试验2纸色谱分离几种氨基酸

实验五纸色谱和柱色谱

[实验目的]

1. 掌握纸色谱的基本原理及其用途。

2.学习柱色谱的基本原理及其用途，熟练掌握柱色谱的操作方法

[实验原理]

一、纸色谱

纸色谱是以滤纸作为载体，让样品溶液在纸上展开达到分离的目的。纸色谱法的原理比较复杂，主要是分配过程，纸色谱的溶剂是由有机溶剂和水组成的，在滤纸的一定部位点上样品，当有机相沿滤纸流动经过原点时，即在滤纸上的水与流动相间连续发生多次分配，结果在流动相中具有较大溶解度的物质随溶剂移动的速度较快，而在水中溶解度较大的物质随溶剂移动的速度较慢，这样便能把混合物分开。

二、柱色谱

吸附柱色谱通常是在下端带有活塞的玻璃管（色谱柱）中填入固体吸附剂，从柱顶加入混合物样品溶液，各组分被吸附在柱的上端，然后连续加入洗脱剂，样品在吸附剂上反复地进行着吸附－解吸－再吸附－再解吸的过程，吸附时则停顿，解吸时则随着洗脱剂向下移动。由于各组分对于吸附剂的作用能力不同，向下移动的速度也不同，作用能力强的向下移动的慢，作用能力弱的移动的快，随着洗脱过程的不断进行，各组分便得到了分离。

[实验装置]

图1 纸色谱图2 纸色谱滤纸条点样图3柱色谱装置

1.层析缸

2.滤纸

3.展开剂

[课前预习]

柱色谱、纸色谱

[实验步骤]

一、纸色谱分离几种氨基酸

本实验以饱和水的正丁醇溶液作展开剂，通过实验测出丙氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸的R f值，并分析测定未知试样的成分或组成。

1．滤纸的选择

滤纸的质量应厚薄均匀，能吸附一定量的水，可用新华1号，切成纸条，大小可自由选择，一般为3×20cm，5×30cm，8×50cm等。滤纸用前应经过试验，观察分离效果，色点边界清晰为好。

2．配置展开剂

正丁醇：水：乙酸=4∶5∶1（体积比）按他们用量比例，先将正丁醇与水在分液漏斗中一起振摇10～15分钟，然后加乙酸再振荡。静置分层，下层弃去，上层作为展开剂，将展开剂倒入层析缸内盖上盖，放置0.5小时，使缸内形成饱和蒸气。

3．显色剂

95份正丁醇及5份（体积比）2mol•L-1的CH3COOH混合作为溶剂，加入茚三酮配成0.1%的溶液。

4．取5×30cm的滤纸一张，在距离一端2cm处用铅笔轻划一直线，在直线上用铅笔轻轻地划4个“×”号，并注上号码1，2，3……，在各点上用毛细管（管口要齐）分别点上谷氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸已知样，在第四点上，点上未知样，每加一点样品就用吹风机以温热的风吹干，每个样品点三次。

将层析液倒在一培养皿中（约1～1.5cm深），先将点好样的滤纸上端夹在支架上，下端放在皿的外边（不要与溶剂接触），盖上层析缸盖。10分钟后，滤纸吸附蒸汽达到平衡，用夹子将滤纸下端迅速放入皿中，溶液因毛细现象逐渐向上渗透扩散，当前沿距样15cm左右处停止展析，取出滤纸，用铅笔划出溶剂前沿线。晾干，喷上显色剂到刚好润湿滤纸，用吹风机吹干，并在85～90℃烘干，则显出紫红色斑点。

（1）计算已知样和未知样各点的R f值。

（2）根据已知样和未知样各点的R f值。做定性分析。

二、柱色谱法分离偶氮苯与邻-硝基苯胺

本实验是以小型层析柱分离偶氮苯与邻-硝基苯胺的少量混合溶液。

所用主要仪器及药品为：

层析柱：长25cm，内径1cm

吸附剂：市售中性氧化铝（100目，Ⅱ～Ⅲ级）10g。

淋洗剂：①1,2-二氯乙烷与环己烷等体积混合液80～100mL，②95%乙醇（备用）。

待分离混合样：1%偶氮苯的1,2-二氯乙烷溶液与1%邻-硝基苯胺的1,2-二氯乙烷溶液的等体积混合液约1mL。

（1）湿法装柱：将洗净晾干的层析柱中注入约为柱容积1/4的淋洗剂。将淋湿的一小团脱脂棉推入柱底狭窄部位（勿挤压太紧），上面加盖一张直径略小于柱内径的滤纸片。将10g中性氧化铝在小烧杯中用淋洗剂调成悬浊状。打开柱下活塞调节流速约1滴/秒，将制成的悬浊液在自柱顶注入，可敲击柱身以使吸附剂沉积均匀。在此过程中应始终保持吸附剂沉积层上面有一段液柱。吸附剂加完后关闭活塞，将一块滤纸片盖在吸附剂沉积面上。

（2）加样：打开柱下活塞放出柱中液体，待液面降至滤纸片时关闭活塞，将1mL待分离的混合样液沿柱内壁加入。打开活塞，待样液液面至滤纸片时关闭活塞。用干净滴管吸取淋洗剂约0.3mL沿加样处冲洗柱内壁。再打开活塞将液面降至滤纸处。依上法重复操作直至柱壁和顶部的淋洗剂均无颜色。

（3）淋洗和接收：加入大量淋洗剂，打开柱下活塞，控制流出速度为1滴/秒。观察柱中色带下行情况。随着色带向下行进逐渐分为两个色带，下方的为橙红或橙黄色，上方为亮黄或微带草绿色，中间为空白带。当前一色带到达柱底时更换接收瓶接收（在此之前接收的无色淋洗剂可重复使用）。当第一色带接收完后更换接收瓶接收空白带，当空白带按完后再

换接收瓶接收第二色带。

[注释]

1. 比移值（R f ）表示物质移动的相对距离。

R f = 溶液移动的距离

溶质移动的距离 例如： R f （化合物A ）= 12cm

3.0cm = 0.25 各种物质的R f 随要分离化合物的结构、滤纸的种类、溶剂、温度等不同而异。

2. 柱色谱在接受色带时， 如果两色带间的空白带较宽，在第一色带到柱底时可改用95%乙

醇淋洗，以加速色带下行。若空白带较窄，甚至中间为交叉带，则不可用乙醇淋洗，否则将会使后一色带追上前一色带，造成混淆。

[思考题]

1. 柱色谱操作中，如何选择洗脱剂？

2. 都有哪些分离提纯有机化和物的方法？