细胞因子对小鼠造血干细胞基因转移效率影响的实验研究

细胞因子对小鼠造血干细胞基因转移
效率影响的实验研究
我们观察了造血干细胞因子(SCF)、白细胞介素(IL)-3、IL-6不同
组合方式对小鼠造血干细胞基因转移效率的影响，以期发现能有效地提高基因转移效率的细胞因子或其组合。

材料和方法
1包装细胞系已转染逆转录病毒载体GCGPXSN的包装细胞株PA317-PCGPXSN 由上海东方肝胆外科医院惠赠。

GCGPXSN中含有绿色荧光蛋白(GFP)和新霉素磷酸转移酶(Neo R)基因，系在逆转录病毒载体GCXPXSN的第一个多克隆位点插入GFP cDNA构建而成。

2病毒上清制备及滴度测定将PA317-PCGPXSN细胞常规方法培养至70%～80%汇合后，换用新鲜培养液培养24小时，收集培养液上清。

病毒滴度测定及计算按文献［1］进行。

3基因转移处死BALB/c小鼠(购自兰州生物制品研究所)，制备2×106／ml 的骨髓细胞悬液。

按附表分别加入rhIL-3,rhIL-6(均为200U/ml，由日本
Kirin公司惠赠)及rmSCF(100ng/ml，由军事医学科学院沈倍奋教授惠赠)，培养24小时后离心弃上清，加入总滴度为7.6×105cfu/ml的病毒上清及8μg/ml polybrene(美国Sigma公司产品)，加细胞因子如上述浓度，阴性对照未转染。

继续培养24小时，收集细胞按下述不同方法检测基因转移效率。

4 基因转移效率的测定
4.1流式细胞术测定基因转移效率：将上述完成基因转移工作的骨髓细胞制备成2×106／ml的细胞悬液，应用流式细胞仪(FACS caliber,美国BD公司)分别获取10000个细胞。

4.2CFU-GM检测：按琼脂半固体培养法于96孔细胞培养板中培养。

其中
G418(+)8孔，G418(-)8孔。

7天后计数CFU-GM集落数，计算转移效率。

附表基因转移实验分组
4.3聚合酶链反应(PCR)检测：PCR扩增所需NeoR基因引物为［2］：
P 1:5′CAAGATGGATTGCAC-GCAGG3′；P
2
：5′CCCGCTCAGAAGAACTCGTC3′(由北京
天象人生物工程公司合成)，其间扩增片段长度为790bp。

从半固体培养基中挑取阴性对照组，SCF/IL-3/IL-6联合应用组之G418(+)组及G418(-)组克隆各12个用于PCR扩增。

取10μl扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并计算转移效率。

4.4Southern blot印迹杂交：应用含有Neo R基因的质粒PLXSN(美国
Miller教授惠赠)经PCR扩增后用地高辛标记试剂盒(美国BM公司)制备探针。

PCR扩增引物同上。

探针制备方法参照试剂盒说明书进行。

Southern blot印迹杂交方法参照文献［3］进行。

5统计学处理FACS测定值的统计学处理用直方表示。

CFU-GM测定值的统计学处理用χ2检验进行。

结果
1病毒滴度测定结果为1.9×105cfu/ml。

2流式细胞术测定结果阳性对照组基因转移率为0.06%，应用细胞因子后基因转移效率有明显提高(0.07%～0.20%)，而以SCF/IL-3，SCF/IL-3/IL-6联合应用尤为显著，由0.06%提高至0.20%。

3CFU-GM测定结果SCF，IL-3，IL-6单独使用及SCF/IL-6，IL-3/IL-6联合应用可使基因转移效率提高到20.45%～28.69%，与阳性对照组相比较差异显著(P<0.01)。

SCF/IL-3及SCF/IL-3/IL-6联合应用可使基因转移效率进一步提高至44.60%～46.40%，提高转移效率4.2倍，与SCF，IL-3，IL-6单独使用及SCF/IL-6，IL-3/IL-6联合应用组相比较差异非常显著(P<0.005)。

4PCR测定结果12个G418(+)克隆全部扩增到特异性片段，而12个G418(-)克隆中有7个克隆扩增到特异性片段，转移效率为58.33%，高于CFU-GM测定结果。

5Southern blot印迹杂交结果12个G418(-)克隆经PCR扩增，用上述方法制备的探针进行杂交。

7个克隆的PCR产物得到特异性的杂交带，进一步证明质粒GCGPXSN已转移入小鼠造血干细胞。

讨论
SCF，IL-3，IL-6可不同程度地作用于造血干细胞和多向造血祖细胞，促进其增殖分化，亦可提高它们对某些造血生长因子的敏感性［4］。

故我们尝试将其单独或联合使用以期提高基因转移效率。

从测定结果可以看到，SCF/IL-3联合使用能十分有效地提高逆转录病毒载
体介导的基因转移效率，SCF/IL-3/IL-6联合应用似不再能有更明显的提高。

考虑此系SCF与IL-3协同刺激造血干细胞由G
0或G
1
期进入S期，提高了增殖
期细胞比例，而IL-6与SCF，IL-3无明显协同作用［5］。

由于CFU-GM测定方法受Neo R基因表达量及G418浓度影响，而PCR测定方法不受Neo R基因表达量的影响，故PCR方法能较准确地反映基因转移效率。

应用FACS可测知基因转移成功的细胞个数，并借助于分选系统进行收集，用于临床基因治疗或探讨自体骨髓移植后造血重建机制和复发原因的研究。

参考文献
1Miller AD, Falaw M, Verma JM. Generation of helper free amphotropic retrovirus that transduce a dominant-acting, methotrexate-resist dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol, 1985, 122:175-181.
2Morgan RA, Cornetta K, Anderson WF. Application of the polymerase chain reaction in retroviral-mediated gene transfer and the analysis of gene-marked human TIL cells. Human Gene Ther, 1990, 1:135-143.
3J 萨姆布鲁克，EF 弗里奇，T 曼尼阿蒂斯主编. 分子克隆实验手册. 第2版. 金冬雁，等译. 北京：科学出版社，1992. 474-481.
4侯健，王东星，胥军民主编. 人类细胞因子手册. 上海：同济大学出版社，1996. 79-96，124-141，243-248.
5Miller DG, Adam MA, Miller AD. Gene transfer by retrovirus vectors occurs only cells that are actively replicating at the time of transfection. Mol Cell Biol, 1990, 110:239-246.。