4章-核酸序列分析报告
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第四章 核酸序列分析
4.1 常规分析
核酸序列的常规分析包括核酸序列的检索,核酸 序列组分分析,序列变换,限制性酶切分析等等
4.1.1 核酸序列的检索
在相关序列数据库中,选择合适的查询方法检索某 个物种的核酸序列信息.如使用NCBI的Entrez查询系 统和EMBL的SRS查询系统
4.1.2 核酸序列组分分析
任务
寻找VPI 10463 标准株毒素B的编码序列（X53138）。 利用DNASTAR 寻找毒素B基因的开放阅读框 寻找CDB3区（氨基酸 1751- 2366）的编码序列 采用实验室仅有的Pgex-4t-1质粒载体进行表达，请选择合适的限 制性内切酶设计引物
4.2 序列比对
为什么要序列比对
• 序列比对又叫序列联配 , 对排 核酸、氨基酸序列的相似性
序列比对
• DNA : A T G C • Protein: ARNDCQEGHILK……
例： • TTCGCAGCGC • TTAGGACCTC
（偶然相似性）
量化相似性 比对
• 考虑这样的两条核苷酸序列： AATCTATA和AAGATA 仅有三种比对方式
不考虑空位的简单比对，它的打分函数是由对比奖励和罚分 的和来决定
匹配得分：1 失配得分：0
上例中三个比对从左至右分别是 4、 1、 3
• SEQ 1 和SEQ 2:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12.。。。。。。。。
AATTGATTGCGCATTTAAAGGG AACTGACGCATCTTAAGGG
AATTGATTGCGCATTTAAAGGG AACTGA------CGCATCTTAAGGG
核酸序列的组分分析一般包括分子质量,碱基组成, 碱基分布等
实例分析:使用BioEdit分析水稻瘤矮病毒基因组S8片 段编码序列的基本性质.
1 载入序列 运行BioEdit,依次打开File-open,载入待分析的目的序列.
2 输出结果 依次点击sequence ---nucleic acid ---nucleotide cowenku.baidu.composition
用DNAMAN对RGDV S8片段编码 区进行限制性酶切分析
搜索查询序列
选择CDS
从文件载入序列
复制粘贴载入序列
限制性酶切进行参数设置
酶选择
结果分析
在线限制性酶切分析工具（例如NEBcutter）
NEBcutter序列提交界面
分析结果
附加内容
• 用DNASTAR （editseq）将 DNA序列翻 译为蛋白质
• 推测结构功能及进化上的联系，是基因识 别，分子进化，生命起源研究的基础。
• 序列
结构
功能
• 序列比对理论基础：进化学说 如果两个序列之间具有足够的相似性，
就推测二者可能有共同的进化祖先，经过序列 内残基的替换、残基或序列片段的缺失、以及 序列重组等遗传变异过程分别演化而来。
序列比较的基本操作是比对， 两条序列中 各个字符的一种对应关系，或字符对比排列。
用DNASTAR （editseq）寻找ORF
背景：艰难梭菌(Clostridium difficile,CD) 是肠道感染中仅次于 弯曲杆菌的常见致病菌，我们根据Genth 的文章（New Method
to generate enzymatically deficient clostridium difficile toxin B as an antigen for immunization）．将CD标准株 VIP10463毒素B分成 3个氨基酸片段： CDB1(氨基酸 1-546，包 含接触反应区)，CDB2(氨基酸 90-1750，含有假定的跨膜区)， CDB3(氨基酸 1751- 2366，被认为是受体结合区)，发现抗毒素 B抗体与毒素B羧基末端 (氨基酸 175-2366)可以发生强烈反应， 说明该段很有可能成为制备疫苗和诊断抗原的重要候选蛋白．故 我们选取了毒素B羧基末端CDB3(氨基酸1751- 2366)进行克隆与 表达，为以后的疫苗和抗原鉴定的研究建立基础．
实例分析 使用DNASTAR 的EditSeq程序进行序列转换.
1 载入序列 运行DNASTAR,依次打开File—new—new DNA
载入待分析的目的序列.
2 寻找原序列的反向序列 和 反向互补序列 依次点击Edit—select all sequence
菜单Goodies----Reverse Reverse complement
3 结果解读 片段长度,分子量大小,GC含量, AT含量 核苷酸组成直方图
4.1.3 序列变换
在序列分析过程中,根据不同的分析需要,经常要对核酸序列 进行各种变换,如寻找序列的互补序列,反向序列,反向互补等,常 见生物学软件就集成这类功能,很容易实现序列的自由变换,如 DNAMAN,Primer premier,DNASTAR等
比对过程中需要在检测序列或目标序列中 引入空位，表示插入或删除
空位
• 两条或多条序列比对时，如果考虑到插入与删除 时间发生的可能性，那么候选的比对数量就会大 大增加，也就导致了比对的复杂性。
等等……
序列C D
• 序列C： CTGC • 序列D： ACCTAGATCG
检测序列、目标序列
• 检测序列（查询序列）：新测定的，希望 通过数据库搜索确定其性质或功能的序列
• 目标序列: 通过数据库搜索得到的和检测 序列具有一定相似性的序列
序列比对基本类型
• 两两比对：蛋白质序列之间 核酸序列之间
• 多序列比对：多个蛋白质或核酸同时比较
常用的序列比对工具BLAST、Clustal X
4.1.4 限制性酶切分析
在克隆和基因工程中,通常要对基因序列的限制性酶切位点 行分析,使用DNASTAR（mapdraw）对RGDV S8片断编码区序
列进行限制性内切酶分析.
研究背景: 为揭示水稻瘤矮病毒外层衣壳蛋白质P8在大肠杆菌中的表
达特性,需要将P8基因克隆到Pgex-4t-1上,以BamHI 和Xhol作 为克隆位点.设计表达引物时,考虑是否能在P8基因的两端分别 引入BamHI 和Xhol 酶切位点,此时需要进行限制性酶切分析.
4.1 常规分析
核酸序列的常规分析包括核酸序列的检索,核酸 序列组分分析,序列变换,限制性酶切分析等等
4.1.1 核酸序列的检索
在相关序列数据库中,选择合适的查询方法检索某 个物种的核酸序列信息.如使用NCBI的Entrez查询系 统和EMBL的SRS查询系统
4.1.2 核酸序列组分分析
任务
寻找VPI 10463 标准株毒素B的编码序列（X53138）。 利用DNASTAR 寻找毒素B基因的开放阅读框 寻找CDB3区（氨基酸 1751- 2366）的编码序列 采用实验室仅有的Pgex-4t-1质粒载体进行表达，请选择合适的限 制性内切酶设计引物
4.2 序列比对
为什么要序列比对
• 序列比对又叫序列联配 , 对排 核酸、氨基酸序列的相似性
序列比对
• DNA : A T G C • Protein: ARNDCQEGHILK……
例： • TTCGCAGCGC • TTAGGACCTC
（偶然相似性）
量化相似性 比对
• 考虑这样的两条核苷酸序列： AATCTATA和AAGATA 仅有三种比对方式
不考虑空位的简单比对，它的打分函数是由对比奖励和罚分 的和来决定
匹配得分：1 失配得分：0
上例中三个比对从左至右分别是 4、 1、 3
• SEQ 1 和SEQ 2:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12.。。。。。。。。
AATTGATTGCGCATTTAAAGGG AACTGACGCATCTTAAGGG
AATTGATTGCGCATTTAAAGGG AACTGA------CGCATCTTAAGGG
核酸序列的组分分析一般包括分子质量,碱基组成, 碱基分布等
实例分析:使用BioEdit分析水稻瘤矮病毒基因组S8片 段编码序列的基本性质.
1 载入序列 运行BioEdit,依次打开File-open,载入待分析的目的序列.
2 输出结果 依次点击sequence ---nucleic acid ---nucleotide cowenku.baidu.composition
用DNAMAN对RGDV S8片段编码 区进行限制性酶切分析
搜索查询序列
选择CDS
从文件载入序列
复制粘贴载入序列
限制性酶切进行参数设置
酶选择
结果分析
在线限制性酶切分析工具（例如NEBcutter）
NEBcutter序列提交界面
分析结果
附加内容
• 用DNASTAR （editseq）将 DNA序列翻 译为蛋白质
• 推测结构功能及进化上的联系，是基因识 别，分子进化，生命起源研究的基础。
• 序列
结构
功能
• 序列比对理论基础：进化学说 如果两个序列之间具有足够的相似性，
就推测二者可能有共同的进化祖先，经过序列 内残基的替换、残基或序列片段的缺失、以及 序列重组等遗传变异过程分别演化而来。
序列比较的基本操作是比对， 两条序列中 各个字符的一种对应关系，或字符对比排列。
用DNASTAR （editseq）寻找ORF
背景：艰难梭菌(Clostridium difficile,CD) 是肠道感染中仅次于 弯曲杆菌的常见致病菌，我们根据Genth 的文章（New Method
to generate enzymatically deficient clostridium difficile toxin B as an antigen for immunization）．将CD标准株 VIP10463毒素B分成 3个氨基酸片段： CDB1(氨基酸 1-546，包 含接触反应区)，CDB2(氨基酸 90-1750，含有假定的跨膜区)， CDB3(氨基酸 1751- 2366，被认为是受体结合区)，发现抗毒素 B抗体与毒素B羧基末端 (氨基酸 175-2366)可以发生强烈反应， 说明该段很有可能成为制备疫苗和诊断抗原的重要候选蛋白．故 我们选取了毒素B羧基末端CDB3(氨基酸1751- 2366)进行克隆与 表达，为以后的疫苗和抗原鉴定的研究建立基础．
实例分析 使用DNASTAR 的EditSeq程序进行序列转换.
1 载入序列 运行DNASTAR,依次打开File—new—new DNA
载入待分析的目的序列.
2 寻找原序列的反向序列 和 反向互补序列 依次点击Edit—select all sequence
菜单Goodies----Reverse Reverse complement
3 结果解读 片段长度,分子量大小,GC含量, AT含量 核苷酸组成直方图
4.1.3 序列变换
在序列分析过程中,根据不同的分析需要,经常要对核酸序列 进行各种变换,如寻找序列的互补序列,反向序列,反向互补等,常 见生物学软件就集成这类功能,很容易实现序列的自由变换,如 DNAMAN,Primer premier,DNASTAR等
比对过程中需要在检测序列或目标序列中 引入空位，表示插入或删除
空位
• 两条或多条序列比对时，如果考虑到插入与删除 时间发生的可能性，那么候选的比对数量就会大 大增加，也就导致了比对的复杂性。
等等……
序列C D
• 序列C： CTGC • 序列D： ACCTAGATCG
检测序列、目标序列
• 检测序列（查询序列）：新测定的，希望 通过数据库搜索确定其性质或功能的序列
• 目标序列: 通过数据库搜索得到的和检测 序列具有一定相似性的序列
序列比对基本类型
• 两两比对：蛋白质序列之间 核酸序列之间
• 多序列比对：多个蛋白质或核酸同时比较
常用的序列比对工具BLAST、Clustal X
4.1.4 限制性酶切分析
在克隆和基因工程中,通常要对基因序列的限制性酶切位点 行分析,使用DNASTAR（mapdraw）对RGDV S8片断编码区序
列进行限制性内切酶分析.
研究背景: 为揭示水稻瘤矮病毒外层衣壳蛋白质P8在大肠杆菌中的表
达特性,需要将P8基因克隆到Pgex-4t-1上,以BamHI 和Xhol作 为克隆位点.设计表达引物时,考虑是否能在P8基因的两端分别 引入BamHI 和Xhol 酶切位点,此时需要进行限制性酶切分析.