水稻籼粳交DH群体的构建及其基因型偏态分离分析

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2008,16(2):315~319
*基金项目： 国家高技术研究与发展计划 （863） 项目 （No.2006AA10Z1B5）、 浙江省自然科学基金 （No.Y305160） 和中国水稻研究所青年创新基金资助。

**通讯作者。

Author for correspondence.研究员， 硕士生导师， 主要从事水稻新品种选育及生物技术研究。

Tel:0571­63370367;E­mail:<yangchangdeng@>. 收稿日期：
2007­08­26 接受日期：
2007­10­17 ·研究论文
· 水稻籼粳交 DH 群体的构建及其基因型偏态分离分析 *
季芝娟 1 , 叶胜海 1,2 , 马良勇 1 , 李西明 1
, 王晓光 1 , 蔡 晶 1 , 别文力 3 ,杨长登 1 ** (1.中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室， 杭州 310006； 2.浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所， 杭州 310021；
3.长江大学农学院，荆州 430025)
摘要： 对籼 （ L. ） 粳 （ L.ssp. ） 杂交组合中花11 （粳） /中组 14 （籼
） F1进行花药培养， 共 获得112个加倍单倍体 （DH ） 再生植株。

利用亲本间多态性SSR 分子标记对该DH 群体再生植株进行纯合性鉴定， 并分析该群 体的基因型偏离情况。

选用22个多态性SSR 标记分析的结果表明， 所得再生植株都来自花粉母细胞的纯合植株， 不存在来自 体细胞的杂合株，
确保了DH 群体的准确性。

带型分析结果显示， 该群体未发生异常的基因型偏态分离。

因此在组织培养体系 中引进 SSR 标记， 可以快速而准确地构建DH 群体， 基因型的偏态分离分析保证了群体的质量。

关键词： 水稻； DH 群体； SSR 标记； 纯合； 基因型； 偏态分离 中图分类号: S188 文献标识码:A
文章编号: 1006­1304(2008)02­0315­05
Construction and Distorted­segregation Analysis in Genotype
of DH Population from ­ Cross
JI Zhi­juan 1 ,YE Sheng­hai 1,2 ,MA Liang­yong 1 ,LI Xi­ming 1 ,WANG Xiao­guang 1 ,CAI Jin 1
,
BIE Wen­li 3 ,YANG Chang­deng 1
**
F 1 anther of Zhonghua 11/Zhongzu 14（ ）
combination was cultured and one hundred and twelve double haploid (DH)regenerant plants were obtained.All of the DH plants were analysed for their homozygosity using 22polymorphic SSR markers between the two parents.Distorted segregation analysis in genotype for the population was carried out.Polymorphic SSR analysis suggested that the regenerant plants were all originated from microspore and no heterozygots from somatic cells.Band pattern analysis with polymorphic SSRs showed that there was no abnormal distribution in genotype for the population. The results indicated that the DH population consisted accurately of microspore­originated regenerants and quality of the population was guaranteed via distorted segregation analysis in genotype with SSR
markers.
rice;DH population;SSR markers;homozygous;genotype;distorted segregation
水稻 （ L.） 花药培养是当今生物技 术中较为成熟、
实用和有效的育种新技术， 应用花药 培养构建加倍单倍体 （doubled haploid ， DH ） 群体， 构 建速度快， 可一次性形成基本群体。

籼稻和粳稻是水 稻的两个亚种，具有较远的亲缘关系，但无杂交障 碍，因此籼粳交 F 1 是建立 DH 群体的理想材料。

Guiderdini . （
1991）从热带粳稻 IRT177 和籼稻 Apura 之间的 F 1 经花培建立了样本容量为 90 个株
系的 DH 群体， 并对其稳定性进行了分析， 发现一些 同工酶在该群体中存在着严重的偏态，并认为是籼
粳交 “杂种不育崩溃” 所致。

陈 英等 （1997） 对籼稻 品种窄叶青 8 号与粳稻品种京系 17 杂交 F 1 花培产
农 业 生 物 技 术 学 报 2008年
生的 DH群体作了遗传稳定性分析，发现该群体的 一些农艺性状表现显著的分离。

DH群体的异常分 离将影响性状的遗传与基因定位研究结果。

在 DH群体构建过程中，花培后代仍有约 14%的杂合植株 （李竹英等， 1995）， 这些杂合植株出现性 状分离， 一般来说， 还需自交 5代， 从而达不到快速 构建 DH群体的目的 （程式华等， 2001）， 另外如果将 这些杂合植株当作 DH群体应用于基因图谱的研 究， 势必影响基因定位及后续工作的准确性。

因此在 水稻 DH群体构建时，如何在早期鉴定花培再生植 株的纯合性， 成为一个亟待解决的问题。

基于 PCR的微卫星标记 （简单序列重复， simple sequence repeat， SSR） 是一种 STS标记， 它分 析简单， 多态性高， 是分子作图的一种高效的分子标 记。

SSR为共显性标记， 即杂合位点的 2个等位基因 都可得到表现。

如果在离体培养供体植株中 SSR多 态性标记表现为亲本之一的带型而非 F 1杂合带型， 则可用确定其为纯合的再生植株（Eduard .， 2000）。

因此， 在 DH群体构建中， 将 SSR标记引入 水稻花药培养体系，可以准确快捷地鉴定再生植株 的纯合性，并且可分析再生群体基因型的偏态分离 情况， 不仅提高 DH群体构建的速度和准确性， 保证 群体的质量， 而且扩展了分子标记的应用领域。

本研究在水稻花药培养早期，通过分子标记方 法， 快速准确地鉴定花培二倍体再生植株的纯合性， 确保 DH群体来源的准确性；并且分析群体基因型 的偏态分离情况， 从而快速准确地构建 DH群体。

1材料和方法
1.1 亲本及花药培养
选用本课题组选育的优质多抗籼稻（
L.ssp.） 新品种中组 14（P2） 和粳稻(
L.ssp.） 花培品种中花 11（P1） 为亲 本，配制中花 11/中组 14籼粳杂交组合； F1代进行 花药培养， 获得再生绿苗； 剔除单倍体和多倍体， 得 到二倍体再生植株。

花药培养：在水稻的孕穗期取处于单核靠边期 的水稻幼穗， 用 70%酒精表面消毒， 并用湿纱布包 裹，置于 7～8 ℃低温预处理 3d。

整穗后用 10% NaClO消毒 10～15min， 再于超净工作台上用无菌 水冲洗 3～4次，用剪颖法将花药接种于短瓶中， 每 短瓶接种花药 200枚左右，共接种约 40000枚花 药。

诱导培养基为 M8培养基 （+2mg/L NAA+ 6­BA0.5mg/L），分化培养基为 MS（+NAA0.5 mg/L+KT2mg/L），脱分化在 26～27 ℃暗培养
30~40d，愈伤组织长至直径 2~3mm后转移到 MS 分化培养基上，并置于光照培养室，温度为 26~27 ℃， 光照 14h/d， 光照强度为 2000lx。

约 20d后， 绿 苗转入壮苗培养基， 适当修剪过长的叶子， 以减少蒸 发。

待苗长壮， 可揭瓶盖并加少许水进行放置室温下 进行练苗 2~3d， 再移植入大田。

1.2DNA 的提取及 SSR 多态性标记的筛选
取二倍体再生植株新鲜叶片， 参照 CTAB方法 （进行部分修改） 提取 DNA， 在上清析出 DNA沉淀 时用异丙醇而非 100%的酒精。

利用 PCR法在 12条 染色体随机选取若干 SSR标记筛选亲本中组 14和 中花 11间的多态性标记， 用于再生植株纯合性和基 因型分析。

PCR扩增反应按下列程序进行： 94 ℃预 变性 4min， 94 ℃变性 1min， 55 ℃复性 1min， 72 ℃延伸 1min， 共 35个循环， 最后 72 ℃延伸 12min。

将 PCR产物在浓度为 5%的琼脂糖凝胶板上电泳 （电压 170V）， 检测 PCR产物的多态性。

1.3 纯合性鉴定及基因型偏态分离分析
利用筛选得到的多态性分子标记，鉴定二倍体 再生植株的纯合性；所得结果用于分析群体的基因 型分离情况。

各再生植株的母本带数与父本（中组 14） 和母本 （中花 11） 带数的总和之比， 为该植株的 母本带型比值；再生植株的父本带数与父本和母本 带数的总和之比则为该植株的父本带型比值。

2结果和分析
2.1 花培二倍体再生植株的获得
对中花 11/中组 14组合 F1进行花药培养， 共 获得 748块愈伤组织；分化培养得到 154丛再生绿 苗。

因此， 该组合花药培养出愈率为 1.72%， 绿苗分 化率为 20.59%。

根据外部形态特征， 调查花培再生植株的倍性。

单倍体植株矮小， 叶片窄而短， 叶耳、 叶舌不明显， 颖 花小， 几乎不结实。

多倍体植株粗壮、 叶宽、 颖花大、 颖尖多有芒和结实率很低。

剔除单倍体和多倍体植 株后，共有 112株二倍体再生植株，二倍体率为 72.73%。

2.2SSR 多态性标记的筛选
随机挑选了 228个 SSR标记筛选两亲本间的 多态性标记， 获得 48个带型清晰、 在两亲本间表现 多态的 SSR标记分别为 ： RM523、 RM5480、 RM5928、RM6266、RM3199、RM3280、RM307、 RM430、RM7434、RM1132、RM8261、RM3404、 RM3555、RM331、RM337、RM6976、RM1345、 RM3376、 RM107、 RM7048、 RM257、 RM474、
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第 2期 季芝娟等：水稻籼粳交 DH 群体的构建及其基因型偏态分离分析
RM311、 RM271、 RM286、 RM1812、 RM206、 RM247、RM1022、RM6080、RM3684、RM1235、 RM242、RM7000、RM248、RM1959、RM6349、 RM3627、RM5481、RM427、RM3826、RM278、 RM444、RM1124、RM5551、RM145、RM5628 和 RM234， 48 个多态性 SSR 标记在两亲本之间的表 现依次如图 1 所示。

因此，多态性标记检出率为
20.18%。

2.3 二倍体再生植株的纯合性鉴定
鉴定再生植株纯合性的 SSR 多态性标记为所
得多态性标记中随机挑取，每条染色体 1~2 个， 共
22 个。

二倍体再生植株纯合性的多态性标记鉴定结 果表明，
112 株二倍体再生植株带型都为母本或父 本的带型， 即为来自花粉细胞分化所得的再生植株， 纯合率达 100%。

图 2 为 SSR 引物 RM1345 对该群 体部分二倍体再生植株纯合性的分析图。

2.4 群体基因型的偏态分离分析
对每株再生植株的 22 个 SSR 标记分析所得的
两种亲本带型统计分析， 结果如图 3 所示。

112 株中 有 61.9%再生植株母本带型比值达 0.5 以上；个别
再生植株两亲本比值总和未达到 1，是因为有个别 引物扩增后电泳图中带型不清晰而标为 0 带型之
故。

分析群体的母本带型比值分布变化趋势， 结果如 图 4 所示。

母本带型比值基本上呈正态型的连续分 布， 略有偏母本基因型的趋势， 但以中间类型最多， 典型的父本带型和母本带型较少。

对 22 个多态性标 记在 112 个植株中的带型分离比例进行卡平方测 验，发现第 10 染色体上的 3 个标记和第 11 染色体 上 3 个标记不符合 1颐 1 的分离比例。

这可能和该群 体的偏态分离发生在染色体的某一区段有关，但该 群体基因型偏态分离不严重，可以用于后续的图谱 构建和基因定位研究等工作。

3 讨论
通过水稻花药培养得到的 DH 群体在基因图谱
研究中得到广泛的应用。

有关水稻籼粳两个亚种丰
图 1.SSR 引物在两亲本间的多态性分布
Fig.1.Analysis of polymorphic markers between the two parents
M,Marker (SD002);1and 2,RM523;3and 4,RM5480;5and 6,RM5928;7and 8,RM6266;9and 10,RM3199;11and 12,RM3280;13and 14,RM307; 15and 16,RM430;17and 18,RM7434;19and 20,RM1132;21and 22,RM8261;23and 24,RM3404;25and 26,RM3555;27and 28,RM331;29and 30,RM337;31and 32,RM6976;33and 34,RM1345;35and 36,RM3376;37and 38,RM107;39and 40,RM7048;41and 42,RM257;43and 44, RM474;45and 46,RM311;47and 48,RM271;49and 50,RM286;51and 52,RM1812;53and 54,RM206;55and 56,RM247;57and 58,RM1022;59 and 60,RM6080;61and 62,RM3684;63and 64,RM1235;65and 66,RM242;67and 68,RM7000;69and 70,RM248;71and 72,RM1959;73and 74, RM6349;75and 76,RM3627;77and 78,RM5481;79and 80,RM427;81and 82,RM3826;83and 84,RM278;85and 86,RM444;87and 88,RM1124;
89and 90,RM5551;91and 92,RM145;93and 94,RM5628;95and 96,RM234.
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年
图 2.SSR引物 RM1345对群体部分二倍体再生植株的纯合性分析
Fig.2.Analysis of homozygosity of parts of the DH population using primer RM1345
1,母本； 2,父本； 3~37,二倍体再生植株。

1,female parent;2,male parent;3~37,diploid regenerant plants.
富的基因组信息都在网上释放， 并且日益丰富， 为分 子遗传图谱的构建提供了切实的基础。

图谱构建初 期筛选的多态性分子标记用于花培后代纯合个体的 分子鉴定和群体基因型偏态分离分析，可以保证群 体的准确建立和图谱的构建。

花药培养存在着配子选择问题。

一般认为籼、 粳 交群体是随机分离的,但在培养过程中， 受培养基的 选择， 很难保证籼、 粳基因的随机分离和配子的随机 成活。

程式华等 （2001） 用形态指数法和 RFLP分子 标记法分析比较了 DH群体和 RIL群体的籼粳分化 分离情况， 利用形态指数需要考察田间农艺性状， 工 作量大且易产生误差；而 RFLP技术自身存在技术 繁琐、 多态性低等缺点， 相比之下，SSR技术简便、 快速、成本低。

本研究基因型偏态分离分析结果表 明， 该群体基因型基本上呈正态型的连续分布， 分析 结果保证了群体的质量；其中分布图中略有偏母本
图 3.DH群体 112份再生植株基因型分离的 SSR分析
Fig.3.Segregation analysis in genotype of the DH population
图 4.DH群体 SSR标记母本带型比值分布变
化图
Fig.4.Distribution of female parent band ratio for
SSR in the DH population
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参 考 文 献
Chen Y(陈英),Lu M F(陆明福),He P(何平),Shen L S(沈利 爽),XU J C(徐吉臣),Xu Y B(徐云碧)and Zhu L H(朱立 煌).Gametic selection in a doubled haploid population de­ rived from anther culture of cross of rice(J).
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Chen Y,Hausner G,Kenaschuk E,Procunier D,Dribnenki P and Penner G.Identification of microspore­derived plants in anther culture of flax( L.)using molecu­ lar markers(J). ,1998,18:44~48
Cheng S H(程式华),Mao C Z(毛传澡),Zhan X D(占小登),Si
H M(斯华敏)and Sun Z X(孙宗修).Construction of double
haploid(DH)and recombinant inbred line(RIL)population of hybrid and their differential in and property(J). (中国 水稻科学),2001,15(4):257~260(in Chinese with English abstract)
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基因型的趋势， 可能与母本为粳稻， 而粳稻通常较籼 稻花培力高有关。

有关利用分子标记鉴定花培后代植株的纯合性 在其它作物中已有报道。

Richard .（1995） 用 RAPD和 SSR两种方法分析了马铃薯花药培养后 代的纯合性。

共筛选了 7个 SSR标记， 其中 5个表 现为多态， 用 5个多态性 SSR标记， 分析 14个花培 再生植株的纯合性， 结果 5株为纯合植株， 9株为杂 合株。

Eduard .（2000） 进一步验证了 SSR对马铃 薯花培再生绿苗纯合度分析的可行性，增加了 3个 多态性标记后，从 210株再生株中筛选出 196株杂 合植株， 并且发现引物对 ST15+16的 SSR标记在所 有杂合植株中都为杂合态，从而得出可用它分析未 知二倍体再生植株的纯合性的结论。

用 SSR标记分 析花培再生植株纯合性还在亚麻 （Chen， 1998）、 大豆 （Lia .， 2004） 等作物中有报道。

但未 见在水稻花药培养中的运用。

本研究利用 SSR标记的共显性特征， 分析了花 培再生群体的纯合性及其基因型偏态分离情况。

从 分子角度鉴定水稻花培再生群体的纯合性，避免了 通过表型性状鉴定假纯合植株的盲目性，从根本上 保证了 DH群体的纯合性；而基因型的偏态分离分 析表明该群体偏母本基因型，但未发生异常的偏态 分离， 保证了群体的质量， 为进一步的遗传图谱的构 建、 基因定位以及水稻育种利用提供基本材料， 具有 广阔的应用前景。

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