实验一 土壤中微生物的分离纯化(1)
土壤细菌的分离及纯化(1)
土壤细菌的分离及纯化(1)土壤中存在着丰富的微生物群落，其中细菌是占主导地位的一类微生物。
分离和纯化这些细菌有助于深入了解它们的特性并有利于相关应用的开发。
下文将从分离和纯化的流程、常用方法以及注意事项等方面进行详细阐述。
一、分离和纯化细菌的流程1. 采集土样首先，需要采集土样，并将其认真分层剖析，取相对均匀的土样。
避免受到环境中其他微生物的干扰，有时要在合适的温度、溶液中将其处理，以杀死其他未被分离出的细菌，确保最终分离到的细菌属于所期望的种类。
2. 筛选方法可以通过筛选的方式来分离目标细菌。
在将土样处理后，可以将土壤中的颗粒筛选出来，将其悬浮于适宜的培养基中。
通过培养基选择，可以筛选出自然界中对常规培养基营养要求不高的菌株。
3. 纯化法基于筛选法筛选出的细菌群，要进一步分离单菌株。
这时候，可以通过分泌落细菌的方式进行分离。
分泌落法是在无菌条件下，用匀染映到平板上，供菌落生长孵育，培养出纯净菌株。
二、常用分离和纯化方法1. 发酵罐法发酵罐法是在无菌环境下，将土壤样本与特定的培养基混合，形成发酵液，供细菌发酵并产生代谢产物。
根据代谢产物对目标微生物的要求特点，可以从代谢产物中充分筛选出目标菌株并进行单克隆的分离培养。
2. 过滤法将土样过滤后，混合在无固定菌相的培养基中，通过筛选培养环境中的单菌孵育，纯化出其中的某一菌株。
3. 土盘法所收集的土样经过处理后，均匀地坚着到培养皿的表面。
将培养皿置于恰当的条件下，等待细菌的生长，进行单克隆的分离。
三、注意事项1. 待分离土样尽量温和，避免对土壤环境造成较大影响，减少细菌数量的变化。
2. 培养到疑似有目标菌株生长为止，这就需要经验较丰富的实验人员进行分离纯化操作。
3. 需要从其他细菌中筛选出目标菌株，可以加入抗生素等各种筛选方法。
总之，提高细菌的分离和纯化技术，是深入探索土壤生物多样性、探索新型约束细菌等领域的很重要的手段。
土壤微生物的分离纯化 实验：微生物的分离、培养和菌种保藏
思考题
❖ 什么叫无菌操作？分离放线菌和真菌为什么 需要分别加重铬酸钾和链霉素？
❖ 平板培养时为什么要把培养皿倒置？ ❖ 如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？
Байду номын сангаас
实验七
结束
下周实验
理化因素对微生物的影响
（实验三十二、实验三十四、实验三十八）
每毫升样品中微生物细胞数=
每皿菌落平均数 × 稀释倍数 × 1/取样体积数
混匀 凝固
28～30℃ 培养
图7－4 混合法流程图
实验程序 Ⅳ——平板涂抹法（涂布法）
❖ 每人取无菌培养皿1付（每个同学做一只）。在皿底贴上标签，注明 分离菌名、稀释度、组别、班级。
❖ 取已熔化的高氏培养基，分别倒15－20ml入培养皿中，铺平，制成 平板。
养皿里。 ❖ 3.取已熔化的在水浴锅中保温500C左右的马铃薯培养基（PDA培养基），
分别倒约15－20ml入上述培养皿中，轻轻转动培养皿，使菌液、培养基 充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于28～300C恒温培养 5～6d。观察真菌菌落形态以及计数 菌落。并计算出每g土壤中真菌的数 量。即用某一培养皿内真菌的菌落数乘以该培养皿接种液的稀释倍数即 得。 （见图7－4）
挑取单个菌落接种于斜面培养基 上，如果不纯，再移植纯化，最 后得到纯培养。
实验程序Ⅵ——四大类微生物菌落形态的比较和
识别
❖ 区分和识别各大类微生物通常包括菌落形态（群体形态） 和细胞形态（个体形态）两方面的观察。
❖ 菌落形态： 菌落表面湿润：细菌——薄而小，酵母菌——厚而大。 菌落表面干燥：放线菌——密而小，霉菌——松而大。
淀粉琼脂培养基 马铃薯蔗糖培养基
❖ 无菌水：带有玻璃珠装有99mL无菌水三角瓶
微生物的分离纯化实验报告
微生物的分离纯化实验报告微生物的分离纯化实验报告引言：微生物是一类极小的生物体，包括细菌、真菌、病毒等。
它们广泛存在于自然界中的土壤、水体、空气中，对生态系统的平衡和物质循环起着重要作用。
微生物的分离纯化是微生物学研究的基础，通过分离纯化可以获得单一的微生物菌株，为后续的鉴定、培养和利用提供基础数据。
本实验旨在通过分离纯化微生物的方法，获得纯净的微生物菌株。
材料与方法：1. 实验材料：含有微生物的样品（如土壤、水样等）、琼脂平板培养基、无菌培养皿、无菌移液管、无菌匙、无菌培养管等。
2. 实验步骤：a. 取适量样品，加入适量的无菌生理盐水中，充分搅拌均匀。
b. 取一定体积的悬浮液，分别在琼脂平板上均匀涂布，避免重复涂布。
c. 将涂布好的琼脂平板培养基放置于恒温培养箱中，以适当温度孵育。
d. 孵育一段时间后，观察平板上的菌落情况，选择形态独特的单个菌落。
e. 用无菌匙将选中的菌落划取至无菌培养管中，加入适量的无菌生理盐水。
f. 将培养管中的菌液进行摇匀，称取一定体积的菌液，分别在琼脂平板上均匀涂布。
g. 重复以上步骤，直至获得纯净的微生物菌株。
结果与讨论：通过实验，我们成功地从样品中分离纯化了多个微生物菌株。
在观察菌落形态时，我们发现不同微生物菌株的菌落形态各异，有的呈圆形，有的呈不规则形状，有的呈乳白色，有的呈黄色等。
这些观察结果表明不同的微生物菌株具有不同的生长特性和代谢方式。
在分离纯化的过程中，我们注意到有些菌落会在培养基上形成菌落周围的透明区域，这是由于菌落分泌的溶解酶作用于琼脂平板中的胶原蛋白，导致胶原蛋白溶解而形成的。
这种现象被称为溶解圈，是一种常见的微生物特征，有助于鉴定微生物的溶解能力。
在实验过程中，我们还遇到了一些困难和挑战。
首先，样品中可能存在多种微生物，通过分离纯化的过程中需要进行多次的涂布和筛选，才能获得纯净的菌株。
其次，在涂布过程中需要注意避免交叉污染，以免影响结果的准确性。
土壤微生物的分离和纯化实验
实验八土壤微生物的分离和纯化一、目的1．了解从土壤中分离与纯化微生物的基本原理及方法。
2．掌握几种常用的分离的基本操作技术。
二、原理在自然界中，土壤是微生物生活中的最适宜的环境，土壤中存在大量的微生物，但土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，因此，为了研究某一微生物的特性，或者要大量地培养和利用某种微生物，必须把它们从这些混杂的微生物群中分离出来。
从而获得某一菌株的纯培养。
这种获得纯培养的方法称之为微生物的分离和纯化三、器材1．牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏l号培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基。
2．盛有100毫升无菌水的三角瓶，9毫升无菌水的试管，无菌吸管，无菌玻璃涂抹棒，10％的酚液，25％的乳酸，土样，接种环，标签。
四、方法(一)涂抹平板分离法1．制备土壤稀释液称取土样10克，放入装有玻璃珠和100毫升无菌水的三角瓶中，振摇15—20分钟，使土与水充分混合，将菌分散，静止片刻，用吸管从中吸取1毫升土壤悬液注人盛有9毫升无菌水试管中，吹吸三次，并振摇使之充分混匀，然后再吸取1毫升注入另一支盛有9毫升无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、l0-3、10-4、l0-5……的各种稀释度的土壤悬液。
2．倒平板将牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，马铃薯蔗糖培养基溶化。
待冷至50—60℃时，在高氏l号培养基中加入10％酚2滴，在马铃薯蔗糖培养基中加入25％乳酸2滴，然后分别倒平板，每支培养基倒一皿(用右手持盛培养基的试管，左手拨出棉花塞，试管口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿在火焰附近打开少许，迅速注入培养基，加盖后轻轻摇动培养皿使培养基均匀分布，平放在桌面上，待凝后即成平板。
(见图18)。
3．涂抹将上述每种培养基平板标上10-3、10-4、10-5稀释度，然后用无菌吸管分别从10-5、10-4、10-3稀释度的试管中吸取土壤悬液，每一平板注入0.2毫升，再用灭菌玻璃涂抹刮棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，静止5分钟。
土壤中微生物的分离纯化(电子版实验报告)
微生物实验报告土壤中微生物的分离与纯化指导教师：李海花周四晚第四组实验成员: 杜玉琪 180112010009董天涵 180112010008蒋怡菲 180112010018逄颖 180112010035【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离和纯化，通过观察微生物的菌落形态特征判断菌的类型并通过平板划线进行分离纯化【关键词】土壤、微生物、菌落观察、分离纯化1.实验目的（1）通过对几种培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。
（2）掌握倒平板的方法、接种和无菌操作技术。
（3）初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。
（4）学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能。
2.实验原理（1）培养基的配制与灭菌培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。
一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。
不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母菌的培养基的pH一般是偏酸的，而细菌和放线菌培养基的pH一般为中性或微碱性。
所以配制培养基时还要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。
已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。
（2）微生物的培养及鉴定接种：将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。
接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。
接种的关键是要严格的进行无菌操作。
鉴定：常见与常用的微生物中,根据它们的主要形态可分为细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。
细菌菌落光滑，易于基质脱离；放线菌菌落质地致密，菌落较小，广泛延伸；酵母菌菌落较细菌菌落大而厚；霉菌形成的菌落较稀松，多成绒毛状，絮状。
（3）平板分离与活菌计数倒平板：按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期等。
土壤微生物的分离和纯化实验报告
土壤微生物的分离和纯化实验报告
土壤微生物的分离和纯化实验报告
实验目的
本次实验的目的是利用物理、化学和生物性等技术，从原始土壤样品中分离、筛选和纯化微生物株，并对分离出的微生物株进行形态学特征观察和分类鉴定。
实验材料
1. 原始土壤样品
2. 饱和淡盐水
3. 10% (v/v) 的平衡磷酸盐溶液
4. 0.85% (w/v) 的千顷盐溶液
5. 2% (w/v) 的体糖酸钠溶液
6. 氯仿
7. 板藻素
8. 无菌玻璃管
实验步骤
1. 将原始土壤样哮放入摇瓶内，加入淡盐水攪拌均匀，进行粗筛提取。
2. 将1ml混合液放入无菌玻璃管，8次补充磷酸盐溶液悬浮液进行细筛提取。
3. 将细筛提取的悬浮液转移到新的无菌容器中，加入盐溶液攪拌均匀。
4. 加入盐溶液之后，用氯仿消毒，然后加入体糖酸钠溶液留取微生物株悬浮液。
5. 使用板藻素进行单菌株筛选，筛选出单菌株。
6. 将筛选出的单菌株进行形态学特征观察和分类鉴定。
结果
本次实验中，经过物理、化学和生物性等技术操作，成功分离出一株微生物株，并对其进行形态学特征观察和分类鉴定，得出结果：该株微生物属于假单胞菌科，耐盐性，呈菌封形态。
结论
本次实验成功分离纯化出一株微生物株，该株微生物属于假单胞菌科，耐盐性，呈菌封形态。
土壤中微生物的分离与纯化实验报告
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以下是一篇关于土壤中微生物分离与纯化实验报告的示例文章，按照清晰的标题和不同级别的小节编写：实验报告：土壤中微生物的分离与纯化。
土壤中放线菌的分离和纯化实验(精选5篇)精选全文完整版
可编辑修改精选全文完整版土壤中放线菌的分离和纯化实验（精选5篇）第一篇：土壤中放线菌的分离和纯化实验土壤中放线菌的分离和纯化实验一、实验目的1、制作MS培养基的方法，掌握母液的保存方法。
2、掌握培养基的灭菌方法。
掌握外植体的消毒和超净工作台的使用。
4、掌握放线菌的分离纯化及染色的基本流程；5、掌握高氏一号培养基的配制方法；6、复习分离纯化放线菌的基本操作技术、培养方学会使用高压蒸汽灭菌锅。
7、培养微生物实验的设计思路和动手能力。
二、实验材料高压蒸汽锅、培养瓶、石斛的愈伤组织、超净工作台，酒精灯、酒精棉球、镊子、电子天平、称量纸、烧杯、量筒、显微镜、三角锥形瓶、无菌培养皿、接种环、酒精灯、分析天平；接种环、载玻片、盖玻片、玻璃珠、移液枪、剪刀三、实验原理植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）第 1 页或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科。
四、实验步骤1、配制MS培养基8L，称取马铃薯1600g、香蕉400g、蔗糖240g、活性炭8半勺、琼脂80g、配制母液。
2、配制培养液时应注意：①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；为防止母液被微生物污染，有机母液放在冰箱里4℃保存；②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。
溶化琼脂用粗天平分别称取琼脂9 g、蔗糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。
实验二、土壤中微生物的分离术 (1)
恒温培养:平板倒置于37℃恒 温箱中,培养1-2天后观察细 菌菌落形态。 转接纯化:挑取单个菌落,接种 到新鲜平板上,培养观察,直至
纯化。
平板制作的操作注意：
融化培养基时不要溢出烧瓶或糊底 无菌操作下，打开培养皿的操作 一根１mL移液管多次移液先移低浓度悬浊液，再移高浓度悬浊液。 移液管可以用稀释悬浊液的那根在无菌操作下接着做，也可另取一根无 菌的。 为什么培养皿要倒置培养？
移液管移液后多余的液体处理
试管中悬浊液须持移液管吹洗三次搅匀
三、微生物分离纯10-4、10-5、10-6三管土壤稀释液于已写 好稀释度的对应平板中央位置，用无菌涂布棒在培养基表面轻轻地涂
布均匀，涂布后室温下静置5-10min。
三、微生物分离纯化的操作方法
实验报告：34页1（1）、1（2）、 2（3）
粒。
3、酒精灯、恒温箱 (培养箱)、超净工作台 等。
三、微生物分离纯化的操作方法
1.倒平板
（1）每组准备9套无菌培养皿，在皿底注明稀释液浓度（10-4、10-5、10-6， 每个浓度标注三个培养皿)、班级、组别。 （2）将实验一锥形瓶中的牛肉膏蛋白胨培养基加热融化，放在55-60℃ 恒
温水浴锅中备用。
实验二、土壤中微生物的分离
一、实验目的
1.掌握从土壤中分离培养微生物的方法，从而获得
若干种微生物纯培养技能。
2.掌握倒平板的方法和稀释涂布平板法的基本操作 技能。
二、主要实验器材及设备
1、无菌培养皿10套 、无菌吸
管1毫升、盛有90毫升无菌水
的锥形瓶、盛有9毫升无菌水
的试管6支，涂布棒。
2、培养基(已灭菌的)、土壤颗
（3）将锥形瓶中的培养基倒平板，倾入上述已标记的9套培养皿中。
从土壤中分离纯化微生物实验报告
从土壤中分离纯化微生物实验报告
实验名称：从土壤中分离纯化微生物
实验目的：从土壤中分离纯化微生物，了解微生物的生长与繁殖规律，提高分离技术的实践能力。
实验步骤：
1. 采集土壤样品，从不同深度、不同地点取样，放入消毒过的容器中，避免污染。
2. 准备好细菌培养基，如Luria-Bertani（LB）培养基、营养琼脂培养基等。
3. 取少量土样，加入LB培养基中，振荡混合，放入42℃的恒温培养箱中培养。
4. 24小时后，观察培养基上是否有生长菌落，若有，则取一部分菌落接种到新的LB培养基上再次培养。
5. 重复以上步骤，直至获得单个菌种菌落。
用无菌线圈挑取单一菌落，接种到新的培养基上，进行进一步鉴定。
实验结果：从土壤样品中获得多种不同形态和颜色的微生物。
通过分离和纯化，最终得到单一微生物菌落。
实验结论：从土壤样品中分离纯化微生物能够获得纯净的菌落，为进一步鉴定和研究微生物提供了基础。
同时，这也证明了分离技术在微生物研究中的重要性和必要性。
土壤中微生物的分离
微生物学实验报告土壤微生物的分离、培养及鉴定学生学号：学生姓名：专业班级：指导教师：土壤微生物的分离、培养及鉴定摘要：本实验是微生物学综合性实验项目包含了微生物学实验使用的微生物分离和纯化、微生物的选择培养基、培养基的制备、高压蒸汽灭菌、微生物类群的主要培养特征和形态特征、制片染色技术等。
[1]土壤是微生物的良好生境，土壤中有多种类群的微生物，它们对自然界物质的转化和循环起着极为重要的作用，对农业生产和环境保护有着不可忽视的影响。
根际微生物与植物的关系特别密切，不同的土壤和植物对根际微生物产生显著影响，而不同的根际微生物由于其生理活性和代谢产物的不同，也将对土壤肥力和植物营养产生积极或消极的作用。
土壤微生物不仅对土壤的肥力和土壤营养元素的转化起着重要作用，而且对于进入土壤中的农药及其他有机污染物的自净、有毒金属及其化合物在土壤环境中的迁移转化等都起着极为重要的作用。
关键词：土壤微生物，分离鉴定，生理生化，1前言土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。
一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm 的土层中菌数最多，随土层加深，菌数减少。
土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。
不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。
一般在较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多。
本实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌。
为了分离和确保获得某种微生物的单菌落，首先要考虑制备不同稀释度的菌悬液。
各类菌的稀释度因菌源、采集样品的季节、气温条件而异。
其次，应考虑各类微生物的不同特性，避免样品种各类微生物相互干扰。
细菌或放线菌在中性或微碱性环境较多，但细菌比放线菌生长快，分离放线菌时，一般在制备土壤稀释液时添加10％酚或在分离培养基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌。
培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质，主要用于微生物的分离、培养、鉴定、菌种保藏等方面。
实验一土壤中微生物的分离纯化
目录
• 引言 • 土壤样品采集与处理 • 微生物分离纯化方法 • 微生物培养条件与培养基选择 • 微生物鉴定与结果分析 • 实验注意事项与误差分析
01
引言
实验目的
分离土壤中的微生物
鉴定微生物
通过特定的培养条件，将土壤中的不 同种类微生物分离开来。
对分离纯化的微生物进行形态学、生 理生化特性等方面的鉴定。
废弃物处理
将实验废弃物分类收集，妥善处理，避免对 环境造成污染。
常见误差来源及减小误差方法
样品采集误差
试剂误差
确保采样工具干净，避免交叉污染；采样 点要具有代表性，避免偶然性误差。
使用优质试剂，确保试剂纯度和浓度准确 ；注意试剂保存条件和使用期限。
操作误差
设备误差
提高操作技能，减少操作失误；保持实验 环境稳定，避免外部因素干扰。
促进目标微生物的分离和纯化。
03
鉴别培养基
在基础培养基中加入某种试剂或化学物质，依据微生物代谢产生的某种
物质与特定试剂反应，产生明显的颜色变化或沉淀，从而鉴别不同种类
的微生物。
培养条件设置（温度、pH等）
温度
不同微生物对温度的需求不同，一般分为低温、中温和高温 微生物。在实验中，需根据目标微生物的生长温度要求，设 置相应的培养温度。
采样工具及容器准备
采样工具
使用无菌的铲子、勺子或土壤钻 等工具进行采样，避免交叉污染 。
容器准备
选择无菌的塑料袋、玻璃瓶或塑 料瓶等容器，确保容器干净、干 燥、密封性好。
采样方法及注意事项
01
02
03
04
去除表面杂质
去除土壤表面的植物残渣、石 块等杂质。
从土壤中分离纯化微生物
培养 实验步骤——从土壤中分离微生物
若成片菌苔大小不到培养皿的一半,其余一半分布均匀,将此一半计数*2;
用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离,纯化;
将牛肉蛋白胨培养基平板倒置于37 C温箱 将牛肉蛋白胨培养基平板倒置于370C温箱中培养24h；
实验步骤——周围环境中微生物的观察
0
中培养24h；统计所长出的菌落数； 然后同样方法，配置成稀释度为10-4，10-5，10-6的土壤溶液；
用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离,纯化;
实验仪器,材料和用具
实验材料:
菌源:土样10g;
培养基:
牛肉膏蛋白胨培养基;
实验仪器:
取液器(5000 ul, 1000ul, 200ul 个一支); 培养箱,摇床
实验仪器,材料和用具
实验试剂:
1N NaOH, 1N HCl, 0.9% 无菌生理盐水;
1N NaOH, 1N HCl, 有较大片菌苔生长时ห้องสมุดไป่ตู้弃用,以无片菌苔生长的平皿计数;
挑菌（不做） 然后同样方法，配置成稀释度为10-4，10-5，10-6的土壤溶液；
选择平均菌落数在30~300间的平板: 选择平均菌落数在30~300间的平板:
取液器(5000 ul, 1000ul, 200ul 个一支);
只有一个符合此范围时,以该平均菌落数乘稀 释倍数即为该样品中微生物总数;
有两个在30~300间时,按两者菌落总数比值决 定:比值小于2,取平均;比值大于2,取较少的菌落 总数;
实验步骤——从土壤中分离微生物
菌落计数
所有菌落数均大于300,取稀释度最高的平 均菌落数乘稀释倍数;
微生物的分离与纯化- 从土壤中分离纯化微生物
1)超净工作台、恒温培养箱、酒精灯 2）1000ul及100ul移液枪、1000ul及100ul枪头、无菌
1.5ml的离心管、离心管架 3）无菌平皿、涂布棒、接种环 实验试剂:无菌水;
实验内容
1、采土样:
选择肥沃土壤,去表层土,挖5－20cm深度的土壤数10g, 装入已灭菌的牛皮纸袋,封好袋口,带回实验室。
所有菌落数均不在30~300间 以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数
6、挑菌划线分离
挑取单个菌落（细菌菌落），分别在平板上做分区和 连续划线。
370C培养48h检查菌落是否单纯。
划线方法：详见实验指导书P72、P237
无菌操作（ 近火焰处操作）： 接种环 Nhomakorabea烧灭菌、冷却
微生物的分离与纯化技术的应用：分离具有特殊功能的微生物、优良菌 种及纯化被污染的菌种等。
土壤是微生物的大本营，混杂着大量的微生物，从中分离可得到只含有 这一种微生物的纯培养。
稀释分离法有倾注法和涂布法两种；菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬 液常用划线法进行纯种分离。
要获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适 培养基及培养条件。
微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间详见实验指导书P67 表格。细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，在30-37℃ 温度下培养1-2天。
平板菌落计数——活菌计数
0.1ml
0.1ml
0.1ml
0.1ml
00..11ml
0.1ml
0.1ml
0.1ml
0.9ml
0.9
分离纯化 基本流程
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由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加 入到培养皿后，应尽快倒入融化并于已冷却至 45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不 易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。 待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养 箱中培养。 5）计数 培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度 三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行 计算， 每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三 次重复的平均菌落数×稀释倍数×5
实验一 土壤中微生物的分离及 纯化（设计性实验）
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一、目的要求
掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物的
基本操作技术。
学习平板菌落计数的基本原理和方法 。
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二、基本原理
在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的 微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获 得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分 离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获 得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。
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五、实验报告
1．结果 在你所实验的三种培养基平板上长出的菌落 分属于哪个类群？简述它们的菌落形态特征 。
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六、思考题
1）在平板划线法（a）中，为什么每次都需将 接种环上的剩余物烧掉？ 2）为什么要将培养皿倒置培养？ 3)为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才 能倒平板? 4)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关 键?为什么? 5)当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而 是集中在一起时，你认为问题出在哪里? 6)用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的 菌落有何不同?为什么要培养较长时间(48h) 后观察结果?
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2．平板划线分离法 （1）按稀释涂布平板法倒平板，并用记号 笔标明培养基名称。 （2）划线 在近火焰处，左手拿皿底，右 手拿接种环，挑取上述10-1的土壤悬液一 环在平板上划线（图Ⅶ-5）。划线的方法很 多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过 划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个 菌落。
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也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的 食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培 养基，摇匀后制成平板，如图Ⅶ-1所示。最好 是将平板放室温2—3天，或 37℃培养24小 时，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。
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（2）制备 土壤稀释液称取土样10g，放入盛 90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中， 振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌 分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土 壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸 三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌 吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml 无菌水的试管中，以此类推制成10-1、 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各种 稀释度的土壤溶液。
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平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的 方式以外，还可以用涂布平板的方式进行。 二者操作基本相同，所不同的是后者先将牛 肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，待凝固后 编号，并于37℃左右的温箱中烘烤30min， 或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸 管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度 编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌 液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20～ 30min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒 置37℃的恒温箱中培养24～48h。 涂布平板用的菌悬液量一般以0.1ml较为适宜 ，如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完 后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易 形成单菌落。
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（3）涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分 别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种 稀释度，然后用三支1ml无菌吸管分别由 10-4、10-5和10-6三管土壤稀释液中各 吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板中 ，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布 均匀，如图Ⅶ-2所示。
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菌落记数仪
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一般选择每个平板上长有30~300个菌落的 稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同一 稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很 大，否则表示试验不精确。实际工作中同一 稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便 于数据统计，减少误差。由10-4、10-5、 10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌 落形成单位数也不应相差太大。 平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度 是很重要的。一般以三个连续稀释度中的第 二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落 数在50个左右为好，否则要适当增加或减少 稀释度加以调整。
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为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微 生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供 给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只 利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而 淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平 板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离 、纯化该微生物，直至得到纯菌株。 土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生 物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土 壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以 从其中分离、纯化到许多有用的菌株。
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3）取样 用三支1mL无菌吸管分别吸取10-4、10-5和 10-6。的稀释菌悬液各lmL，对号放入编好号的 无菌平皿中，每个平皿放0.2mL。 不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀释 菌液放入平皿臼，这样容易加大同一稀释度几个重 复平板间的操作误差。 4）倒平板． 尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化 后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约15毫 升/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与 菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平 皿盖上。
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三、器材
高氏1号琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂培 养基，马丁氏琼脂培养基，盛9ml无菌水的 试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环， 10％酚，无菌培养皿，链霉素，土样等。 大肠杆菌菌悬液、 牛肉膏蛋白胨培养基。 lm1无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无 菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。
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四、操作步骤
1．稀释涂布平板法 （1）倒平板 将肉膏蛋白胨培养基、高氏1号 琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基溶化，待冷至 55—60℃时，向高氏1号琼脂培养基中加入10 ％酚数滴，向马丁氏培养基中加入链霉素溶液， 使每毫升培养基中含链霉素30μg/mL。然后分 别倒平板，每种培养基倒三皿，其方法是右手持 盛培养基的试管或三角烧瓶，置火焰旁边，左手 拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指 、无名指夹住拔出，如果试管内或三角烧瓶内的 培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指 中。试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培 养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约 15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀 分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。
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（4）培养 将高氏1号培养基平板和马丁氏培养 基平板倒置于28℃温室中培养3—5日，肉膏 蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2—3日。 （5）挑菌落 将培养后长出的单个菌落分别挑取 接种到上述三种培养基的斜面上，分别置 28℃和37℃温室中培养，待菌苔长出后，检 查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查 是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就 要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
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常用的划线方法有下列二种： 1）用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在 平板培养基的一边作第一次平行划线3—4条，再 转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉 ，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线 ，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行 划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线 划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。 2）将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续 划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置温室培养。
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（3）挑菌 同稀释涂布平板法，一直到菌分纯 为止 3、平板菌落计数法 l）编号 取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4 、10-5、10-6。(稀释度)各3套。另取6 支盛有4.5mL无菌水的试管，依次标是 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、 10-6。
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2）稀释 用lmL无菌吸管吸取lmL已充分混匀的大肠杆菌菌 县液(待测样品)，精确地放0.5ml至10-1的试管 中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液 中。 将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混 匀。另取一支lml吸管插入10 1试管中来回吹吸菌 悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时 不要太猛太快，吸时吸管伸人管底，吹时离开液面 ，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外 溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精确地放 0.5mL至10-2试管中，此即为100倍稀释。…… 其余依次类推，整个过程如图VIII-3所示。 放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能 接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果 误差较大。 2016/1/6 19
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平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后， 其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的 稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细 胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌 落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数， 根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中 的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分 散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可来 自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计 数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计 数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位 (colony-forming units，cfu)而不以绝对菌 落数来表示样品的活菌含量。