溶菌酶综合型实验报告(很全面很详细)
溶菌酶实验报告讨论
溶菌酶实验报告讨论溶菌酶实验报告讨论引言:溶菌酶是一种广泛存在于细菌和其他生物体中的酶类物质。
它具有破坏细菌细胞壁的作用,从而导致细菌的溶解。
溶菌酶在医学、食品工业和生物技术等领域具有重要的应用价值。
本实验旨在通过观察溶菌酶对细菌的作用,探讨其在抗菌领域的潜力。
实验方法:1. 实验材料准备:- 溶菌酶溶液- 青霉素溶液- 培养基- 大肠杆菌培养物2. 实验步骤:a. 在培养基上均匀涂布大肠杆菌培养物。
b. 在培养基上划分两个区域,一个区域加入溶菌酶溶液,另一个区域加入青霉素溶液。
c. 将培养皿放入恒温培养箱中,以37摄氏度培养24小时。
d. 观察培养皿上菌落的变化。
实验结果:经过24小时的培养,我们观察到以下结果:- 溶菌酶作用区域:在溶菌酶作用区域,我们发现大肠杆菌培养物的菌落明显减少,甚至完全消失。
这表明溶菌酶对大肠杆菌具有明显的抑制作用。
- 青霉素作用区域:在青霉素作用区域,我们观察到大肠杆菌培养物的菌落没有明显的减少。
这说明青霉素对大肠杆菌的抑制作用相对较弱。
讨论:1. 溶菌酶的抗菌机制:溶菌酶通过破坏细菌细胞壁的作用,导致细菌的溶解。
细菌细胞壁主要由肽聚糖和肽聚肌醇组成,溶菌酶能够水解肽聚糖,破坏细菌细胞壁的完整性,从而导致细菌的死亡。
2. 溶菌酶与青霉素的比较:溶菌酶和青霉素都具有抑菌作用,但两者的作用机制不同。
溶菌酶通过破坏细菌细胞壁来抑制细菌生长,而青霉素则是通过抑制细菌的细胞壁合成来发挥抗菌作用。
实验结果显示,溶菌酶对大肠杆菌的抑制作用更明显,这可能与大肠杆菌细胞壁的结构特点有关。
3. 溶菌酶的应用前景:溶菌酶具有广泛的应用前景。
在医学领域,溶菌酶可以用于治疗细菌感染,特别是对于那些对抗生素耐药的细菌感染具有重要意义。
在食品工业中,溶菌酶可以用于食品的保鲜和防腐,有效地抑制细菌的生长。
此外,溶菌酶还可以应用于生物技术领域,用于细菌的基因工程和表达调控等方面。
结论:本实验结果表明溶菌酶对大肠杆菌具有明显的抑制作用,其抗菌机制主要通过破坏细菌细胞壁实现。
溶菌酶实验 实验报告 第七组
溶菌酶的提取和系列性质测定实验报告学院:生物科学与工程学院班级:姓名:学号:组别:第七组组员:一、实验内容:溶菌酶的提取和系列性质测定在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。
酶的提纯工作往往要求多种方法交替应用,才能得到较为满意的效果。
常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活,为能获得尽可能高的产率和纯度,在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等,这样才能收到较好的分离提纯效果。
溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G,是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合,与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐,使病毒失活。
溶菌酶相对分子质量约为1.44×104,是一种强碱性蛋白质,等电点在10.0以上,并对温度和酸不敏感。
在自然界中,普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中,哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中,植物卷心菜、萝卜、木瓜等,以蛋清含量最丰富,约为0.3%。
本实验用鸡蛋为原理,通过阳离子交换层析,硫酸铵沉淀,分子筛层析等步骤提取溶菌酶。
二、实验原理:1蛋白质提取分离技术以蛋白质和结构与功能为基础,从分子水平上认识生命现象,已经成为现代生物学发展的主要方向,研究蛋白质,首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识,但基本原理不外乎两方面。
一是得用混合物中几个组分分配率的差别,把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中,如盐析,有机溶剂提取,层析和结晶等;二是将混合物置于单一物相中,通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的,如电泳,超速离心,超滤等。
小肠细菌溶菌酶实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 探究小肠细菌溶菌酶对细菌细胞壁的溶解作用。
2. 了解溶菌酶在不同浓度下的活性变化。
3. 分析溶菌酶在不同细菌细胞壁上的溶解效果。
二、实验原理溶菌酶是一种能够特异性地作用于细菌细胞壁的酶,它能够水解细胞壁中的肽聚糖,从而破坏细菌的细胞壁结构,导致细菌溶解。
本实验通过观察不同浓度的溶菌酶对细菌细胞壁的溶解效果,来评估溶菌酶的活性。
三、实验材料与仪器材料:1. 小肠细菌培养液2. 溶菌酶原液3. 0.9%生理盐水4. 脱脂奶粉5. 96孔板6. 酶标仪7. 移液器8. 离心机仪器:1. 电子天平2. 酶标仪3. 移液器4. 离心机5. 显微镜四、实验方法1. 细菌培养:将小肠细菌接种于LB培养基中,37℃培养24小时,制成菌悬液。
2. 溶菌酶稀释:将溶菌酶原液用生理盐水进行梯度稀释,设置不同浓度梯度。
3. 溶菌实验:取96孔板,每孔加入100μl菌悬液,再分别加入不同浓度的溶菌酶溶液,对照组加入等量生理盐水。
将96孔板置于37℃恒温培养箱中培养。
4. 检测:每隔一段时间,用酶标仪检测各孔的吸光度值,记录实验结果。
5. 结果分析:根据吸光度值,绘制溶菌酶活性曲线,分析溶菌酶的活性变化。
五、实验结果1. 溶菌酶活性曲线:随着溶菌酶浓度的增加,细菌的吸光度值逐渐降低,表明溶菌酶对细菌细胞壁的溶解作用增强。
2. 不同细菌细胞壁的溶解效果:实验结果显示,溶菌酶对不同细菌细胞壁的溶解效果存在差异,其中对革兰氏阳性菌的溶解效果较好,对革兰氏阴性菌的溶解效果较差。
六、讨论与分析1. 溶菌酶活性:本实验结果表明,溶菌酶在不同浓度下的活性存在差异,随着浓度的增加,溶菌酶的活性逐渐增强。
这可能与溶菌酶的酶促反应动力学有关。
2. 细菌细胞壁结构:实验结果显示,溶菌酶对不同细菌细胞壁的溶解效果存在差异。
这可能与不同细菌细胞壁的成分和结构有关。
革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖组成,而革兰氏阴性菌的细胞壁则由肽聚糖和脂多糖组成。
溶菌酶试验综合型实验(实验报告定稿)
第1章引言生化技术重要理论蛋白质提取分离技术以蛋白质和结构与功能为基础,从分子水平上认识生命现象,已经成为现代生物学发展的主要方向,研究蛋白质,首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识,但基本原理不外乎两方面。
一是得用混合物中几个组分分配率的差别,把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中,如盐析,有机溶剂提取,层析和结晶等;二是将混合物置于单一物相中,通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的,如电泳,超速离心,超滤等。
在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性,防止酸、硷、高温,剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。
蛋白质的制备一般分为以下四个阶段:选择材料和预处理,细胞的破碎及细胞器的分离,提取和纯化,浓细、干燥和保存。
微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料,所选用的材料主要依据实验目的来确定。
对于微生物,应注意它的生长期,在微生物的对数生长期,酶和核酸的含量较高,可以获得高产量,以微生物为材料时有两种情况:(1)得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等;(2)利用菌体含有的生化物质,如蛋白质、核酸和胞内酶等。
植物材料必须经过去壳,脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同,其中所含生物大分子的量变化很大,另外与季节性关系密切。
对动物组织,必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料,先进行绞碎、脱脂等处理。
另外,对预处理好的材料,若不立即进行实验,应冷冻保存,对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
1.蛋白质的分离纯化1.1蛋白质(包括酶)的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液,少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中,因些,可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
1.1.1水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。
溶菌酶综合型实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 熟悉溶菌酶的提取、分离和纯化方法。
2. 学习并掌握酶活力、蛋白浓度测定技术。
3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定方法。
4. 培养实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理溶菌酶(Lysozyme)是一种天然存在的胞壁质酶,主要存在于鸡蛋清、蜂蜜、乳制品等天然食品中。
它能够水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁质,从而破坏细菌细胞壁,使细菌失去生存能力。
本实验通过提取、分离和纯化溶菌酶,并对溶菌酶进行活性、浓度、纯度和分子量的测定,以了解溶菌酶的性质和应用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料:- 鸡蛋清- 蛋白酶抑制剂- 离心机- pH计- 紫外分光光度计- 琼脂糖凝胶电泳仪- 紫外可见分光光度计2. 实验试剂:- Tris-HCl缓冲液- NaCl- 蛋白酶抑制剂- 标准溶菌酶溶液- 标准蛋白溶液四、实验步骤1. 溶菌酶的粗提取:- 称取适量鸡蛋清,加入适量的Tris-HCl缓冲液,搅拌均匀。
- 将混合液在4℃下离心,收集上清液。
- 加入蛋白酶抑制剂,防止蛋白酶降解溶菌酶。
2. 溶菌酶的分离纯化:- 将粗提取液在pH 6.0下透析,去除小分子物质。
- 使用凝胶过滤层析,分离纯化溶菌酶。
- 收集洗脱峰,得到纯化后的溶菌酶。
3. 酶活力、蛋白浓度测定:- 使用紫外分光光度计测定溶菌酶的蛋白浓度。
- 采用双缩脲法测定溶菌酶的酶活力。
4. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定:- 利用琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的溶菌酶。
- 通过比较标准蛋白分子量与溶菌酶的迁移率,确定溶菌酶的分子量。
- 使用SDS-PAGE电泳检测溶菌酶的纯度。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶的粗提取:- 离心后,上清液呈淡黄色,表明溶菌酶存在于上清液中。
2. 溶菌酶的分离纯化:- 凝胶过滤层析后,收集洗脱峰,得到纯化后的溶菌酶。
3. 酶活力、蛋白浓度测定:- 溶菌酶的蛋白浓度为1.2 mg/mL。
- 酶活力为800 U/mL。
4. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定:- 琼脂糖凝胶电泳结果显示,溶菌酶分子量为14 kDa。
溶菌酶作用实验范文
溶菌酶作用实验范文溶菌酶作用实验是研究溶菌酶对溶菌作用的一种实验方法。
溶菌酶是一种酶,主要能够溶解细菌的细胞壁,使细菌细胞发生溶解死亡。
溶菌酶在生物学研究和医学领域具有广泛的应用价值。
下面将对溶菌酶作用实验进行详细介绍。
实验目的:1.掌握溶菌酶的提取和纯化方法;2.研究溶菌酶对不同细菌产生的溶菌作用;3.分析溶菌酶作用的影响因素。
实验材料:1.大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌菌种;2.PBS缓冲液;3.试剂:琼脂、溶菌酶提取液、洗涤缓冲液、显色液等。
实验步骤:1.细菌培养与处理:a.在LB琼脂平板上分别刺穿大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌种,并进行预培养。
b.将培养好的菌种转接到LB培养基中,继续培养至对数生长期。
c.收集培养好的菌液,用PBS缓冲液洗涤2次。
2.溶菌酶提取:a.在PBS缓冲液中添加适量的溶菌酶提取液,使其充分混合。
注意溶菌酶的浓度应根据实验需求调整。
b.将菌液加入上述混合液中,充分搅拌,并放置在适当的温度下孵育一段时间。
3.溶菌酶活性测定:a.取一定体积的培养液,用洗涤缓冲液洗涤。
b.加入一定体积的溶菌酶提取液,并放置一段时间。
c.加入显色液,观察样品颜色变化情况,其浓度与颜色深浅呈正比。
4.溶菌酶对细菌的溶菌作用观察:a.在琼脂平板上分别刺穿大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌种。
b.在刺穿孔中滴加经溶菌酶处理后的细菌菌液,观察菌液滴体周围有无溶菌区域的产生。
实验结果与讨论:通过上述实验步骤,可以得到如下结果和讨论:1.溶菌酶提取和纯化方法的效果:根据溶菌酶的活性测定结果,可以评估溶菌酶提取和纯化的效果。
如实验结果呈现浓度与颜色深浅呈正比的趋势,则说明溶菌酶提取和纯化方法较为有效。
2.溶菌酶对不同细菌的溶菌作用:根据溶菌酶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液的处理结果,可以观察溶菌区域的产生情况。
如果溶菌区域明显,则说明溶菌酶对这些细菌有明显的溶菌作用。
3.溶菌酶作用的影响因素研究:可以通过改变实验条件,如溶菌酶的浓度、温度和pH值等,对溶菌酶的活性产生影响的强弱进行分析和讨论。
深紫外_溶菌酶实验报告
一、实验目的1. 探究深紫外照射对溶菌酶活性的影响。
2. 分析不同深紫外照射时间对溶菌酶活性变化的影响。
3. 探讨深紫外照射对溶菌酶分子结构稳定性的影响。
二、实验材料1. 溶菌酶样品:实验室自备,纯度大于95%。
2. 深紫外光源:波长为254nm,功率为100mW/cm²。
3. 实验试剂:NaCl、Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)、琼脂糖、细菌标准菌株等。
4. 实验仪器:紫外分光光度计、细菌培养箱、电热恒温水浴锅、电子天平等。
三、实验方法1. 深紫外照射实验(1)将溶菌酶样品稀释至适当浓度。
(2)将稀释后的样品均匀涂布于琼脂糖平板上。
(3)将琼脂糖平板置于深紫外光源下,分别照射0、10、20、30、40分钟。
(4)照射完成后,将平板倒置于细菌培养箱中培养24小时。
(5)观察并记录细菌生长情况,计算细菌抑制率。
2. 深紫外照射对溶菌酶分子结构稳定性影响实验(1)取一定量的溶菌酶样品,加入Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)。
(2)将样品置于深紫外光源下,分别照射0、10、20、30、40分钟。
(3)照射完成后,采用SDS-PAGE方法检测溶菌酶样品的分子量变化。
四、实验结果与分析1. 深紫外照射对溶菌酶活性的影响(1)随着深紫外照射时间的延长,溶菌酶活性逐渐降低。
(2)在照射时间为30分钟时,溶菌酶活性降至最低点,细菌抑制率达到最大值。
(3)照射时间为40分钟时,溶菌酶活性略有回升,但细菌抑制率仍较高。
2. 深紫外照射对溶菌酶分子结构稳定性影响(1)深紫外照射对溶菌酶分子结构稳定性有一定影响。
(2)照射时间为10分钟时,溶菌酶分子量略有下降,但未出现明显的降解现象。
(3)照射时间为30分钟时,溶菌酶分子量下降明显,出现部分降解现象。
五、结论1. 深紫外照射对溶菌酶活性有显著抑制作用,且随着照射时间的延长,抑制作用逐渐增强。
2. 深紫外照射对溶菌酶分子结构稳定性有一定影响,照射时间过长可能导致溶菌酶分子降解。
溶菌酶的制备实验报告
一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取、分离和纯化方法。
2. 掌握酶活性测定和蛋白质浓度测定技术。
3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定方法。
二、实验原理溶菌酶(Lysozyme)是一种胞壁质酶,具有破坏细菌细胞壁的能力。
本实验采用鸡蛋清为原料,通过提取、分离和纯化等步骤,制备高纯度的溶菌酶。
三、实验材料与仪器1. 实验材料:- 鸡蛋清- 酶活性测定试剂盒- 蛋白质浓度测定试剂盒- 溶菌酶纯度鉴定试剂盒- 分子量测定试剂盒2. 实验仪器:- 低温高速离心机- 酶标仪- 荧光分光光度计- 凝胶电泳仪- 凝胶成像系统四、实验方法1. 溶菌酶粗提取(1)取一定量的鸡蛋清,加入适量的生理盐水,搅拌均匀。
(2)将混合液用低温高速离心机以4,000 rpm离心10分钟,取上清液。
(3)用酶活性测定试剂盒检测上清液中的溶菌酶活性。
2. 溶菌酶分离纯化(1)取上清液,加入适量的硫酸铵,使蛋白质沉淀。
(2)将混合液用低温高速离心机以4,000 rpm离心10分钟,取沉淀。
(3)将沉淀用生理盐水溶解,加入适量的G-25凝胶柱,进行凝胶过滤。
(4)收集洗脱液,用酶活性测定试剂盒检测洗脱液中的溶菌酶活性。
3. 溶菌酶纯度鉴定(1)取适量的溶菌酶溶液,加入溶菌酶纯度鉴定试剂盒,进行电泳分析。
(2)观察电泳图谱,鉴定溶菌酶的纯度。
4. 溶菌酶分子量测定(1)取适量的溶菌酶溶液,加入分子量测定试剂盒,进行SDS-PAGE电泳分析。
(2)观察电泳图谱,计算溶菌酶的分子量。
5. 溶菌酶活性测定(1)取适量的溶菌酶溶液,加入酶活性测定试剂盒,进行酶活性测定。
(2)记录酶活性值。
6. 溶菌酶蛋白浓度测定(1)取适量的溶菌酶溶液,加入蛋白质浓度测定试剂盒,进行蛋白浓度测定。
(2)记录蛋白浓度值。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶粗提取上清液中溶菌酶活性为XX单位/mL。
2. 溶菌酶分离纯化洗脱液中溶菌酶活性为XX单位/mL。
3. 溶菌酶纯度鉴定电泳图谱显示,溶菌酶的纯度为XX%。
溶菌酶自组装实验报告
溶菌酶自组装实验报告引言溶菌酶是一种具有抗菌作用的酶类物质,广泛存在于许多生物体中,如人类、植物和细菌中。
溶菌酶能够通过水解细菌细胞壁上的β-(1,4)-N-乙酰葡萄糖胺键而引起细菌的溶解。
近年来,研究者们发现溶菌酶不仅具有杀菌作用,还能够通过自组装形成各种纳米结构,为纳米技术和生物医学研究提供了新的途径。
本实验旨在通过自组装方法制备溶菌酶纳米颗粒,并对其形貌和结构进行表征。
实验方法材料准备- 溶菌酶粉末- 磷酸盐缓冲液(PBS)- 无水乙醇- 离心管- 紫外可见分光光度计实验步骤1. 将一定量的溶菌酶粉末称取到离心管中。
2. 加入适量的PBS溶液,并用震荡仪将其均匀悬浮。
3. 把悬浮液置于40恒温水浴中,保持一定时间。
4. 向悬浮液中加入一定浓度的无水乙醇。
5. 用紫外可见分光光度计测量悬浮液的吸光度,记录下其数值。
结果与分析根据实验步骤,我们制备了不同浓度的溶菌酶纳米颗粒溶液,并对其进行了表征。
在实验中,我们发现随着乙醇浓度的增加,溶菌酶纳米颗粒的形貌和结构发生了明显的变化。
首先,当未加入乙醇的悬浮液经过自组装反应后,观察到溶菌酶纳米颗粒的分布较为均匀,颗粒大小均匀。
这说明溶菌酶在PBS溶液中能够自发地形成纳米级的聚集体。
然而,当加入一定浓度的乙醇后,我们观察到溶菌酶纳米颗粒的直径明显增大,而且形状变得不规则。
这可能是由于乙醇的存在改变了溶菌酶分子之间的相互作用,使其形成了更大的聚集结构。
同时,乙醇的加入也导致了纳米颗粒的聚集程度加剧,颗粒之间的空隙减少。
另外,我们通过测量纳米颗粒溶液的吸光度来评估溶菌酶纳米颗粒的质量。
实验结果显示,在乙醇浓度为10%时,纳米颗粒的吸光度最高,说明其质量最优。
然而,随着乙醇浓度继续增加,纳米颗粒的吸光度逐渐下降,可能是由于过高的乙醇浓度导致纳米颗粒的聚集不稳定。
结论通过溶菌酶自组装实验,我们成功制备了溶菌酶纳米颗粒。
实验结果表明,乙醇的加入对溶菌酶纳米颗粒的形貌和结构产生了明显影响。
溶菌酶自组装实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握溶菌酶自组装的基本原理和实验方法。
2. 了解溶菌酶自组装在生物材料领域的应用。
3. 培养实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理溶菌酶是一种胞壁质酶,具有水解细菌细胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4糖苷键的功能。
溶菌酶分子在特定条件下能够通过氢键、离子键、疏水作用等非共价相互作用形成自组装结构。
本实验旨在通过溶菌酶自组装制备具有特定结构和功能的生物材料。
三、实验材料与仪器材料:1. 鸡蛋清(溶菌酶来源)2. NaCl(调节离子强度)3. 乙醇(沉淀剂)4. 丙酮(沉淀剂)5. 水合氯醛(固定剂)6. 生理盐水7. 0.1%琼脂糖仪器:1. 电子天平2. 恒温水浴锅3. 离心机4. 紫外可见分光光度计5. 显微镜6. 超声波清洗器四、实验步骤1. 溶菌酶提取:将鸡蛋清与生理盐水混合,用超声波清洗器处理30分钟,离心去除杂质,收集上清液即为溶菌酶粗提液。
2. 溶菌酶自组装:将溶菌酶粗提液加入一定浓度的NaCl溶液,在恒温水浴锅中加热至60℃,保温一定时间,使溶菌酶分子发生自组装。
3. 溶菌酶自组装结构观察:将自组装后的溶菌酶溶液滴加到0.1%琼脂糖凝胶上,用显微镜观察溶菌酶自组装结构。
4. 溶菌酶自组装材料制备:将自组装后的溶菌酶溶液加入一定比例的乙醇,使溶菌酶自组装材料沉淀,离心收集沉淀,用丙酮洗涤沉淀,干燥后得到溶菌酶自组装材料。
5. 溶菌酶自组装材料性能测试:通过紫外可见分光光度计测定溶菌酶自组装材料的紫外吸收峰,分析其结构特征。
将溶菌酶自组装材料与水合氯醛混合,制成溶菌酶自组装材料薄膜,观察其抗菌性能。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶自组装结构观察:显微镜观察结果显示,溶菌酶自组装形成了具有一定结构和形态的颗粒状、纤维状等结构。
2. 溶菌酶自组装材料性能测试:紫外可见分光光度计测定结果显示,溶菌酶自组装材料具有明显的紫外吸收峰,表明其结构特征符合预期。
溶酶菌的实验报告
一、 溶菌酶的提取纯化
实验日期:2012-10-18
1、 溶菌酶洗脱曲线的制作:
(2)绘制洗脱曲线:
以OD280值为纵坐标,对应中间体积值为横坐标,绘制曲线:
00.25
0.50.7511.25
1.51.7520
3
6
9
12
15
18
21
24
27
二、蛋白含量&酶活性的测定
实验日期:2012-10-19
根据上表数据,绘制标准曲线:
标准曲线
00.10.20.30.40.50.60.70
10
20
30
40
50
60
OD595
所以直线回归方程:y=0.0101x+0.0573
5
6
(1)从上面数据得出,蛋清的蛋白浓度比提取物的高,但其活性和比活性都比提取物的低。
而且提取物的纯化倍数比较高,为5.44。
(2)酶的活力表示为特定条件下单位时间内转化底物的速度,而细菌悬液的光吸收值的减少速度可以推测酶的活性。
试验过程中,每15 s记录1 次测定管的吸光度值,在15 s 至75 s 之间测定管吸光度值以稳定速度下降,因此对于酶的活性测定,单位时间应选择为15 s 至75 s。
(3)对于这次试验,在操作上我们存在明显的不足,如下:
A.标准曲线上,有两个数据点比较偏离,可能我们测定这两个数据点的OD值时润洗操作未能做到位,导致误差的出现。
B.酶活性的测定上也同样存在一定的误差,例如:平行测3次,但每次的吹打效果不一样,o秒时的OD值不太一致,可能造成不同程度的偏差!。
溶菌酶实验报告
溶菌酶实验报告溶菌酶实验报告一、实验目的1. 了解溶菌酶的作用和原理。
2. 掌握溶菌酶的提取和纯化方法。
3. 观察溶菌酶对细菌的溶解作用。
4. 探究溶菌酶活性的影响因素。
二、实验原理溶菌酶是一种能够降解细菌细胞壁的酶,能够切断细菌细胞壁中的葡萄聚糖链。
本实验基于溶菌酶对细菌的溶解作用,通过提取和纯化溶菌酶,观察其对细菌的溶解作用,并考察其活性的影响因素。
三、实验步骤1. 细菌培养:将青霉素产生菌株接种到培养基中,在37℃恒温摇床中培养16小时。
2. 细胞破碎:将培养液离心,去除上清液,用冷水洗涤菌体。
将菌体置于离心管中,在4℃条件下用酸性缓冲液破碎菌体。
3. 提取溶菌酶:离心破碎后的溶液,收集上清液。
将上清液加入硫酸铵溶液中,离心分离出沉淀,收集沉淀并溶解。
4. 粗提溶菌酶的纯化:对溶菌酶溶液进行离心、过滤和上样等操作,分离出纯净的溶菌酶。
5. 观察细菌的菌斑:将菌落转移到几个含溶菌酶的琼脂平板上,培养一段时间后观察菌落溶解情况。
6. 探究影响溶菌酶活性的因素:将溶菌酶分成几组,分别在不同温度、pH值和离子浓度下进行活性测定。
四、实验结果1. 提取和纯化溶菌酶:通过离心和过滤等操作,从细菌的破碎液中提取出纯净的溶菌酶。
2. 观察细菌的菌斑:在含溶菌酶的琼脂平板上培养细菌,观察到溶菌酶作用后的菌落明显溶解,与对照组相比,差异显著。
3. 影响溶菌酶活性的因素:在不同的温度、pH值和离子浓度下测定溶菌酶的活性,结果显示:较高的温度和较低的pH值能够提高溶菌酶的活性,而高浓度的离子对其活性有抑制作用。
五、实验讨论通过本实验的操作,成功提取和纯化了溶菌酶,并观察到其对细菌的溶解作用。
这表明溶菌酶具有一定的活性,并且能够降解细菌细胞壁,达到抑制细菌生长的效果。
在影响溶菌酶活性的因素方面,高温和低pH值对其活性有促进作用。
这是因为高温能够提高酶的活性,使其具有更好的催化效果;而低pH值可以改变酶的构象,增加其与细菌细胞壁的结合能力,从而提高溶解作用。
溶菌酶纯化应用实验报告
一、实验目的1. 掌握溶菌酶的提取、分离和纯化方法。
2. 了解溶菌酶在不同应用中的活性变化。
3. 分析溶菌酶纯化过程中可能存在的问题及解决方案。
二、实验原理溶菌酶是一种天然存在的酶,具有分解细菌细胞壁的能力。
在食品、医药、化妆品等领域具有广泛的应用。
本实验通过提取、分离和纯化溶菌酶,探讨其在不同应用中的活性变化。
三、实验材料与仪器1. 实验材料:鸡蛋、SDS-PAGE凝胶、考马斯亮蓝G250、pH缓冲液、蛋白质分子量标准品、DNA分子量标准品、蛋白质酶解底物等。
2. 实验仪器:高速离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、显微镜等。
四、实验方法1. 溶菌酶提取:取新鲜鸡蛋,分离蛋清,加入适量去离子水,搅拌均匀,过滤得到溶菌酶粗提液。
2. 溶菌酶分离纯化:(1)盐析法:将溶菌酶粗提液加入饱和硫酸铵溶液,搅拌,离心取沉淀,用少量去离子水溶解。
(2)离子交换层析法:将溶菌酶溶液上柱,用不同浓度的NaCl溶液梯度洗脱,收集洗脱液。
(3)凝胶过滤层析法:将离子交换层析后的溶菌酶溶液上柱,用蛋白质分子量标准品进行对照,收集目标蛋白峰。
3. 溶菌酶活性测定:(1)酶活性测定:采用比色法测定溶菌酶的活性。
(2)溶菌酶在不同应用中的活性变化:将纯化后的溶菌酶分别应用于食品、医药、化妆品等领域,观察其活性变化。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶分离纯化结果:通过盐析、离子交换层析和凝胶过滤层析,成功纯化溶菌酶,SDS-PAGE结果显示目标蛋白峰为单一蛋白。
2. 溶菌酶活性测定结果:纯化后的溶菌酶活性达到原粗提液的10倍以上。
3. 溶菌酶在不同应用中的活性变化:(1)食品:溶菌酶在食品中的应用效果显著,如发酵乳、肉制品等,可提高食品品质,延长保质期。
(2)医药:溶菌酶在医药领域的应用包括抗菌、消炎、促进伤口愈合等,具有良好疗效。
(3)化妆品:溶菌酶在化妆品中的应用有助于清洁皮肤,改善皮肤状况。
六、实验讨论1. 溶菌酶的提取、分离和纯化过程中,要注意避免蛋白质的降解和污染。
唾液溶菌酶实验报告
一、实验目的1. 了解溶菌酶的提取方法和实验操作流程。
2. 掌握测定溶菌酶活性的原理和操作步骤。
3. 探讨影响溶菌酶活性的因素。
二、实验原理溶菌酶是一种具有杀菌作用的酶,广泛存在于人体唾液中。
溶菌酶能够特异性地分解细菌细胞壁中的肽聚糖,导致细菌细胞壁破裂,从而达到杀菌作用。
本实验通过提取唾液中的溶菌酶,并测定其活性,以了解溶菌酶的特性和影响因素。
三、实验材料与仪器1. 实验材料:唾液、细菌悬液、蒸馏水、生理盐水、Tris-HCl缓冲液、0.1%吐温-80、0.2%NaCl、1%琼脂糖、pH计、恒温培养箱、酶标仪、移液器、离心机、紫外分光光度计等。
2. 实验试剂:溶菌酶提取液、细菌悬液、Tris-HCl缓冲液、0.1%吐温-80、0.2%NaCl、1%琼脂糖、pH计校准液、酶标仪校准液等。
四、实验方法1. 溶菌酶提取(1)取一定量唾液,用生理盐水稀释至适当浓度。
(2)将稀释后的唾液加入0.1%吐温-80,搅拌均匀。
(3)加入0.2%NaCl,搅拌溶解。
(4)将溶液转移至离心管,4℃、12,000 rpm离心10分钟。
(5)取上清液,用pH计测定pH值,调整至7.0。
(6)将调整后的溶液转移至透析袋,在4℃下透析过夜。
(7)透析后,将溶液转移至离心管,4℃、12,000 rpm离心10分钟。
(8)取上清液,即为溶菌酶提取液。
2. 溶菌酶活性测定(1)取细菌悬液,用Tris-HCl缓冲液稀释至适当浓度。
(2)取1 ml细菌悬液加入酶标板孔中,加入50 μl溶菌酶提取液,混匀。
(3)在37℃下反应30分钟。
(4)加入1 ml终止液,混匀。
(5)用酶标仪测定各孔的吸光度值。
(6)根据标准曲线计算溶菌酶活性。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶提取通过实验,成功提取了唾液中的溶菌酶,提取液无色透明,无明显杂质。
2. 溶菌酶活性测定(1)标准曲线绘制:以不同浓度的溶菌酶提取液为实验组,以吸光度值为纵坐标,浓度值为横坐标,绘制标准曲线。
溶菌酶数量测定实验报告
一、实验目的1. 学习溶菌酶的基本性质和提取方法。
2. 掌握溶菌酶数量的测定方法。
3. 了解实验误差的来源及处理方法。
二、实验原理溶菌酶是一种能够水解细菌细胞壁中肽聚糖的酶,具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物学活性。
本实验采用比色法测定溶菌酶的数量,原理如下:在适宜的pH和温度条件下,溶菌酶可以水解细菌细胞壁中的肽聚糖,产生可溶性产物。
通过测定水解后的产物浓度,可以计算出溶菌酶的数量。
三、实验材料与仪器1. 材料:溶菌酶粗提液、细菌细胞壁提取物、缓冲液、底物、显色剂等。
2. 仪器:分光光度计、恒温水浴锅、移液器、离心机、试管等。
四、实验步骤1. 配制底物溶液:取一定量的细菌细胞壁提取物,加入适量的缓冲液,充分溶解后备用。
2. 溶菌酶溶液配制:取一定量的溶菌酶粗提液,加入适量的缓冲液,充分溶解后备用。
3. 设置实验组与空白组:a. 实验组:取一定量的底物溶液,加入适量的溶菌酶溶液,混匀后置于恒温水浴锅中,反应一定时间。
b. 空白组:取一定量的底物溶液,加入等量的缓冲液,混匀后置于恒温水浴锅中,反应一定时间。
4. 取出实验组和空白组溶液,加入适量的显色剂,混匀后静置一定时间。
5. 使用分光光度计测定实验组和空白组的吸光度值。
6. 根据标准曲线,计算溶菌酶的数量。
五、结果与分析1. 标准曲线绘制:以溶菌酶浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。
2. 溶菌酶数量计算:根据实验组吸光度值,从标准曲线上查得溶菌酶浓度,再根据溶菌酶溶液的稀释倍数,计算溶菌酶数量。
六、讨论1. 实验误差分析:a. 溶菌酶溶液的配制:在配制溶菌酶溶液时,应严格控制溶液的浓度,避免因浓度过高或过低而影响实验结果。
b. 反应条件:在实验过程中,应严格控制反应条件,如pH、温度等,以确保实验结果的准确性。
c. 仪器误差:分光光度计的准确度、吸光度读数的准确性等因素也会对实验结果产生影响。
2. 实验结果分析:通过本实验,我们成功测定了溶菌酶的数量,并分析了实验误差。
溶菌酶的鉴别实验报告
一、实验目的1. 掌握溶菌酶的基本特性。
2. 学习溶菌酶的提取和分离纯化方法。
3. 通过实验鉴别溶菌酶与其他类似酶的活性差异。
二、实验原理溶菌酶(Lysozyme)是一种广泛存在于动物、植物和微生物细胞中的酶,具有水解细菌细胞壁肽聚糖的作用,从而破坏细菌细胞壁,导致细菌死亡。
本实验通过提取溶菌酶,对其活性进行测定,并与其他类似酶进行对比,以鉴别溶菌酶的特性。
三、实验材料与仪器材料:1. 鸡蛋2. 生理盐水3. 磷酸盐缓冲液(pH 7.0)4. 硫酸铵5. 葡萄糖6. 硫酸铜7. 酚红指示剂8. 酶活性测定试剂盒仪器:1. 电子天平2. 离心机3. 烧杯4. 移液器5. 显微镜6. 恒温水浴锅四、实验方法1. 溶菌酶提取:(1)取鸡蛋,去壳,取蛋黄;(2)将蛋黄放入烧杯中,加入适量的生理盐水,用玻璃棒搅拌;(3)将搅拌好的蛋黄液离心(3000 rpm,10 min);(4)取上清液,即为溶菌酶粗提液。
2. 溶菌酶分离纯化:(1)将溶菌酶粗提液加入适量的硫酸铵,使蛋白质沉淀;(2)离心(3000 rpm,10 min);(3)取沉淀,加入适量的磷酸盐缓冲液,溶解蛋白质;(4)重复上述步骤,直至蛋白质纯度达到预期。
3. 酶活性测定:(1)取酶活性测定试剂盒,按照说明书进行操作;(2)分别测定溶菌酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶的酶活性。
4. 溶菌酶与其他酶的鉴别:(1)将溶菌酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶分别制成酶液;(2)在显微镜下观察酶液对细菌细胞壁的破坏情况;(3)根据酶活性测定结果和显微镜观察结果,鉴别溶菌酶与其他酶的差异。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶提取:成功提取出溶菌酶粗提液,蛋白质含量约为0.5 mg/mL。
2. 溶菌酶分离纯化:经过多次硫酸铵沉淀和磷酸盐缓冲液溶解,蛋白质纯度达到90%以上。
3. 酶活性测定:溶菌酶的酶活性为50 U/mL,葡萄糖氧化酶的酶活性为30 U/mL,β-半乳糖苷酶的酶活性为20 U/mL。
溶菌酶生产实验报告
溶菌酶生产实验报告一、实验目的本实验旨在通过培养细菌并利用其产生的溶菌酶来探究溶菌酶的生产及其应用。
二、实验原理溶菌酶是一种能够分解细胞壁的酶,广泛存在于各种细菌和真菌中。
在细菌中,溶菌酶可作为一种防御机制来破坏竞争对手的细胞壁,从而获得更多的营养资源。
因此,利用细菌产生的溶菌酶可以对抗某些病原微生物,具有广泛的应用前景。
三、实验步骤1. 制备培养基:将10g肉汤粉加入1000mL蒸馏水中,并加热至完全溶解后进行高压灭菌。
2. 培养细菌:取一根无菌棉签,在室温下擦拭采集样品(如口腔黏膜),将其涂抹于制备好的肉汤培养基上,并在37℃恒温箱中培养24小时。
3. 筛选产生溶菌酶的细菌:将培养好的细菌接种于含有1%琼脂的肉汤培养基上,然后在琼脂表面滴加0.1%甲基红染料,待溶菌酶产生后,细菌会将甲基红染料溶解并在培养基表面形成透明圈。
4. 收集溶菌酶:用无菌棉签沾取产生透明圈的细菌,并将其转移到无菌离心管中。
离心管中加入少量蒸馏水,振荡5分钟后离心收集液体上清即为溶菌酶。
四、实验结果通过筛选产生溶菌酶的细菌,我们成功地获得了一种能够产生溶菌酶的细菌。
在含有1%琼脂和0.1%甲基红染料的肉汤培养基上,该细菌形成了一个透明圈,证明其已经产生了溶菌酶。
经过收集和离心处理,我们得到了一定量的溶菌酶液体。
五、实验分析本实验通过简单的培养和筛选步骤成功地制备出了一种能够产生溶菌酶的细菌,并从中收集到了一定量的溶菌酶。
这些结果表明了溶菌酶的生产是一种相对简单而有效的方法,具有广泛的应用前景。
未来,我们可以进一步探究溶菌酶在抗微生物感染、食品加工等领域中的应用。
六、实验结论本实验成功地制备出了一种能够产生溶菌酶的细菌,并从中收集到了一定量的溶菌酶。
这些结果表明了利用细菌产生溶菌酶是一种相对简单而有效的方法,具有广泛的应用前景。
我们可以进一步探究溶菌酶在抗微生物感染、食品加工等领域中的应用。
溶菌酶酶实验报告
一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取方法。
2. 掌握溶菌酶活性测定的原理和操作步骤。
3. 了解温度、pH值等因素对溶菌酶活性的影响。
4. 通过实验,进一步理解溶菌酶在生物体内的作用。
二、实验原理溶菌酶(Lysozyme)是一种广泛存在于生物体中的胞壁质酶,主要作用是水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸与N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4-糖苷键,导致细菌细胞壁破裂,从而杀死细菌。
本实验通过测定溶菌酶对细菌细胞壁的降解能力,即溶菌酶的酶活性,来评估溶菌酶的活性水平。
三、实验材料与仪器1. 材料:- 溶菌酶粗提液- 大肠杆菌悬液- Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)- 0.1%苯酚红指示剂- 水浴锅- 移液器- 离心机- 显微镜2. 仪器:- 实验台- 烧杯- 试管- 移液管- 秒表四、实验步骤1. 溶菌酶粗提液的制备:- 将溶菌酶粗提液稀释至一定浓度。
- 用移液器取一定体积的稀释液,加入Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)中,混匀。
2. 酶活性测定:- 将稀释的大肠杆菌悬液加入试管中,使试管中的菌液浓度为1×10^8 CFU/mL。
- 加入等体积的溶菌酶粗提液,混匀。
- 将试管置于37℃水浴锅中,每隔一定时间取出,用离心机离心去除菌体。
- 取上清液,加入苯酚红指示剂,观察颜色变化。
3. 温度对酶活性的影响:- 分别将溶菌酶粗提液置于0℃、25℃、37℃、50℃水浴锅中,保温一定时间后,进行酶活性测定。
4. pH值对酶活性的影响:- 用Tris-HCl缓冲液(pH 3.0、5.0、7.0、9.0、11.0)分别代替pH 7.0的Tris-HCl缓冲液,进行酶活性测定。
五、实验结果与分析1. 酶活性测定结果:- 随着时间的推移,苯酚红指示剂的颜色逐渐由红变黄,表明溶菌酶成功降解了细菌细胞壁,释放出自由的糖类物质。
- 在37℃时,酶活性最高,表明溶菌酶的最适温度为37℃。
- 在pH 7.0时,酶活性最高,表明溶菌酶的最适pH值为7.0。
唾液溶菌酶检测实验报告
唾液溶菌酶检测实验报告实验目的:通过检测唾液中的溶菌酶活性,了解唾液对细菌的防御作用。
实验原理:溶菌酶是一种能够溶解细菌细胞壁的酶,广泛存在于人体的唾液、泪液、鼻液等体液中。
溶菌酶对革兰氏阳性细菌的作用特别强,可以明显抑制革兰氏阳性菌的生长。
实验中,我们使用一种叫做微球的实验物质,其表面上包含革兰氏阳性菌细胞的成分,唾液中的溶菌酶可以作用于微球表面的菌细胞,导致微球发生溶解。
测量微球的溶解率,可以间接反映唾液中溶菌酶的活性。
实验材料和仪器:1. 唾液收集用的试管2. 0.9%氯化钠溶液3. 革兰氏阳性菌微球4. 白板或投影仪5. 显微镜和目镜6. 加热器或恒温水槽7. 称量瓶和天平8. 吸管9. 移液器及移液枪10. 刻度筒11. 离心机实验步骤:1. 在一个干净的容器中收集唾液样本。
注意不要将舌头或其他物体碰到试管内壁。
2. 使用吸管将唾液吸至约2-3ml试管中。
3. 用称量瓶称取0.2g的微球,加入2ml的0.9%氯化钠溶液中,轻轻搅拌10秒,以使微球分散均匀。
4. 将0.5ml的微球溶液滴加入一片载玻片上,用另一片载玻片盖在上面。
5. 在白板上或投影仪上放置玻片,用显微镜观察微球的形态。
6. 放置显微镜下的平台上,设置加热器或恒温水槽,将显微镜恒温至37C。
7. 分别取5片载玻片准备5个不同的样本,包括0ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml 和0.4ml的唾液。
注意要尽量保持各样本的相对浓度(微球与唾液的比例)相同。
8. 分别用移液器分别加入相应体积的唾液到载玻片的微球溶液中,每次加完后需要轻轻摇晃,保证各样本的溶菌酶与微球充分接触。
9. 分别设置不同的时间段(如15分钟、30分钟、45分钟和60分钟)进行孵育。
10. 每个时间点结束后,用显微镜观察溶解现象,并记录微球的溶解情况。
11. 测量每个时间段内的平均溶解比例。
实验结果与分析:根据实验数据,我们可以得到不同时间段内的微球溶解比例。
溶菌酶试验实验报告
一、实验目的1. 熟悉溶菌酶的提取、分离纯化方法;2. 掌握酶活力和蛋白浓度的测定方法;3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定方法。
二、实验原理溶菌酶(Lysozyme)是一种广泛存在于动物、植物和微生物中的胞壁质酶,能够特异性地水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁质,从而破坏细菌细胞壁,导致细菌死亡。
本实验旨在通过提取、分离纯化溶菌酶,并对其酶活力、蛋白浓度、纯度和分子量进行测定。
三、实验材料1. 材料:鸡蛋、牛肉膏蛋白胨培养基、细菌培养液、SDS-PAGE凝胶、考马斯亮蓝G-250染液等;2. 仪器:高速离心机、紫外分光光度计、电泳仪、凝胶成像系统等;3. 试剂:氯化钠、氢氧化钠、醋酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、考马斯亮蓝G-250、十二烷基硫酸钠(SDS)等。
四、实验方法1. 溶菌酶的粗提取(1)取新鲜鸡蛋,去壳,将蛋白与蛋黄分离;(2)将蛋白放入烧杯中,加入适量的氯化钠溶液,搅拌溶解;(3)将溶液过滤,得到滤液;(4)将滤液用氢氧化钠溶液调节pH值至7.0,室温下放置1小时;(5)将溶液用醋酸溶液调节pH值至5.0,静置沉淀;(6)将沉淀用离心机离心(3000 r/min,10分钟),取上清液作为粗提液。
2. 溶菌酶的分离纯化(1)将粗提液用EDTA溶液处理,去除蛋白中的金属离子;(2)将处理后的溶液用磷酸缓冲液(pH 7.0)调节pH值,静置沉淀;(3)将沉淀用离心机离心(3000 r/min,10分钟),取上清液;(4)将上清液用SDS-PAGE凝胶电泳分离,观察溶菌酶的条带位置;(5)根据电泳结果,收集目标条带,并进行浓缩。
3. 酶活力和蛋白浓度测定(1)酶活力测定:将收集到的浓缩液加入细菌培养液中,在37℃下反应一定时间,测定细菌存活率,根据公式计算酶活力;(2)蛋白浓度测定:采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白浓度。
4. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定(1)纯度鉴定:将分离纯化的溶菌酶样品进行SDS-PAGE凝胶电泳,观察电泳图谱,判断纯度;(2)分子量测定:将分离纯化的溶菌酶样品进行SDS-PAGE凝胶电泳,根据分子量标准曲线计算溶菌酶的分子量。
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溶菌酶试验综合型实验报告目录第1章引言 (2)生化技术重要理论 (2)蛋白质提取分离技术 (2)第2章实验准备 (20)2.1引言 (20)2.2仪器及材料 (20)2.3方法 (20)第3章酶的提取 (22)3.1引言 (22)3.2内容及步骤 (23)第4章酶的纯化 (24)4.1引言 (24)4.2方法 (25)第5章酶活力、蛋白浓度测定 (26)5.1引言 (26)5.2仪器及试剂 (27)5.3方法: (27)5.4实验结果 (29)第6章酶促动力学(Km测定、酶的抑制) (30)6.1引言 (30)6.2仪器及试剂 (31)6.3方法 (31)6.4 结论 (32)第7章SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测酶相对分子量及纯度鉴定 (33)7.1引言 (33)7.2方法 (34)7.3 .结果 (35)7.4结论 (35)第1章引言生化技术重要理论蛋白质提取分离技术以蛋白质和结构与功能为基础,从分子水平上认识生命现象,已经成为现代生物学发展的主要方向,研究蛋白质,首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。
蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识,但基本原理不外乎两方面。
一是得用混合物中几个组分分配率的差别,把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中,如盐析,有机溶剂提取,层析和结晶等;二是将混合物臵于单一物相中,通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的,如电泳,超速离心,超滤等。
在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性,防止酸、硷、高温,剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。
蛋白质的制备一般分为以下四个阶段:选择材料和预处理,细胞的破碎及细胞器的分离,提取和纯化,浓细、干燥和保存。
微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料,所选用的材料主要依据实验目的来确定。
对于微生物,应注意它的生长期,在微生物的对数生长期,酶和核酸的含量较高,可以获得高产量,以微生物为材料时有两种情况:(1)得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等;(2)利用菌体含有的生化物质,如蛋白质、核酸和胞内酶等。
植物材料必须经过去壳,脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同,其中所含生物大分子的量变化很大,另外与季节性关系密切。
对动物组织,必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料,先进行绞碎、脱脂等处理。
另外,对预处理好的材料,若不立即进行实验,应冷冻保存,对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
1.蛋白质的分离纯化1.1蛋白质(包括酶)的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液,少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中,因些,可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
1.1.1水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面,多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大,因此,温度高利于溶解,缩短提取时间。
但另一方面,温度升高会使蛋白质变性失活,因此,基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温(5度以下)操作。
为了避免蛋白质提以过程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制剂(如二异丙基氟磷酸,碘乙酸等)。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
(1) pH值蛋白质,酶是具有等电点的两性电解质,提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。
用稀酸或稀碱提取时,应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化,从而导致蛋白质构象的不可逆变化,一般来说,碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
(2) 盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶,称为盐溶作用。
同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合,具有保护蛋白质不易变性的优点,因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐,一般以0.15摩尔。
升浓度为宜。
缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
1.1.2有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶,不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂,它们具的一定的亲水性,还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必须在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越,一是因为丁醇亲脂性强,特别是溶解磷脂的能力强;二是丁醇兼具亲水性,在溶解度范围内不会引起酶的变性失活。
另外,丁醇提取法的pH及温度选择范围较广,也适用于动植物及微生物材料。
1.2 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化方法很多,主要有:1.2 .1. 根据蛋白质溶解度不同的分离方法1.2.1.1蛋白质的盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。
盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。
由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有:(1)温度:除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)操作外,一般可在室温中进行。
一般温度低蛋白质溶介度降低。
但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时溶解度低,更容易盐析。
(2)pH值:大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。
(3)蛋白质浓度:蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来(共沉现象)。
因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
其中应用最多的硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大(25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升;0度时饱和溶解度为3.9M,即676克/升),在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性。
硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入秀析袋内(常用的是玻璃纸),用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行。
此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短。
1.2.1.2 等电点沉淀法蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小,因而溶解度也最小,各种蛋白质的等电点有差别,可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀,但此法很少单独使用,可与盐析法结合用。
1.2.1.3低温有机溶剂沉淀法用与水可混溶的有机溶剂,甲醇,乙醇或丙酮,可使多数蛋白质溶解度降低并析出,此法分辨力比盐析高,但蛋白质较易变性,应在低温下进行。
1.2.2 根据蛋白质分子大小的差别的分离方法1.2.2.1 透析与超滤透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心力,强使水和其他小的溶质分子通过半透膜,而蛋白质留在膜上,可选择不同孔径的膜截留不同分子量的蛋白质。
1.2.2.2 凝胶过滤法也称分子排阻层析或分子筛层析,这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。
柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶(Sephadex gel)和琼脂糖凝胶(agarose gel)。
1.2.3根据蛋白质带电性质进行分离蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同,可将其分开。
1.2.3.1电泳法各种蛋白质在同一pH条件下,因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。
值得重视的是等电聚焦电泳,这是利用一种两性电解质作为载体,电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度,当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时,到达各自等电点的pH位臵就停止,此法可用于分析和制备各种蛋白质。
1.2.3.2 离子交换层析法离子交换剂有阳离子交换剂(如:羧甲基纤维素;CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素;DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维素),当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时,带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上,随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。
1.2.4 根据配体特异性的分离方法-亲和色谱法亲和层析法(aflinity chromatography)是分离蛋白质的一种极为有效的方法,它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来,而且纯度很高。
这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand)的分子能特异而非共价地结合。
其基本原理:蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在,每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质,因此蛋白质的分离(Separation),提纯(Purification)和鉴定(Characterization)是生物化学中的重要的一部分,至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来,因此往往采取几种方法联合使用。
1.3细胞的破碎1.3.1 高速组织捣碎:将材料配成稀糊状液,放臵于筒内约1/3体积,盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
1.3.2玻璃匀浆器匀浆:先将剪碎的组织臵于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎,此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高,适用于量少和动物脏器组织。
1.3.3超声波处理法:用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用于微生物材料,用大肠杆菌制备各种酶,常选用50-100毫克菌体/毫升浓度,在1KG至10KG频率下处理10-15分钟,此法的缺点是在处理过程会产生大量的热,应采取相应降温措施。
对超声波敏感和核酸应慎用。
1.3.4反复冻融法:将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。
1.3.5 化学处理法:有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏,细菌细胞壁较厚,可采用溶菌酶处理效果更好。
无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,加入二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用;加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酥活力,但不是全部,还可通过选择pH、温度或离子强度等,使这些条件都要适合于目的物质的提取。