冰冻切片制作及质量控制
提高脑组织冰冻切片质量的几点体会
提高脑组织冰冻切片质量的几点体会一、本文概述脑组织冰冻切片技术是一种广泛应用于神经科学研究的重要实验手段，其质量直接影响到后续的实验结果和数据分析。
然而，由于脑组织结构的复杂性和特殊性，冰冻切片过程中往往面临着诸多挑战，如切片厚薄不均、组织变形、细胞结构破坏等问题。
本文旨在分享在脑组织冰冻切片实践中积累的经验和体会，探讨提高切片质量的关键环节和操作技巧。
通过对冰冻切片前处理、切片过程、切片后处理等关键步骤的详细阐述，本文旨在为神经科学研究者提供一套行之有效的脑组织冰冻切片方法，以期提高切片质量，为后续实验提供可靠的基础。
二、脑组织冰冻切片的基本原理和技术要点脑组织冰冻切片是一种在低温条件下对脑组织进行快速冷冻，然后进行切片的技术。
其基本原理是利用低温使组织迅速固化，保持组织的原始结构和细胞形态，以便后续的观察和分析。
这一技术广泛应用于神经科学研究、病理学诊断和药物研发等领域。
技术要点方面，选择合适的固定液对脑组织进行固定是至关重要的。
常用的固定液如4%的多聚甲醛可以有效地固定脑组织，保持其结构稳定。
快速而均匀的冷冻过程也是关键。
这通常通过使用液氮或冷冻机实现，以最大程度地减少冰晶形成对组织结构的破坏。
在切片过程中，选择适当的切片厚度和温度也是非常重要的。
一般来说，切片厚度在10-50微米之间，而切片温度则需要在-20℃到-30℃之间。
对切片进行后处理，如染色、封片等，也是提高切片质量的重要步骤。
脑组织冰冻切片技术需要严格的操作流程和精确的控制，以确保切片的质量和准确性。
通过不断地优化技术和积累经验，我们可以进一步提高脑组织冰冻切片的质量，为神经科学研究和病理学诊断提供更可靠的支持。
三、提高脑组织冰冻切片质量的措施脑组织冰冻切片是神经科学研究中的一项重要技术，其质量直接影响到后续的实验结果和数据分析。
为了提高脑组织冰冻切片的质量，我们采取了一系列措施，并取得了显著的成效。
在取材过程中，我们严格控制取材时间，确保脑组织在死亡后尽快被取出并处理。
冰冻切片制片实验步骤及注意事项
冰冻切片制片实验步骤及注意事项冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。
因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。
冰冻切片制片实验步骤1、组织固定：新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上。
将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整。
2、脱水：将修切好的组织放于15%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底后转入30%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底。
3、OCT包埋：将脱好水的组织取出用滤纸将表面水稍吸干后切面朝上放于包埋台上，组织周围滴上OCT包埋剂，将包埋台放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，OCT变白变硬后即可进行切片。
4、切片：将包埋台固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚°8-10μm。
将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。
-20°保存备用。
注意事项1、组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：① CO2气（-78℃）② 丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（-80℃）③ 液氮（-190℃）④ 液氮冷却的丙烷（-19℃）。
液氮适用于组织化学，较安全。
缺点：组织块易发生龟裂。
2、为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。
但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。
故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。
3、电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4%缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7.）84ml；蔗糖8g）固定较好。
这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。
制作临床快速冰冻切片的质量控制
高于20Λg mL甚至30Λg mL仍无任何不良发应,另一些人血药浓度低于10Λg mL就有良好的治疗效果,这是由于许多因素影响患者对氨茶碱的敏感性,它与患者对药物的反应性、敏感性、病理生理状态、年龄、吸烟、饮食、药物相互作用、遗传等因素有关,即治疗范围本身也存在个体差异,所以氨茶碱疗效的判断、剂量的调节等应将血药浓度与临床效果结合起来才客观科学。
参考文献:[1] 梁德荣.紫外分光光度法测定血浆氨茶碱浓度的改进[J].华西医大学报,1987,18(3):2562258.[2] 徐叔云.临床药理学[M].第1版.北京:人民卫生出版社,1989:54261.[3] 吴莱文.治疗药物监测[M].北京:人民卫生出版社,1989:295.[4] 李 .实用临床药物动力学[M].成都:四川大学出版社,1997:1572172.[5] 刘晓明.影响氨茶碱血药浓度的因素[J].中国医院药学杂志,1997,17(11):516.[6] 彭天吉.培氟沙星和氧氟沙星对氨茶碱药动学的影响[J].药学进展,1999,23(2):109.(收稿日期:2004202218)制作临床快速冰冻切片的质量控制袁永辉,张韵风(华中科技大学同济医学院基础医学院,湖北武汉430030)[摘 要]目的:探讨冰冻切片的制作、H E染色和免疫组化的标准化实验方法,达到质量控制标准。
方法:详细介绍了冷冻切片的方法、影响因素、标准化与质量控制及其在临床快速病理诊断的H E和免疫组织化学染色方法。
结果:经此方法制备的冷冻切片组织结构完整、细胞染色清晰、境界清楚、核质分明、对比度好,无刀痕、皱折、重叠、冰晶、切片平整、厚薄均匀一致等。
结论:可为临床快速病理诊断的H E染色、脂肪黏液染色、酶组织化学、免疫组织化学、免疫荧光、核酸原位杂交以及原位PCR等病理诊断与研究提供优质冷冻切片。
[关键词]冰冻切片;H E染色;免疫组化;质量控制[中图分类号]R446.8 [文献标识码]A [文章编号]1671-5098(2004)06A-0846-02The Qua l ity Con trol of M ak i ng Frozen Section s i n Cl i n ic Pa thology D i agnosisYUAN Yong2hu i,ZHAN G Yun2feng(T ongj i M ed ical Colleg e,H uaz hong U niversity of S cience and T echnology,W uhan,H ubei430030,Ch ina)Abstract:O b je c tive To exp lo re a standard experi m ental m ethod fo r m ak ing frozen secti ons and staining of hem atoxylin eo sin(H&E)and i m m unoh istochem istry,the secti ons w ere to m eet the quality contro l dem and in clinic patho logy tests.M ethods T h is article described a series of secti oning,affective facto rs,standardizati on and quality contro l in m ak ing frozen slices and its staining m ethods of H&E and i m m unoh istochem istry in clinic patho logy diagno sis.Re sults T he frozen secti ons by th is m ethod revealed m arkedly characteristic contrast,mo re detail and clear structure of tissues and cells,w ithout the blade trace,fo ld,ice crystals and the phenom enon of th ickness and th inness,and w ere suitable fo r m icropho tography.Conclusion T h is m ethod can p rovide frozen secti ons superi o r in quality fo r clinic patho logy diagno sis and research in stains of H&E,fat,m ucus,enzym e h istochem istry,i m m unoh istochem istry,i m m unofluo rescence,in situ hybridizati on and in situ PCR as w ell.Key W ords:F rozen secti on;H&E stain;I mm unoh istochem istry;Q uality contro lΞ 冷冻切片是病理科室最常用的快速制片方法之一,它是借助低温使组织达到一定的硬度进行切片的一种方法。
冰冻切片制作方法与注意事项
冰冻切片制作方法与注意事项冰冻切片是一种常见的制备生物组织切片的方法，其原理是将生物组织迅速冷冻并切割成极薄的切片，用于研究组织的形态结构和组织学变化。
下面是冰冻切片的制作方法和注意事项。
一、冰冻切片的制作方法：1.组织采集：选择需要研究的组织，如动物器官或植物部位，通常用组织固定剂进行固定处理，以保持组织的形态结构。
2.组织预处理：将固定的组织转移到含有蔗糖或蔗糖与聚乙二醇的冰冻液中，浸泡一定的时间使组织与冷冻液充分均匀接触，便于组织快速冷冻。
3.冰冻：使用液氮或刀片冷冻架等快速冷冻设备，将组织迅速冷冻至-20℃以下，使组织中的水分迅速形成冰晶，避免组织的形态结构变化。
4.切割：将冷冻的组织置于切片机或切片微波机上，用冷冻刀片将组织切割成薄片，通常厚度为10-30μm。
5.将切割好的切片用刷子或微型镊子移至载玻片上，通常用蛋白质固定剂或聚甲醛进行固定处理，以保持切片的形态结构。
6.干燥：将固定好的切片置于干燥器中，用适当的温度和时间干燥切片，使其充分固定在玻片上。
7.染色：根据需要可对切片进行染色处理，常见的染色方法有HE染色、银染色、免疫组化染色等。
二、冰冻切片的注意事项：1.快速冷冻：为了保持组织的形态结构和避免变形，必须采用快速冷冻的方法，将组织迅速冷冻至-20℃以下。
液氮和刀片冷冻架是常用的设备。
2.切片设备：选择适合的切片设备，如切片机或切片微波机。
刀片的选择也十分重要，常见的冰冻刀片有钢刀、玻璃刀和蜡刀，选择合适的刀片可以提高切片质量。
3.切片厚度：切割时要控制好切片的厚度，通常为10-30μm。
切片太薄容易导致组织切面不完整，切片太厚则不能得到清晰的显微镜图像。
4.切片技巧：切片技巧也很重要，需要稳定的手部技巧和耐心。
在切割时要保持刀片的稳定，避免划伤或碎裂组织。
5.切片保存：切好的切片需要妥善保存，可以用普通干燥器或冷冻干燥器进行干燥，避免切片变形和水分损失。
6.染色方法：根据需要选择合适的染色方法。
冰冻切片制作的细节要点总结
剂的稳定性达标，才可用于血液筛查工作。
检出限是可检测出的最低分析物的浓度，本室采用将弱阳性质量控制物倍比稀释的方法进行验证。
这种验证方法只能说明在对样本进行稀释状态下的最低检出限，并不代表最低检出限低的试剂其检出能力就一定好于最低检出限高的试剂[2]。
同时，CNAS ⁃CL02⁃A004：2018建议，弱阳性质量控制物作为外对照监控实验的有效性，浓度宜在2~4倍临界值左右。
对ELISA 试剂的检出限进行测定后，可以此为依据，对弱阳性质量控制物浓度进行调整，有利于室内质量控制。
符合率的验证可采用国家标准血清盘或临床诊断明确的阴阳性样本[2]，因血清盘一般不易获得，且价格昂贵，故在进行符合率验证时选择了往年国家卫生健康委员会临床检验中心对室间质量评价。
酶联免疫吸附试剂的敏感度和特异性亦是需要重点考察的指标，可以有效防止弱阳性标本漏检和阴性标本误判为阳性[3]。
依据CNAS ⁃CL02⁃A004：2018文件要求，当采用手工操作或同一项目使用2套及以上检测系统时，应进行实验室内部比对，包括人员和不同检测系统间的比对。
因此，当实验室有1套以上全自动加样仪、1套以上全自动酶免分析仪进行ELISA 检测时，应进行全自动加样仪比对、全自动酶免分析仪比对。
倘若某仪器不能正常运行时，可将该项目检测转移至其他自动加样仪或全自动酶免分析仪中，其结果亦可信。
人员比对验证表明，在全自动加样仪或全自动酶免分析仪运行发生故障时，不同工作人员手工操作ELISA 后续步骤的结果与仪器操作时结果相一致。
此外，CNAS ⁃CL02⁃A004：2018对实验室设备故障修复后，如果影响了方法学性能，应进行合适的方式进行相关的验证，我们结合文件要求与本室工作实际，也进行了相应的验证，以确保设备维修前、后试验结果的一致性。
自2016年以来，我室通过以上方法验证酶联免疫试剂共15次，调整弱阳性质量控制浓度4次，保证了试剂的品质和室内质量控制水平。
冰冻切片中常见问题分析
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6、切片皱缩或卷缩：
这也是影响切片质量的重要因素之一。常见的原因有：① 刀锋变钝。② 防卷板粘有异物，防卷板的作用是防止切 片卷缩，但若粘有异物，切片时组织会被挤压而缩在一起。 ③ 防卷板与刀锋的位置不平行、不协调。④ 组织块包埋 不完全，缺乏支撑作用。 预防与处理的方法：① 注意检查刀具，及时更换刀口， 定期磨刀。② 保持防卷板的清洁，每做一例冷冻切片， 均应将刀口及防卷板拭擦干净，防止切片的污染和切片皱 缩。③ 调整刀、防卷板的位置，保证两者平行，且防卷 板比刀锋前0.2㎜左右。④ 包埋组织应完全，没法切片者 再滴加包埋胶。
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4、染色对制片的影响：
尤以细胞核的染色最为关键，在寒冷的冬季，室温过低时， 影响核的着色，可适当加温，用以增色，苏木素的酸碱度 应适宜，经常观察其染液的ph值，过碱时应及时更换，盐 酸酒精分化适度，时间控制到位，否则易造成核着色不佳， 染色质不清晰，影响诊断的准确性。
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冰冻切片中 常见问题分析
临安人民医院
1、组织取材对制片的影响
组织取材大小：组织块大小要适宜，冷冻切片机 内切片刀移动的范围有一定的限制，超出其范围 时，易致切片不全。一般情况下，冰冻切片的组 织大小为1.5×1.5㎝,厚2㎜。但卵巢肿瘤及脂肪组 织可稍微大些。组织块过大，切片时阻力过大， 易产生皱折，刀痕，组织易崩碎，增加制片难度， 影响诊断。如需在同一标本托上放大于两块组织 时，应尽量冻成一个平面，与刀锋平齐，以防切 片不完整，发生漏诊。若送检组织过小，请预先 速冻一冷台面，再行包埋，利于制片。另外，包 埋时，应将组织平放在冻头的中央。
5、冰晶的形成对制片的影响：
此原因主要取决于组织含水量的大小，尤以组织细胞水肿， 淋巴结，纵隔肿瘤，卵巢肿瘤为甚，送检取材过程中接触 水源，速冻过程中使用的液氮时间尚未控制好，同是造成 冰晶形成的原因，其解决方法为，使用液氮时间上控制到 位，保证一次冻透标本，组织送检取材时，尽量避开水源， 如遇含水量高的标本时，应尽量用干纱布吸干水分后再行 冷冻，避免由于冰晶形成出现诊断上的失误。操作者的动 作应迅速。
术中快速冰冻切片的规范及程序
术中快速冰冻切片的规范及程序１.冰冻切片的制备１.１打开照明开关，打开冰冻切片机的玻璃箱盖。
１.2选择冻头，在冻头滴上冰冻切片机包埋剂适当。
１.3 待组织完全冷冻后，将冻头移到切片刀口的冻口内，扭紧冻头，进行切片，切片时有节奏的来回推动摇手柄，切得完整且较薄的切片（厚度8-9um），即可贴在玻璃片上。
１.4 将切好的片子用95%的乙醇固定，然后进行染色、封片、镜检（同石蜡切片H-E染色步骤）。
１.5工作完毕后将冻头上组织取出，放回送检的标本袋内，用10%的中性甲醛固定液固定。
１.6清扫切冰冻切片机箱，将冻头擦干后放回冰冻切片机内。
１.7关好冰冻切片机的玻璃箱盖，关闭照明电源。
２.冰冻切片机须24h开机，长假或节假日前检查切片机箱内的结冻情况，必要时关机，化霜，清洁冰冻切片机。
３.注意事项３.1 制作冷冻切片所需的试剂和设备等应处于随时可供使用状态。
３.2 切取的组织块大小适宜（厚度<2mm），并尽快置于冷冻组织切片机上制备切片。
３.3 调节冷冻程度，试切合合适时便迅速切片。
冷冻不足无法切片，冷冻过度切片易碎。
３.4 冷冻切片固定液95%乙醇50ml４.单体标本的冰冻制片应在１５min内完成。
术中快速冰冻诊断的规范及程序１.临床医师在术前向患者或近亲属告知术中快速病理诊断的局限性，签署术中快速病理诊断知情同意书。
２.从标本接收到发出报告的时间，应在病理申请单上注明。
３.有条件的由两位中／高级称职的病理医师共同签署快速活检的病理诊断意见。
对于病变疑难、手术切除范围广泛和会严重致残的手术中快速活检，应由两位高级称职的病理医师共同签署会诊意见。
主检病理医师签名的字迹应能辨认。
４.快速活检诊断意见一般在收到送检标本后３０min内发出；同一时间段内相继收到的多例患者标本或是同一例患者的多次标本，其发出报告的时间依次类推。
对于疑难病变，可酌情延时报告。
５.对于难以即时快速诊断的病变（例如病变不典型、交界性肿瘤病变或送检组织不足以明确诊断等），主检病理医师应向手术医师说明情况，恰如其分地签发病理诊断意见或告知需要等待常规石蜡切片进一步明确病理诊断。
冰冻切片制作及质量控制
冰冻切片制作及质量控制冰冻切片是一种在生物组织学研究中广泛应用的技术，它可以制备出细胞和组织的高质量切片，用于后续的染色、免疫组化和显微镜观察等研究。
为了获得高质量的冰冻切片，制作过程中需要严格控制各个环节，包括样本取材、固定、冻结和切片等步骤。
同时，质量控制也是制作高质量冰冻切片的重要环节之一、下面将详细介绍冰冻切片制作及质量控制的相关内容。
1.样本取材样本取材是制作高质量冰冻切片的第一步，样本的选择和处理对后续切片的质量有重要影响。
通常情况下，应选择代表性的组织，样本必须新鲜，不宜暴露在空气中过长时间，以避免氧化和细胞坏死的发生。
此外，为了使切片更容易涂抹和切割，样本应具有一定的硬度，可以根据需要使用组织固定剂、切片缓冲液等进行处理。
2.组织固定组织固定是为了保持组织的形态结构和细胞的生物学特性，同时防止样本在切片过程中的损伤和变形。
常用的固定方法包括冷醇固定、中性缓冲福尔马林固定等。
固定时间和温度的选择需要根据不同的样本和研究要求进行优化。
3.冻结冻结是制作冰冻切片的关键步骤，它能够快速、有效地固定组织并保持组织的形态。
冻结样本时应使用冷冻剂，如液氮、干冰-酒精混合物等。
在冻结过程中，要避免组织在冻结过程中受到机械或化学损伤，因此可以使用特制的冷冻模具和刀片。
4.切片5.质量控制质量控制是确保冰冻切片质量的关键环节之一、常用的质量控制指标有切片厚度、切片完整性、目标细胞或结构的保存等。
切片厚度的一致性对于后续的显微镜观察和数据分析具有重要影响，可以使用显微镜或数字软件测量切片厚度。
切片完整性是指组织切片的连续性和无碎片断裂等情况，可以通过显微镜观察和染色评估。
目标细胞或结构的保存是评价冰冻切片质量的重要指标，可以通过免疫组化染色、细胞核染色等方法进行评估。
综上所述，制作高质量的冰冻切片需要控制好样本取材、组织固定、冻结和切片等环节，并通过质量控制手段来评估切片质量。
只有在每个环节都进行精细操作和严格控制的情况下，才能制备出适合后续研究的高质量冰冻切片。
冰冻切片制作及质量控制
冰冻切片制作及质量控制冰冻切片是一种常用的组织学研究方法，广泛应用于生物医学研究领域。
它可以保持组织的原始形态和结构，适用于光镜、电镜和免疫组化等多种研究方法。
在进行冰冻切片制作时，需要注意一些关键步骤和质量控制措施，以确保获得高质量的切片材料。
1.样品准备样品准备是冰冻切片制作的第一步。
样品可以是动物组织或细胞，也可以是植物组织。
在样品准备过程中，需要注意以下几点：-样品的自然纹理：对于动物组织，应将样品固定在适当的溶液中，以保持其自然纹理。
对于植物组织，应注意保持组织的形态和结构。
-样品的尺寸：样品的大小应适合冰冻切片仪的切片室大小。
过大的样品可能无法完全冻结，导致切片质量降低。
2.样品冷冻将样品冷冻是冰冻切片制作的关键步骤之一、样品冷冻的目的是在不损坏样品的情况下将其冷冻成脆性，以便后续切片。
以下是几种常用的样品冷冻方法：-空气冷冻：样品通过将其放置在冷冻剂中（如液氮或酒精等）迅速冷冻，使其变得脆性。
这种方法适用于较小的样品。
-次凝胶冷冻：将样品浸入液体凝胶中，使其均匀冷冻。
这种方法适用于较大的样品。
-快速冷冻机冷冻：使用快速冷冻机将样品超快速冷冻。
这种方法可以快速冷冻样品，并保持其形态和结构。
3.样品切片样品冷冻后，可以使用冰冻切片机将其切成薄片。
以下是一些注意事项：-选择合适的切片机：合适的切片机应具有良好的冷冻性能和切割能力。
切片机的刀片应尖锐，以便切割样品。
-控制切片厚度：切片厚度直接影响到后续研究结果的准确性。
根据实验需求选择合适的切片厚度，并保持在一定范围内的一致性。
-控制切片速度：切片速度应适中，过快可能导致切片不均匀，过慢可能导致切片丢失或拉长。
-冷藏切片：在切片过程中，应将切好的切片放入冷冻盒中，以防止其变形或融化。
冷藏过程中应注意避免切片受压。
4.质量控制为了确保冰冻切片的质量，需要进行一定的质量控制措施：-内外标准：在切片中加入内外标准物质，以确保切片的准确性和可比性。
冰冻切片制作方法与注意事项
冰冻切片制作方法与注意事项一、固定：固定即借助化学试剂是组织和细胞中的有机和无机成分凝固或沉淀，停止发生死后组织变化，尽量保持其活体状态的过程。
固定的方法有浸泡固定法，注射、灌注固定法，蒸汽固定法，本实验用的是注射、关注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难流入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，就可采用灌注或灌流固定法。
固定时将固定液直接注入动物的血管，经血管分支到达整个组织或全身，从二十只得到充分固定。
固定液分为单纯固定液和混合固定液。
单纯固定液有甲醛、乙醇、氯化汞、醋酸、苦味酸等，混合固定液包括Bouin液、Zenker液、Carnoy液、中性甲醛液等。
本实验用的固定液为4%甲醛（10%福尔马林）。
固定后的处理：用水配制的固定液固定后应用流水冲洗，可是组织中的固定液随时溢出和随时洗去。
对小动物和脑组织等，应以浸泡为主，即能达到冲洗的目的，又不损害组织。
【注意事项】1.固定要及时。
2.组织块的大小要合适。
3.应有足够的固定液，一般与组织块的比例为20:1，容器勿过小，组织勿过多。
4.固定时间要合适，甲醛固定液一般固定两天左右，第一天要更换一次固定液。
5.要进行促使固定，在固定期间轻轻地搅动组织或摇动容器使组织移动有利于固定液的渗透，适当提高温度也可缩短固定时间。
6.选择合适的固定液。
7.一次取材数量过多时，应对取材部位和顺序进行编号，并及时做好记录。
二、脱水脱水就是用某些溶剂逐步将组织块内的水分置换出来的过程，使用的试剂称为脱水剂。
脱水剂有非石蜡溶剂的脱水剂如乙醇、丙酮等，和脱水兼石蜡的脱水剂如正丁醇等。
本实验所用的是乙醇脱水。
乙醇是最常用的脱水剂，其优点是脱水能力强，即能与水相混合，又能与透明剂相混，并可使组织硬化，便于切片。
缺点是穿透组织的速度快，且容易使组织收缩、变脆。
为克服这一缺点，在一般脱水中，应采用循序渐进的方法，逐步升级，经一系列不同浓度的乙醇，使组织中的水分逐渐被乙醇代替。
冷冻切片操作指南
冷冻切片操作指南在医学、生物学和食品科学等领域中，冷冻切片是一种重要的技术，用于将样品冷冻固化后，切割成薄片以供进一步观察和研究。
本文将为读者提供一份冷冻切片操作指南，介绍冷冻切片的基本原理、实验室操作步骤和注意事项。
一、冷冻切片的基本原理冷冻切片是将样品通过快速冷冻技术使其迅速固化，然后使用切片机或显微切片机将固化的样品切割成薄片。
冷冻切片的目的是保留样品的形态和结构，避免切片过程中的伤害和变形。
冷冻切片一般适用于需要保留细胞和组织结构的实验。
二、实验室操作步骤1. 样品准备：将待切割的样品准备好，可以是细胞、组织或食物等。
样品处理过程中需要注意保持样品的完整性和活性。
2. 冷冻固化：将样品放置在冷冻剂中，例如液氮或冷冻盒中的冰水混合物中，进行快速冷冻固化。
冷冻时间需要根据不同样品的特性进行优化，一般在几分钟至数小时之间。
3. 选用切片仪器：根据实验需求，选择合适的切片仪器，可以是手动的切片机或半自动/全自动的显微切片机。
4. 切片调整：根据实验需求，调整切片仪器的切割参数，例如切片厚度和速度等。
通常，薄片的厚度在几微米至数十微米之间。
5. 切片过程：将冷冻固化的样品放置在切片仪器的切片台上，固定好，并且调整好切割参数。
使用手动或电动操作切片仪器，将样品切割成所需的薄片。
6. 切片收集：将切割好的薄片收集起来，可以使用切片刷或显微镊子等工具进行操作。
注意保持薄片的完整性和干燥，避免受到污染和损坏。
7. 切片处理：根据实验需求，进行切片的进一步处理，例如染色、免疫组化等。
三、注意事项1. 样品处理过程中需要注意保持样品的完整性和活性，避免样品受到损伤和变性。
在样品处理过程中，可以使用缓冲液或甘油等物质进行保护。
2. 冷冻固化的时间和温度需要根据不同样品的特性进行优化。
过长或过短的冷冻时间都可能导致样品质量下降。
3. 在选择切片仪器时，需要根据实验需求和预算等因素进行权衡。
手动切片机相对便宜，但操作较为繁琐；半自动/全自动的显微切片机操作更为方便，但价格较高。
冰冻切片制片质量控制标准
冰冻切片制片质量控制标准
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冰冻切片质控措施
1、冰冻组织要求用干纱布包裹立即送检，切忌用盐水或福尔
马林溶液固定。
2、取材前尽量用滤纸吸干组织表面的水分，选取好的组织尽
快速冻以减少冰晶的形成。
3、由取得冰冻制片资格的技师操作执行。
4、制片时间掌握在20分钟内完成。
5、切片质量要求：
a、切片完整；
b、厚薄均匀，厚度6μm左右；
c、无褶无刀痕；
d、组织内无冰晶产生；
e、染色核、浆分明，红蓝适度；
f、切片透明洁净，封裱美观；
6、每次切片进行评片。
冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理课件
加强操作人员技能培训与交流学习
总结词
加强操作人员技能培训和交流学习可以提高冰冻切片 制作和染色技术的水平。
详细描述
操作人员的技能水平对冰冻切片制作和染色结果具有 重要影响。因此，应加强操作人员的技能培训，使其 掌握正确的操作方法和技巧。此外，组织操作人员之 间的交流和学习，可以分享经验和技巧，提高整体技 术水平。同时，鼓励操作人员积极参与学术会议和技 术研讨会，了解最新的技术和进展，也是提高技术水 平的有效途径。
04
冰冻切片染色常见问题及 处理方法
染色不均匀
总结词
冰冻切片染色不均匀可能是由于染色时间不足或过长、染色液浓度不合适、切片温度不均匀等原因引 起的。
详细描述
染色不均匀的问题可以通过控制染色时间和浓度来解决。一般来说，染色时间不宜过长或过短，应根 据染色液的浓度和切片厚度来适当调整。同时，确保切片温度保持均匀，避免局部温度过高或过低。
详细描述
在冰冻切片制作过程中，组织固定 是关键步骤之一。如果固定不当， 会导致细胞结构变形、组织结构松 散等问题。
处理方法
应掌握组织固定的最佳时间和方法 ，根据组织类型和实验要求选择合 适的固定剂，并严格控制固定时间 。
切片温度不适宜
总结词
切片温度不适宜可能引起细胞结 构破坏，影响切片质量。
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总结词
切片温度和厚度的调整对切片质量和染色效果具有重 要影响。
要点二
详细描述
在冰冻切片制作过程中，应根据组织类型和实验需求 ，选择合适的切片机和切片刀，并调整切片温度和厚 度。一般来说，较薄的切片更容易染色和观察，但过 薄的切片可能会导致组织结构破坏和细胞丢失。同时 ，应根据染液特性，选择合适的染色时间和温度，以 确保染色效果。
冷冻切片方法及注意事项
一、试验前预备清理试验台及仪器。
开启冷冻切片机并将冷冻切片机预降至所需温度〔- 15~-20 ℃*〕。
预备好处理好的载玻片、刀片、胶水以及药品。
二、取材解剖之后快速取出所需的颖组织，用干纱布或滤纸擦干后不需固定直接取材〔24×24×2mm*〕,以防形成冰晶造成切片中形成外形不一的空泡,使细胞内构造移位。
〔注：取材中目的标本既要明确也要确保其构造的完整性，应避开不必要的脂肪及坏死组织附着;要尽量剔除毛发、硬骨或钙化物;保乳手术切缘由于脂肪组织较多,取材厚度最好不要超过3mm，厚者冰冻费时，大者难以切完整。
甲状腺及淋巴结组织要带全组织被膜并除去多余的脂肪组织。
〕三、冷冻切片1、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片〔1~3 分种〕。
2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
3、调好欲切的厚度，依据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10μm 间。
4、调好防卷板。
制作冰冻切片，关键在于防卷板的调整上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。
切片时，以切出完整、平滑的切片为准。
切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向略微用力轻轻一带,可避开组织摊片过程中皱折,保证组织构造的完整及切片的美观。
注：①包埋剂的选用：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会影响标本冷冻质量。
常用的有三种包埋剂OCT 剂、B 超藕合剂以及一般胶水。
B 超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织,一般胶水或OCT 剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。
〔OCT 包埋剂骤冷时固化，其冷冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。
〕②组织块过小：先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻,约30 秒钟左右待胶凝固时将小组织放上, 组织四周再加一些胶,再次置于冷冻机中冷冻,这样组织被垫高,就能快速切出高质量的切片。
冰冻切片的步骤及注意事项
冰冻切片的步骤及注意事项嘿，友友们！今天咱来唠唠这冰冻切片的那些事儿，可别小看它哟，这里头的步骤和注意事项那可不少呢！
先说这第一步，取材那可是相当关键呐！就好比你要做一道超级美味的菜，原料得新鲜吧！取材的时候就得眼疾手快，别磨蹭，不然那材料都不新鲜啦！而且取的位置也得准，不然切出来的片子可就不地道喽。
然后就是速冻啦，这就像是给材料来个急速冰镇。
嘿，可别慢悠悠的，得赶紧把它冻得邦邦硬，不然切片的时候可就不好玩啦。
想象一下你切个软不拉几的玩意儿，那能成啥样！
接着就是切片啦，这可是个技术活。
就跟咱削苹果似的，你得手法稳，不然切出来那一片片厚的厚，薄的薄，那可不行！我跟你说，这时候就得开启“大师模式”，每一刀都得恰到好处，别整那些歪七扭八的片子出来。
哎呀，这过程中可得注意好多事儿呢。
比如说温度得控制好，太高了不行，太低了也不行。
温度不对，那切出来的片子不是皱皱巴巴就是碎成渣，这可不是咱想要的结果嘛。
还有呢，切片机也得爱护好，就跟咱的宝贝似的，不然它捣乱起来，你可就有的愁喽。
有时候啊，这冰冻切片就跟一场战斗似的，你得和各种因素斗智斗勇。
一不小心哪里出点差错，那片子可不就给你颜色看啦！但咱也不能怕呀，就得勇敢面对，慢慢摸索，找到最佳的方法。
我还记得刚开始接触冰冻切片的时候，那真叫一个手忙脚乱啊。
不是这儿出问题就是那儿不行，简直让我哭笑不得。
不过呢，随着经验的积累，现在咱也能轻松应对啦。
总之呢，冰冻切片虽然有些麻烦，但只要咱掌握了步骤和注意事项，加上那么一点点的耐心和细心，就一定能把它搞定！友友们，加油干吧，让我们在冰冻切片的世界里闯出一片天！。
病理冰冻工作制度
病理冰冻工作制度一、目的病理冰冻工作制度旨在规范病理冰冻切片检查的流程，确保病理诊断的准确性和及时性，提高医疗服务质量，保障患者安全。
本制度适用于病理科（室）进行冰冻切片检查的所有工作人员。
二、工作原则1. 严格遵循国家相关法律法规和医疗机构管理规定，执行病理冰冻切片检查的标准操作程序。
2. 坚持以患者为中心，尊重患者权益，保护患者隐私。
3. 强化团队合作，确保各部门、各环节密切配合，高效运作。
4. 不断提高病理冰冻切片检查的技术水平，提升病理诊断能力。
三、工作流程1. 接收标本：病理科（室）收到临床科室送检的标本后，应及时进行核对，确保标本名称、数量、送检单等信息准确无误。
2. 预处理标本：根据标本类型和性质，进行相应的预处理，如固定、染色、脱水、透明化等。
3. 制作冰冻切片：将预处理后的标本放置在低温恒冷切片机中，按照设定的参数制作冰冻切片。
4. 切片观察：制作好的冰冻切片应立即在光镜下观察，判断切片质量，如有问题应及时处理。
5. 诊断报告：病理医师根据冰冻切片观察结果，撰写诊断报告，并由主治医师或以上职称的病理医师审核签字。
6. 发送报告：将诊断报告及时发送给临床科室，确保患者治疗方案的制定和实施。
7. 归档管理：将病理冰冻切片资料进行归档管理，便于后续查询和质控。
四、工作要求1. 人员配备：病理科（室）应配备足够数量的病理医师、技术员和辅助人员，确保病理冰冻切片工作的正常开展。
2. 培训与考核：对新入职的病理医师和技术员进行专业培训，并进行考核，合格后方可从事病理冰冻切片工作。
3. 设备维护：定期对低温恒冷切片机、显微镜等设备进行维护和保养，确保设备性能稳定。
4. 质量控制：建立和完善病理冰冻切片质量控制体系，定期进行质量评估，持续改进工作流程。
5. 应急预案：制定病理冰冻切片检查的应急预案，确保在突发事件或设备故障时能及时采取措施，保障患者利益。
6. 科研与学术交流：鼓励病理医师和技术员参与科研活动，积极参加学术交流，提升病理冰冻切片技术水平。
冰冻切片制备的主要步骤
冰冻切片制备的主要步骤冰冻切片制备是一种常用的生物学和医学实验技术，用于在冷冻状态下快速切割组织样本，并进行随后的病理学诊断或研究。
以下是冰冻切片制备的主要步骤：一、准备样本在进行冰冻切片制备之前，需要准备好待检测的组织样本。
这些样本可以来自各种来源，如手术切除、活检、尸检等。
样本应该尽快放入适当的冷冻介质中，如OCT包埋剂，以保持其冷冻状态。
二、冷冻将准备好的样本放入冷冻切片机中，通常是一个恒温的金属块。
这个金属块被冷却到低于-20℃的低温，确保样本快速冷冻。
在这个过程中，需要特别注意不要让冷冻过度或不足，因为这会影响切片的品质。
三、切片使用冷冻切片机将冷冻好的样本切成薄片。
切片的厚度通常在5-10微米之间，以确保切片能够清楚地显示组织的结构和特征。
这个过程需要熟练的技术员操作，以保证切片的完整性和均匀性。
四、固定刚切好的切片非常容易受到热和湿气的影响，因此需要迅速固定。
通常使用甲醇或乙醇作为固定剂，将切片固定在载玻片上。
这一步可以防止切片在接下来的步骤中滑落或移动。
五、染色固定好的切片需要进行染色以更好地显示其结构和特征。
最常用的染色方法是hematoxylin and eosin (H&E)染色。
这一步可以在染色机中完成，也可以手工操作。
染色完成后，切片会被冲洗干净并彻底干燥。
六、观察和诊断最后一步是将制备好的切片放在显微镜下观察，并进行病理学诊断。
此时，病理学家可以根据切片的特征对疾病进行分类和分级，或者对手术切缘进行评估。
以上就是冰冻切片制备的主要步骤。
需要注意的是，每个步骤都需要严格的操作规程和技术要求，以保证制备出的切片能够准确地反映组织的结构和特征。
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云南省肿瘤肿瘤医院病理科 李 磊
影响术中病理诊断准确性的因素
1 低温对组织的损伤,细胞着色力及快速出片影响
2
切片破碎、皱褶多、空洞、冰晶现象 切片厚薄不均、细胞重叠、色调不正 颜色对比不协调、染色不均、模糊不清
3
4
5
病理申请单书写不规范、送检不及时等
如何提高冰冻切片的质量
取材 速冻
组织破碎: 如果组织冰冻过头,使之发脆就会发 生破碎,这时用手贴在组织上片刻稍加温使其 软化即可切出完整的切片。
5脱片
冰冻切片一般很少脱片, 偶尔见于坏死组织或 纤维较多的组织，或者载玻片不清洁 切片太 厚或组织本身的原因。 解决方法: 将组织切片切得更薄2-3um,切片固 定后用吹风机吹干或用防脱片贴片后染色，染 色时轻拿轻放，防止人为脱片。
速冻
为什么速 冻呢？
ห้องสมุดไป่ตู้
当然是为 了减少冰 产生
如何才能保证速冻？尽量减少冰晶的产生
半导体制冷
液氮
冻锤的使用
冻锤的使用
在组织冷冻过程中,组织内可产生大量的冰晶影响 冰冻切片的诊断,为了防止组织内冰晶的产生最好 的办法是使用冻锤。新鲜标本包埋后放入冷冻台 时,不能将冻锤马上按压在组织上,那样会使组织 受挤压变形。应该待 O. C. T. 60 % ~ 70 %凝固时 再将冻锤轻压在组织上,这样既能防止冰晶的产生 又能得到较平整的切面。
切片注意事项
1、样本托放入机头时，必须根据组织的结构及走势来放置。 2、较硬的组织切片时，组织表面呈胶冻状时，将其修切去， 因为冷冻是自下而上，表面呈胶冻状时(例如内膜癌的子 宫肌壁带全层)，下面组织已符合切片最佳时机。 3、组织过冻时，可带上薄膜手套用拇指置于组织块表面几 秒钟。 4、组织有部分不需要或阻碍我们获得高质量切片时，可将 其挖除。 5、切片时，注意观察组织表面有无包膜，结节，但修片时 也必须注意观察重点病变的微小病灶避免修切过度，造成 误诊，漏诊，切片厚度4~5um，淋巴结切片 3 um 为宜。
切片后用载玻片贴片时手不能颤抖,而 且在贴附组织时手要有一个向下伸展的动 作, 切片机的盖打开越小越好。
3.组织挤压、 皱缩:
常见于组织结构软硬不同的组织, 解决方法:标 本较硬的部分摆在上端, 先切较软的部分, 依次 切到硬的部分,同时用毛笔轻轻地展开, 或用抗 卷板才能切出完整的切片。
4.组织破碎
6冷冻欠佳致切片困难:
不易成形，产生搓板状 ，厚薄不均 破碎 或糊糊状:组织冷冻时间不够或冷冻机内设定 的温度未达到要求 可延长冷冻时间或调低冷 冻机冷冻温度 若为刀片的温度不够冷，要预 冷刀片。
7、切片出现冰晶
主要是冷冻速度不够快捷 ，组织取材太厚 、 切片时组织温度太低 、动作力度过大等因素 造成 。因此组织取材要适中为避免组织脱 落 ，取好的组织底部及周围要及时入放适量 的 OCT,然后迅速放入冷冻机内 ,不宜过多, 否 则会影响速冻时间而产生冰晶
温度
技术员
包埋
切片 固定
染色
相互沟通理解
取材医生 技术员
诊断医生 临床医生
取材
送检组织宜新鲜、及时并避免遇水 取材器械保持干燥、清洁 组织本身含水较多则可用滤纸吸干 避免不必要的脂肪附着 通过申请单的病史及所取组织有初步认知程度
小结： 以上诸多要求，其实我们最主要的目的就是从根源上控制冰晶的 产生，因为冰晶会导致细胞间针状裂隙，细胞结构改变，细胞核普 遍增大，影响诊断准确性。
组织过冻以后照成的组织破碎，影响诊断准确性
请大家看一下这张切片是什么原因照成的？？？？？
回答对了有 香吻哦！亲
小结
总之制作一张优良的冰冻切片，诊断医生 和技术员都需要高度的责任心及相互之间 的沟通与合作，尤其是技术员在日常工作 中不断的摸索、学习和提高，练就一身过 硬的技术，尽可能一次把切片做好，更好 的为临床服务，减少病人的痛苦。
染色常见问题及对策
细胞核不清晰， 核浆染色对比度不好 应选择 合适的苏木精和伊红配方， 为了加快染色时 间， 苏木精提前配制成熟后再加温使用， 成 熟苏木精加温后染色时间1 ～ 2 min即可 ，由 于苏木精加温后容易被破坏， 应及时更换 ， 苏木精染色后应显微镜下观察， 确认细胞核 染色清晰方可进行下一步 染伊红前切片一定 要用流水冲洗干净， 否则， 伊红难着色或着 色不均匀。
固定
冰冻切片在病理快速诊断中运用广泛， 但要做好一张优良的冰冻切片并非容易，尤 其是冰冻组织固定不良会造成切片背景不清， 染色不良等问题。所以一种合适的固定液是 冰冻切片的必备条件。我院病理科产用乙醚 酒精冰醋酸苦味酸混合固定液。
染色
1 2 3
选用新鲜配置的改良Harris苏木素
苏木素加温，染色力强，但加速其氧化，需经常更换
OCT
疑似病变组织
诊断医生所取材组织
冷冻常见问题及对策
1、取材常见问题及对策
1.1取材常见问题及对策 组织被挤压:取材刀 剪必须锋利， 切割时不可来回锉动 夹取组 织时切勿猛压， 以免挤压损伤组织。 1.2组织块过大:冷冻时间延长易产生冰晶， 在不影响病理诊断的前提下， 标本取材尽量 小一些
2.组织贴附不平或有皱褶:
蓝化时选用温水，建议不使用稀氨水
4
为了提高染片效率，染色所用各梯度酒精、二甲苯需按时更换
染色
固定 苏木素 盐酸酒精 蓝化 70%AL
伊红
无水酒精1 95%AL 80%AL
无水酒精2
无水酒精3
无水酒精4
二甲苯1 封片 二甲苯2
冰晶会导致细胞间针状裂隙，细胞结构改变，细胞核普遍 增大，影响诊断准确性。
温度
组织 过硬
温度 过低
温度 过高
硬度 不够
小结：
切片 温度 组织 硬度
技术员
1 2 3
控制最佳温度是获得既薄又完整切片的基础
温度过低组织过硬导致切片破碎 温度过高硬度不够无法切片
切片
• 组织冻结后将组织连同样本托固定到冷冻头 • 上,设定切片厚度 4um。用样品快进按钮 将样品移 近刀口,调整要切的平面, 利用慢进按钮 先粗切修出 组织最完整切面后细切 1~ 2张弃用,继续细切时左 手持毛笔轻拉 O. C. T. 边缘,右手切片,双手匀速配 合。待组织切片完整拉下铺于组织样品上, （也可以使用废 片轻轻拖至切片刀刃上，右手半切组织过程中，顺势将废弃 组织与待切组织片粘连，轻轻向后拉动，当组织切到位点 以后，就形成一张完整的切片）再用常温载玻 片粘贴后迅速放入乙醚酒精混合固定液中中固定2分钟左 右。
讨论
1、冰冻固定液固定标本时间的长短对组织切片 的影响有没有?如果有，到底影响了哪些方面？ 除了适当的固定时间有无其它办法？ 2、手术过程中，局部麻醉液（利多卡因）是否 会影响冰冻切片的制作，如果有，有何办法可以 应对？ 3、组织本身的原因照成的切片模糊不清该怎么 办？例如术前的放化疗对组织的影响，或者大面 积的坏死，其周围的细胞结构影响所致的问题？
包埋
冰冻组织的包埋
包埋组织时应将组织周边多留出 O. C. T . 用于 牵引展开切片之用,否则出刀、 入刀处会有皱褶影响 制片效果。O. C. T . 中的小气泡应尽量去除, 以免影 响旁边组织产生挤压和皱褶。较小的组织在包埋时 可以先制作一个 O. C. T . 冻托, 待冻托基本凝固时, 将组织放在冻托上,再在周围放上 O. C. T . 后速冻。 囊壁类组织需要立埋时, 可将几条囊壁紧靠一起卷 成 U字形,可以帮助囊壁更好保持侧立。OCT的放置 不宜过多，太多了影响速冻时间产生冰晶。