水稻籼粳交DH群体的构建及其基因型偏态分离分析

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2008,16(2):315~319

*基金项目： 国家高技术研究与发展计划 （863） 项目 （No.2006AA10Z1B5）、 浙江省自然科学基金 （No.Y305160） 和中国水稻研究所青年创新基金资助。

**通讯作者。Author for correspondence.研究员， 硕士生导师， 主要从事水稻新品种选育及生物技术研究。 Tel:0571­63370367;E­mail:. 收稿日期：

2007­08­26 接受日期：

2007­10­17 ·研究论文

· 水稻籼粳交 DH 群体的构建及其基因型偏态分离分析 *

季芝娟 1 , 叶胜海 1,2 , 马良勇 1 , 李西明 1

, 王晓光 1 , 蔡 晶 1 , 别文力 3 ,杨长登 1 ** (1.中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室， 杭州 310006； 2.浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所， 杭州 310021；

3.长江大学农学院，荆州 430025)

摘要： 对籼 （ L. ） 粳 （ L.ssp. ） 杂交组合中花11 （粳） /中组 14 （籼

） F1进行花药培养， 共 获得112个加倍单倍体 （DH ） 再生植株。 利用亲本间多态性SSR 分子标记对该DH 群体再生植株进行纯合性鉴定， 并分析该群 体的基因型偏离情况。选用22个多态性SSR 标记分析的结果表明， 所得再生植株都来自花粉母细胞的纯合植株， 不存在来自 体细胞的杂合株，

确保了DH 群体的准确性。带型分析结果显示， 该群体未发生异常的基因型偏态分离。因此在组织培养体系 中引进 SSR 标记， 可以快速而准确地构建DH 群体， 基因型的偏态分离分析保证了群体的质量。

关键词： 水稻； DH 群体； SSR 标记； 纯合； 基因型； 偏态分离 中图分类号: S188 文献标识码:A

文章编号: 1006­1304(2008)02­0315­05

Construction and Distorted­segregation Analysis in Genotype

of DH Population from ­ Cross

JI Zhi­juan 1 ,YE Sheng­hai 1,2 ,MA Liang­yong 1 ,LI Xi­ming 1 ,WANG Xiao­guang 1 ,CAI Jin 1

,

BIE Wen­li 3 ,YANG Chang­deng 1

**

F 1 anther of Zhonghua 11/Zhongzu 14（ ）

combination was cultured and one hundred and twelve double haploid (DH)regenerant plants were obtained.All of the DH plants were analysed for their homozygosity using 22polymorphic SSR markers between the two parents.Distorted segregation analysis in genotype for the population was carried out.Polymorphic SSR analysis suggested that the regenerant plants were all originated from microspore and no heterozygots from somatic cells.Band pattern analysis with polymorphic SSRs showed that there was no abnormal distribution in genotype for the population. The results indicated that the DH population consisted accurately of microspore­originated regenerants and quality of the population was guaranteed via distorted segregation analysis in genotype with SSR

markers.

rice;DH population;SSR markers;homozygous;genotype;distorted segregation

水稻 （ L.） 花药培养是当今生物技 术中较为成熟、

实用和有效的育种新技术， 应用花药 培养构建加倍单倍体 （doubled haploid ， DH ） 群体， 构 建速度快， 可一次性形成基本群体。 籼稻和粳稻是水 稻的两个亚种，具有较远的亲缘关系，但无杂交障 碍，因此籼粳交 F 1 是建立 DH 群体的理想材料。

Guiderdini . （

1991）从热带粳稻 IRT177 和籼稻 Apura 之间的 F 1 经花培建立了样本容量为 90 个株

系的 DH 群体， 并对其稳定性进行了分析， 发现一些 同工酶在该群体中存在着严重的偏态，并认为是籼

粳交 “杂种不育崩溃” 所致。陈 英等 （1997） 对籼稻 品种窄叶青 8 号与粳稻品种京系 17 杂交 F 1 花培产

农 业 生 物 技 术 学 报 2008年

生的 DH群体作了遗传稳定性分析，发现该群体的 一些农艺性状表现显著的分离。DH群体的异常分 离将影响性状的遗传与基因定位研究结果。

在 DH群体构建过程中，花培后代仍有约 14%的杂合植株 （李竹英等， 1995）， 这些杂合植株出现性 状分离， 一般来说， 还需自交 5代， 从而达不到快速 构建 DH群体的目的 （程式华等， 2001）， 另外如果将 这些杂合植株当作 DH群体应用于基因图谱的研 究， 势必影响基因定位及后续工作的准确性。 因此在 水稻 DH群体构建时，如何在早期鉴定花培再生植 株的纯合性， 成为一个亟待解决的问题。

基于 PCR的微卫星标记 （简单序列重复， simple sequence repeat， SSR） 是一种 STS标记， 它分 析简单， 多态性高， 是分子作图的一种高效的分子标 记。 SSR为共显性标记， 即杂合位点的 2个等位基因 都可得到表现。如果在离体培养供体植株中 SSR多 态性标记表现为亲本之一的带型而非 F 1杂合带型， 则可用确定其为纯合的再生植株（Eduard .， 2000）。因此， 在 DH群体构建中， 将 SSR标记引入 水稻花药培养体系，可以准确快捷地鉴定再生植株 的纯合性，并且可分析再生群体基因型的偏态分离 情况， 不仅提高 DH群体构建的速度和准确性， 保证 群体的质量， 而且扩展了分子标记的应用领域。

本研究在水稻花药培养早期，通过分子标记方 法， 快速准确地鉴定花培二倍体再生植株的纯合性， 确保 DH群体来源的准确性；并且分析群体基因型 的偏态分离情况， 从而快速准确地构建 DH群体。

1材料和方法

1.1 亲本及花药培养

选用本课题组选育的优质多抗籼稻（

L.ssp.） 新品种中组 14（P2） 和粳稻(

L.ssp.） 花培品种中花 11（P1） 为亲 本，配制中花 11/中组 14籼粳杂交组合； F1代进行 花药培养， 获得再生绿苗； 剔除单倍体和多倍体， 得 到二倍体再生植株。

花药培养：在水稻的孕穗期取处于单核靠边期 的水稻幼穗， 用 70%酒精表面消毒， 并用湿纱布包 裹，置于 7～8 ℃低温预处理 3d。整穗后用 10% NaClO消毒 10～15min， 再于超净工作台上用无菌 水冲洗 3～4次，用剪颖法将花药接种于短瓶中， 每 短瓶接种花药 200枚左右，共接种约 40000枚花 药。诱导培养基为 M8培养基 （+2mg/L NAA+ 6­BA0.5mg/L），分化培养基为 MS（+NAA0.5 mg/L+KT2mg/L），脱分化在 26～27 ℃暗培养

30~40d，愈伤组织长至直径 2~3mm后转移到 MS 分化培养基上，并置于光照培养室，温度为 26~27 ℃， 光照 14h/d， 光照强度为 2000lx。约 20d后， 绿 苗转入壮苗培养基， 适当修剪过长的叶子， 以减少蒸 发。 待苗长壮， 可揭瓶盖并加少许水进行放置室温下 进行练苗 2~3d， 再移植入大田。

1.2DNA 的提取及 SSR 多态性标记的筛选

取二倍体再生植株新鲜叶片， 参照 CTAB方法 （进行部分修改） 提取 DNA， 在上清析出 DNA沉淀 时用异丙醇而非 100%的酒精。 利用 PCR法在 12条 染色体随机选取若干 SSR标记筛选亲本中组 14和 中花 11间的多态性标记， 用于再生植株纯合性和基 因型分析。PCR扩增反应按下列程序进行： 94 ℃预 变性 4min， 94 ℃变性 1min， 55 ℃复性 1min， 72 ℃延伸 1min， 共 35个循环， 最后 72 ℃延伸 12min。 将 PCR产物在浓度为 5%的琼脂糖凝胶板上电泳 （电压 170V）， 检测 PCR产物的多态性。

1.3 纯合性鉴定及基因型偏态分离分析

利用筛选得到的多态性分子标记，鉴定二倍体 再生植株的纯合性；所得结果用于分析群体的基因 型分离情况。各再生植株的母本带数与父本（中组 14） 和母本 （中花 11） 带数的总和之比， 为该植株的 母本带型比值；再生植株的父本带数与父本和母本 带数的总和之比则为该植株的父本带型比值。

2结果和分析

2.1 花培二倍体再生植株的获得

对中花 11/中组 14组合 F1进行花药培养， 共 获得 748块愈伤组织；分化培养得到 154丛再生绿 苗。因此， 该组合花药培养出愈率为 1.72%， 绿苗分 化率为 20.59%。

根据外部形态特征， 调查花培再生植株的倍性。 单倍体植株矮小， 叶片窄而短， 叶耳、 叶舌不明显， 颖 花小， 几乎不结实。多倍体植株粗壮、 叶宽、 颖花大、 颖尖多有芒和结实率很低。剔除单倍体和多倍体植 株后，共有 112株二倍体再生植株，二倍体率为 72.73%。

2.2SSR 多态性标记的筛选

随机挑选了 228个 SSR标记筛选两亲本间的 多态性标记， 获得 48个带型清晰、 在两亲本间表现 多态的 SSR标记分别为 ： RM523、 RM5480、 RM5928、RM6266、RM3199、RM3280、RM307、 RM430、RM7434、RM1132、RM8261、RM3404、 RM3555、RM331、RM337、RM6976、RM1345、 RM3376、 RM107、 RM7048、 RM257、 RM474、

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