分子大小不同的组分。 在分子生物学和蛋白质化 学上有着十分广泛的应用。
4. 毛细管等电聚焦
根据蛋白质的等电点不同 而进行分离。
E B B F A B D A C F C A B A A E D D D E AE D C C E B B AA BB AA BB CC DD CC DD EE EE FF FF
常用分离模式
1. 毛细管区带电泳（CZE）
2. 胶束动电毛细管色谱（MECC）
3. 毛细管凝胶电泳（CGE）
4. 毛细管等电聚焦（CIEF） 5. 毛细管等速电泳（CITP）
模式
CZE
缓冲液体系
自由缓冲液
分离机理
离子淌度 疏水性/离子性 相互作用 分子大小和 荷电数目 等电点
MECC 胶束－缓冲溶液 CGE CIEF 凝胶－缓冲溶液 两性电解质 前导电解质、尾 随电解质
毛细管电泳装置示意图
HPCE基本结构
电极：铂电极 进样方式：样品池置换进样品的电极槽 采用电动进样或压力进样方式导入 分离：各组分淌度不同，在毛细管中迁 移速度不同分离
HPCE与HPLC比较
共同点：液相分离技术 分离机理不同 两者可以互为补充
HPCE
分离柱 柱效 毛细管 更高
HPLC
色谱柱 高
3. 微量：样品用量少
4. 低消耗 5. 应用范围广
历史沿革（1）
1937年Tiselius首次创造了电泳仪 1948年成功从人血清中分离白蛋白和蛋 白,获诺贝尔化学奖 但分离效率受热扩散和对流的影响 1967年Hjerten最先提出高电场强度、直 径3mm的毛细管中作自由溶液区带电泳
历史沿革（2）
1981年Jceorgenson和Lukas提出用200um细 毛细管 1984年Terabe等将离子型表面活性剂胶束引 入毛细管电泳缓冲液体系中，胶束电动毛细管 色谱 1985年Hjerten提出毛细管等电聚焦 1987年Cohen和Karger提出毛细管凝胶电泳， 实现了蛋白质碎片的分离 1988年后，高效毛细管电泳仪问世
HPCE的仪器结构
电泳组成系统：电极槽、电极、高压电源 进样系统：样品池 分离系统：石英毛细管（内径25～75μm） 检测系统：检测窗、光学检测 数据处理系统：电泳谱图 毛细管恒温系统
检测器
毛细管恒温系统
毛 细 管
（+）
电极槽
数 据 处 理 系 统
高压电源
铂电极 铂电极
(－ )
缓冲液/样品
ห้องสมุดไป่ตู้
缓冲液
毛细管电泳基本理论
v = veo+ vep = (μeo+μep)E v ：离子移动速度
veo：电渗流速度 μeo：电渗流淌度
vep：电泳流速度 μep：电泳流淌度
E： 电场强度
电泳
电泳：组分在电场作用下的迁移产生的 分子半径小、电荷大的离子具有较大的电 泳淌度； 分子半径大、电荷小的离子具有较小的电 泳淌度。 电泳淌度的差异，构成了电泳分离的基础
黄芩中6种黄酮类成分的
胶束电动毛细管色谱分离图 1.汉黄芩甙；2. 黄芩素；3.黄芩甙；4. 千层子素； 5. 汉黄芩素；6.内标水杨酸；7.白杨素
胶束电动毛细管电泳分离测定北 沙参中5种香豆素类成分
电泳条件
未涂层融硅石英毛细管(5.12 cm ×75μm ×40 cm) ; 运行缓冲液为20 mmol/L 硼砂缓冲溶液 ( pH 916, 含16 mmol /LSDS, 15%乙腈) 温度22 ℃; 压力进样5 s ( 015Psi) ;分离 电压22 kV;检测波长214 nm 实验前,用011 mol· L - 1的氢氧化钠溶液 冲洗
青霉素发酵液的高效毛细管电泳图
1. 青霉素G钠 ；2. 6-氨基青霉烷酸； 3. 对羟基苯乙酸 ；4. 邻羟基苯乙酸 ；5. 苯乙酸
2. 中药成分分析 如：黄酮及其苷类分析
HPCE条件
毛细管40cm×50μm (Bio-Rad) 检测波长：UV275nm 进样：10psi × sec 操作压力：20KV(+)→(-) 柱温：20℃ 缓冲液：50mmol/L磷酸二氢钠-12.5mmol/L硼 砂(pH8.0)
高效毛细管电泳分析
High Performance Capillary Electrophoresis （HPCE）
HPCE概念
HPCE是经典电泳技术与现代微柱分离相 结合的一种快速、高效的液相分离技术。 以高电场为驱动力 在细内径毛细管内 荷电粒子按其淌度或分配系数的不同分离
特点：
1. 高效：分离效能高 2. 高速：分析速度快
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(+)
毛细电泳中不同组分的迁移示意图
电渗流的控制
最基本方法：改变毛细管内壁的表面电荷 改变缓冲溶液粘度 改变电渗流需要通过毛细管电泳整个操作条 件的优化来实现 操作条件：电场强度、缓冲液pH值、离子 强度或缓冲液浓度、温度、有机改性剂、表 面活性剂、中性亲水性聚合物、共价涂覆
(+)
电渗的产生
电渗流的特点之一
具有平面流型，其电渗驱动力沿毛细管 均匀分布，电渗速度的径向分布几乎是 均匀的，不会直接引起区带扩散，分离 效率高
电渗流的特点之二
使所有的样品组分不管电荷大小，以同 样的方向移动。一般情况下，电渗流方 向从阳极至阴极，且电渗流速度大于电 泳速度，所以阴离子也在阴极流出 合理地利用电渗流可以使阳离子、中性 分子、阴离子实现同时分离分析
分离选择性 分析速度 样品用量 流动相 溶剂消耗 高压输液系统 成本 方法 灵敏度 线性范围
更高 更快 低100倍 溶液缓冲 几乎不消耗 无 低 成熟 较高 稍窄
高 快 微量 甲醇、乙腈等 消耗量大 有 高 待完善 高 宽
HPCE应用
不仅用于生物大分子的分离分析 也用于氨基酸、手性药物、维生素 农药、无机离子、有机酸、染料、表面活 性剂 肽和蛋白质、糖类、低聚核苷和DNA片断 甚至于整个细胞和病毒粒子的分离分析
生脉散CE指纹图谱(20个主要共有峰， 峰16-五味子醇甲，峰19-五味子乙素)
11批生脉散CE指纹图谱
11批生脉散CE指纹图谱中确认了20个主 要的共有指纹峰，其中4个峰来自红参， 6个峰来自麦冬，13个峰来自五味子，3 个峰为红参和麦冬共有，1个峰为麦冬和 五味子共有，另外1个为新成分。
3. 手性拆分 4. 体内分析
CITP
移动界面
1. 毛细管区带电泳
最基本、最广泛的分离模式。 适用于所有具有不同淌度的荷 电粒子的分离，但不能中性物质 及质荷比相同的组分。
2. 胶束动电毛细管色谱
用离子胶束溶液代替简单 的缓冲溶液，使中性组分可按 其疏水性的不同及在两相间的 分配系数的不同而分离。采用 手性分配相，可用于手性化合 物的分离。
北沙参供试品溶液的毛细管电泳图
1. 补骨脂素; 2. 花椒毒素; 3. 异茴芹内酯; 4. 佛手柑内酯; 5. 东莨菪内酯。
复方生脉散的毛细管电泳指纹 图谱研究
利用毛细管电泳(CE)方法建立中药复方 生脉散(红参、麦冬、五味子)的指纹图谱。
采用序贯式均匀设计的方法优化CE分离 条件，确定生脉散指纹图谱 电泳条件为:以pH为9.5、44 mmol/L硼砂、 34 mmol/L SDS为缓冲溶液体系， 运行电压25 kV，温度25℃， 压力进样50 mbar×100 s， 检测波长200 nm。
低
pH梯度
高
毛细管电泳的操作
将运行缓冲液充满毛细管柱 移去进样端缓冲液池，用样品池代替 用电动或压力进样方式进样 将进样端缓冲液放回 毛细管两端加操作电压进行电泳分离 分离样品迁移至检测窗检测，数据记录 和处理
应用：
1. 监测药物生产过程 如：监测青霉素发酵液中有关物 质的量
HPCE条件
毛细管87cm(有效长度77cm)×75μm (河北永年) 检测波长：214nm 进样：2.5psi × sec 操作压力：30KV(+)→(-) 柱温：25℃ 缓冲液：20mmol/L磷酸盐(pH7.5)
电渗或电渗流
电渗或电渗流：管内溶液在外力电场作 用下整体朝一个方向运动的现象
石英表面的负电荷(SiO-)
(－)
向阴极的电渗流 －－ + + － － ++ ++ － + + ++ － + － － － + + － + － + + － ++ + － + + + + －－ + － ++ 水合阳离子 － －