昆虫嗅觉气味结合蛋白OBP的研究进展

昆虫嗅觉气味结合蛋白OBP的研究进展
摘要:昆虫嗅觉气味结合蛋白是嗅觉机制中重要的一部分，本文参考近年来国内外对昆虫气味结合蛋白的研究结果，从昆虫气味结合蛋白的生化特性、在触角中的分布、结合特性、蛋白结构、表达时间及代谢、生理功能等几个方面对气味结合蛋白进行了阐述。

关键词：昆虫；气味结合蛋白；三维结构；触角；配体结合
嗅觉在昆虫的生存和繁衍中至关重要，昆虫通过分布于触角(少数为下唇须)表层的嗅觉感受器来获取环境中的化学信息，进而调控其觅食、聚集、求偶和寻找产卵场所等重要行为。

昆虫对气味分子的识别，包括气味分子的质（不同分子）、量（不同浓度）以及释放间歇，有赖于昆虫整个嗅觉系统中各级神经元素对气味分子的信息编码，即在各级神经元素中的分子图像。

研究嗅觉机制，就是阐明昆虫对气味分子信息编码的整体过程，亦即气味分子的识别机理，涉及到昆虫嗅觉编码一般过程的内容包括OBP、嗅觉受体与分子识别以及分子图像等（娄永根，程家安，2001）。

一般而言，昆虫对气味物质的识别过程大致包括以下几步(穆兰芳等，2005) (1)外界环境中亲脂性的气味分子通过昆虫触角感器表皮上的微孔进入亲水性的感器淋巴液，与感器淋巴液中的可溶性气味结合蛋白(Odorant binding protein , OBP)结合，形成气味分子-OBP 复合体；(2)复合体穿过亲水性的嗅觉淋巴液，到达神经树突膜上的气味受体；(3)气味受体受到刺激后，膜通透性发生改变，产生动作电位，同时气味分子在OBP 作用下又迅速失，然后在气味降解酯酶和谷胱苷肽转移酶的作用下降解。

一些研究表明，昆虫感受到的气味物质多为脂溶性的小分子化合物。

这些小分子化合物通过触角上皮间的孔道扩散到达触角感受器淋巴液，触角感受器的淋巴液是亲水性的液体，而外界亲脂性气味分子不能通过这些亲水性的液体直接到达嗅觉神经树突末梢，据此推测神经树突周围液体中可能存在一种气味结合蛋白(odorant binding protein，OBP)，溶解并运输脂溶性气味化合物通过亲水性液体。

Vogt和R iddiford (1981 ) 用标记性信息素的方法在多音天蚕蛾(Antheraea polyphemus)雄蛾触角中发现大量16kDa的气味结合蛋白，这些蛋白能特异性的结合雌蛾的性信息素，因此被命名为性信息素结合蛋白昆虫信息素结合蛋白(pheromone binding protein，PBP)，随后在很多种昆虫中都发现了信息素结合蛋白的存在,并迅速成为气味结合蛋白中一个最主要的研究内容。

气味结合蛋白可以被分成三类：性信息素结合蛋白（PBPs），两种普通气味结合蛋白（GOBP1和GOBP2）和触角的结合蛋白（ABPX）。

近年来，OBPs已经在40多个昆虫种类中分离和克隆出，涵盖了8个不同的目（P.Pelosi等，2006）。

嗅觉气味结合蛋白(OBPs)是溶解于嗅觉感受器淋巴液的一类分泌性蛋白,能运输气味分子到达嗅觉神经元表面的嗅觉受体，是昆虫专一性识别外界气味物质的第一步生化反应(Vogt and R iddiford, 1981)，对于昆虫与外界进行信息交流具有重要意义( L i and Prestwich, 1997) 。

深入研究OBPs不仅具有阐明昆虫嗅觉识别的理论意义,而且也有为开发新型有效的生物害虫防治技术提供新思路的实际意义。

1.昆虫气味结合蛋白的一般特点
通常OBP的序列中有6个保守的半胱氨酸，在C1-C3, C2-C5, C3-C6之间形成3个二硫键。

至少98 %的昆虫种类的嗅觉感器中都存在OBP，第一个全长OBP 序列从烟草天蛾Manduca sexta 中得到（Gyorgyi T. K., 等）通过直接克隆和基因组分析,在其雄性触角的cDNA 文库中鉴定出了13 个OBPs。

OBPs 序列大部分是高度分化的,但在鳞翅目昆虫中有很大的保守性，如小地老虎Agrotisi.ipsilon 和黄地老虎Agrotis segetum的4 个PBP 基因都有2个内
含子,且2 个内含子的插入位置相同,表明2 种昆虫的PBP 基因同源性十分相近（李卫华等，2006）。

而果蝇Drosophila的OBP与鳞翅目的昆虫相比只有不到15%的相似性。

在D. melanogaster中有约39个可以编码含有6个保守半胱氨酸的传统OBP基因，有12个可能添加其他基团的OBP基因，冈比亚按蚊Anopheles gambiae也预测出了72个OBP基因，其中37个为传统OBP（zhou, J.J.等，2004）。

不同昆虫中OBPs 的差异可能也是不同昆虫对环境气味物质识别和结合能力不同的原因之一。

利用X-射线衍射和NMR等技术确定了家蚕B.mori PBP的三维结构（Wojtasek等, 1999b; Sandler等, 2000; Damberger等, 2000; Horst等, 2001; Lee 等, 2002）。

Bmor PBP中α1、α4、α5和α6形成疏水性的结合位点，螺旋α3盖在这个结合囊袋的一端，蚕蛾醇就结合于疏水囊腔内部（Sandler, 2000）。

研究表明，Bmor PBP的构象随pH的改变而变化（图1），pH 为6.5时，Bmor PBP为“紧口”构型，可以结合配基；当pH为4.5时，Bmor PBP构象变为“开口”型。

在没有配基存在时，C端氨基酸形成α-螺旋替代蚕蛾醇的位置，结合到内部的疏水区，而在pH7.0时C端并不形成α螺旋。

虽然其构型转化原理仍不清楚，但这与膜内微环境的pH值远远低于细胞质内的假设相一致（Zhang等，2002；Nikonov等, 2002; Wojtasek 等, 1998, 1999b）。

通过原核表达的C末端部分片段缺失的蛋白在pH7和pH5时与Bombykol 的结合能力与原初蛋白在pH7时有同样的结合能力，表明其可能的作用是阻止蛋白在低pH 值时对气味分子的结合(Leal 等, 2005)。

此外对L.maderae PBP结构的研究也很清楚（Lartigue 等, 2003）。

与鳞翅目OBPs相比Lmad PBP的C端有所变化，比Bmor PBP少19个氨基酸，因此缺第七个α螺旋，所以在结合配基时，没有它的参与；同时L.maderae的性信息素3-hydroxy-bytan-2-one亲水性很强，所以推断信息素分子可以直接到达与膜受体上。

据此推断这可能代表了另一种结合配基的方式。

最近得到的A.polyphemus中PBP/信息素复合物的结构，由9个α螺旋构成，当pH为4.0-7.0时，其构象不随pH的变化而变化（Mohanty, 2004）。

图1 OBP三维结构图（a）PH6.5时，结合特异性性信息素，Bmor PBP为“紧口”构型；（b）pH为4.5时，Bmor PBP构象变为“开口”型。

C端氨基酸形成α-螺旋，形成结合囊袋因为对蛾类性信息素的交流已经建立了较好的模型，许多研究都是以鳞翅目昆虫为材料的(Kaissling，1987)。

迄今为止，对鳞翅目昆虫气味结合蛋白的研究也最多。

PBP主要存在于雄蛾触角中，但Callahan等(2000)研究发现，谷实夜蛾Helicoverpa zea等3种鳞翅目雌蛾触角中的PBP表达量也很高，与雄蛾触角中相当，它们与昆虫感受性信息素有关；GOBP在雌雄蛾触角中表达量相同，在昆虫感受普通气味物质过程中起作用(Vogt等，1991；Wang等，2003)。

GOBP和PBP与不同类型的嗅觉受体神经协同作用，它们的作用方式也可能不一样。

OBP类似蛋白与OBP有明显的同源性(Krieger等，1996)，但其生理功能仍不清楚。

到目前为止，对昆
虫OBP的研究以美国加利福尼亚大学、法国的研究小组和德国Kaissling研究小组和研究最为深入，前两者主要利用分子生物学技术分别对烟草天蛾Manduca sexta和甘蓝夜蛾Mamestra brassicae进行了深入的研究(Vogt等，1991，1998; Tunde 等，1988; Maibeche-Coisne, 1997, 1998; Mosbah 等，2003)；而后者则利用各种方法，如电子显微镜、免疫化学、生物化学、电生理和行为观察等对气味结合蛋白的结构和功能进行了全面研究(Steinbrecht等1992，1995；Steinbrecht，1996；Kaissling等，1985；Kaissling，1986，1998)。

近来对传播疟疾的冈比亚按蚊Anopheles. gambiae和阿拉伯按蚊Anopheles. arabiensis研究也较多(Li 等，2005；Zhou 等，2004; 李正西等，2004; Justice 等，2003)。

2 昆虫气味结合蛋白的研究概况
第一个被鉴定出的昆虫OBPs是多音大蚕蛾( Antheraea polyphemus)的性外激素结合蛋白被命名为ApolPBP ,分子量为14kDa，特异的存在于雄虫触角中,其浓度大约为10mM。

第一个全长PBP序列是从烟草天蛾(Manduca Sexta)中得到的，以后通过克隆和基因组分析在其雄性触角的cDNA 文库中鉴定出13个OBPs。

第一个功能明确的OBP是黑尾果蝇(D rosophila melanogaster)的OBP76a,不仅起传输气味分子和调节气味分子与神经元的相互作用，还可能直接与受体蛋白作用或者起激活受体蛋白的作用。

随后通过克隆和基因组分析，发现了果蝇有51种OBPs基因，冈比亚按蚊有70多种，鳞翅目昆虫烟草天蛾有19种，在烟芽夜蛾中现已鉴定出9 个气味结合蛋白。

到目前为止，先后在鳞翅目、膜翅目、鞘翅目、双翅目、网翅目、直翅目、等翅目和半翅目的化学感受器内鉴定出很多与气味结合蛋白相关的蛋白(OBP-related Protein)。

在同源蛋白家族数据库Pfam中已经可以检索到75种昆虫400 多种相关蛋白。

通过对氨基酸序列比较，发现鳞翅目昆虫的GOBP和PBP的相似性在25%-30%，GOBP1和GOBP2之间的相似性大约为50%，GOBP1 和GOBP2是高度保守的(每一类群内的相似性在90%以上)，但是PBP则是高度分化的，相似性在20% -95%之间。

图3 昆虫所有OBPs支状图
从图3可以看到各种OBP蛋白的亲缘关系（P.Pelosi等，2006），目前所有被预测到的昆虫都被包括在内。

可以看出同一目中的不同种，甚至同一种都在这个树的不同分支上。

图3中很明确的可以看到鳞翅目OBPs可以分成3个基因簇，PBP、GOBP和ABPX，而PBP又分
为两个簇。

果蝇的两种OBPs和蟑螂的PBP和鳞翅目PBPs很接近。

膜翅目中水蚁属的18个种的OBPs很相近，而和其他的OBPs在不同的分支上。

另外双翅目的OBPs差异很大。

3.气味结合蛋白在触角中的分布
昆虫的触角具有灵敏的嗅觉功能。

这是其结构和功能完美统一的体现，用对PBP和GOBP 专一性抗体进行超微结构研究，表明这些可溶性蛋白集中在感受器淋巴液中，而神经树突和触角的其它区域均没有。

为了精确定位PBP和GOBP在触角中的具体分布状况，进而明确其结构和功能，Steinbrecht等(1992，1995)用细胞免疫化学和免疫电镜的方法先后对PBP和GOBP在几类蛾子触角中的分布进行了详细的研究，结果发现，在多音天蚕蛾和家蚕的雄蛾触角切片中，PBP存在于对性信息素敏感的毛形感受器中，GOBP存在于锥形感受器中(Zhang 等，2001)。

在不同种昆虫短形毛状感受器中发现了PBP和GOBP，但从未发现PBP和GOBP 共同存在于同一感受器中(Vogt等，2002；Laue等，1997；Laue，2000；Zhang等，2001)。

而在有的感受器中则两种都不存在，暗示OBP可能存在不同的亚形。

另外，同一种类型的感受器可以表达不同的OBPs( Nardi等，2003)。

长形毛状感受器在雌雄虫中具有不同的专一性，在雄虫中感受性信息素，在雌虫中感受普通气味。

OBP的表达在长形感受器中也有类似的现象，在雄虫中为PBP，在雌虫中为GOBP，可见OBP的功能和分布的协调一致，从侧面证明了PBP和GOBP所起的生理作用不同，以参与外界不同刺激的识别过程。

试验证明PBP可与特定的信息素结合。

它们主要存在于毛形感受器中，在信息素识别过程中起关键作用。

GOBP2在雌、雄蛾触角中的表达量相同(Vogt等，1991；Jacquin-Joly等，2000；王桂荣等，2003)，在所研究的昆虫中表现出很高的序列同源性。

一些试验证明，相对于PBP家族间较高的特异性而言，GOBP2家族有明显的广谱性。

GOBP2除了能结合较广范围的气味分子外，还能结合一些信息素分子(Liand Prestwich，1997)。

配体与受体的结合，一般很快达到饱和，亲和力高，称为特异性结合。

如果在配体浓度很高时也不能达到饱和则为非特异性结合，它们的亲和力低(孙大业，2001)。

至今还未找到合适的配体(Li and Prestwich，1997)，没有体外结合的试验数据(Zhang等，2001)，可能是配体在生物测定过程中易挥发所致(Nikonov等，2001)，因此也就不能得到一个理想的嗅觉模型(Maibeche等，1998)。

4 气味结合蛋白的配体结合
气味结合蛋白对环境中的气味化合物和种间、种内交流的各种信息素的结合能力是其主要的特征，对于了解其生理功能有重要的意义。

Vogt and Riddiford (1981)年在研究多音天蚕蛾Antheraea polyphemus时，用放射性标记的信息素成分(E,Z)-6,11-hexadecadienyl acetate与触角提取物温育后进行非变性凝胶电泳实验，在雄蛾的触角触角中发现有一类蛋白特异的在信息素敏感的感器中存在，且对性信息素有一定的结合能力，命名为性信息素结合蛋白。

最初对该蛋白的研究主要采用这种放射性标记的方法，利用标记的气味分子研究蛋白对气味分子的结合能力。

由于从昆虫触角中得到的气味结合蛋白量较少，测定自然OBP的结合活性有一定的难度，而由于OBPs除了二硫键的形成，不经过翻译后的修饰过程，实验证明还异源表达的蛋白与天然蛋白二硫键构成配对相同(Calvello 等，2003)，因此在异源系统中表达蛋白纯化后可以满足下一步的需要，进行结合实验，对于了解OBP的功能起到了重要的推动作用。

由于放射性配体和蛋白之间的结合是共价键的作用，在电泳过程中可能会解离，因此不能对结合的配体进行定量或者不能很好的反映实际的结合特征，而且放射性配基的标记复杂、昂贵，不适合对大量的气味分子的结合能力的研究，其不安全性也是其在应用中得到了限制。

后来荧光结合测定方法引入对昆虫OBPs的研究中来分析蛋白可能的配体及对不同配体的结合能力。

这种方法简单、快捷、安全，不需要对要分析的不同的气味分子进行额外的处理，因此得到了更广泛的应用。

当没有合适的荧光探针用于荧光结合实验时，可以采用蛋白中的色氨酸自发的内源荧光来监测配体的特征，前提是该氨基酸位于蛋白的结合腔内，且和配体的相互作用影响其荧光的变化。

通过蛋白结合腔内色氨酸的内源荧光的淬灭效应来检测蛋白对不同的气味分子的结合能力。

常用的探针分子有1-aminoanthracene(1-AMA)、N-phenyl-1-naphthylamine (1-NPN)、8-Anilino-1- naphthalene-sulphonic acid (ANS)和12-(9-Anthroyloxy)-stearic acid (ASA)，其结构及波谱特征见下图(Pelosi等，2006)
图2 昆虫OBP结合实验中常用探针的机构以及光谱特性
5. 气味结合蛋白的表达时间及其代谢
对舞毒蛾的试验表明，PBP和GOBP的合成始于约羽化前3天，在接下来的2d内达到很高浓度并保持到成虫死亡(Vogt等，1989)。

当成虫发育完成时，PBP的产生不会停止，在生活期内也会继续产生，并且PBP的含量在一个较高水平保持不变，肯定存在某种机制分解PBP(Steinbrecht等，1992)。

PBP在体内遵循经典的蛋白质合成途径，即在毛原和膜原细胞的内质网上合成，经高尔基体运送到致密颗粒体，最后在颗粒体中进行浓缩，因此许多颗粒体标记较重。

免疫化学标记和电镜观察表明，PBP有几种可能的降解途径，首先，在毛原细胞和膜原细胞中，被膜内陷、被膜小泡和溶酶体可能参与PBP的降解；其次，鞘膜原细胞没有完整的蛋白合成器官，不可能合成PBP，它被标记表明可能参与了PBP的降解作用；第三，感受细胞有时也被标记，但其中的内质网和高尔基体从不被标记，不可能合成PBP，很可能参与PBP的降解作用；最后，在纤毛结构下的内树突中发现了大量被标记的内吞凹陷和小泡，许多泡状小体(已知作为内吞器官)被标记，它们在嗅觉感受细胞的内树突中含量丰富，而在机械感受器中含量很少，可能参与了降解作用(Ljungberg等，1993)。

5. 气味结合蛋白的生理功能
毫无疑问，OBP多在昆虫触角中表达，而且表达量很高，这在昆虫对外界气味的感受中起重要作用（Kim and Smith，2001）。

其作用可能和哺乳动物味觉器官中的Von Ebner’s gland 蛋白类似。

到目前为止，只建立了一个气味结合蛋白缺失突变体，这种果蝇突变体对包括乙醇、丙醇、丁醇和苯乙醛的一组气味有不正常的短时间和长时间的嗅觉行为反应(Kim等，1998；Wang等，2001)。

而将野生型的拷贝引入突变体后，缺失会完全回复(Kim等，1998；Wang等，2001)。

以上证据表明，OBPs在昆虫嗅觉中起很重要的作用，但这种蛋白所扮演的生化角色还不清楚(Kathleen等，2001)。

目前虽然对昆虫和脊椎动物的OBPs的生理功能知之甚少(Park等，2000)，但最近的研究结果仍可概括为以下几点：
(1)OBP在亲水性的淋巴液中作为脂溶性气味分子的溶剂和载体
OBP可作为疏水性气味分子的载体，使其到达嗅觉感受器的树突膜，并免受感受器内酶的降解。

在对多种昆虫PBP的研究中，提出了PBP起着运载外激素和使之失活的双重作用的观点，生物化学的研究也为这种观点提供了支持，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以看到两条PBP条带，两者之间仅仅是二硫键的数目不同，是同一蛋白的两种不同的异构形式，从PBP中有6个保守的丝氨酸残基推测，这种蛋白可能不止一种稳定的三级结构。

动力学研究进一步证明了被标记的性信息素首先结合的是还原型的PBP，性信息素同受体膜结合后，PBP
从还原型变成氧化型，氧化型的PBP同气味分子结合使刺激迅速失活。

因此，PBP的还原形式可能作为载体运转性信息素，为树突膜上的受体提供结合配体，而氧化形式的PBP性信息素复合物不再刺激感受细胞，受体介导PBP性信息素复合物可能是刺激失活的第一步。

(2)通过选择性结合一定类别的气味分子，OBP在气味识别中起着外周滤器的作用
免疫细胞化学研究表明嗅觉毛和PBP与GOBP分布之间存在高度相关性，PBP主要存在于毛形感受器中，而GOBP主要存在于锥形感受器中，两者从不存在于同一感受器中，即使是同一种类的性信息素感受器的感觉毛，也具有不同的PBP，这种分布与其功能相适应。

亲和标记性信息素表明，不同种PBP与不同的性信息素表现出专一性结合，PBP和GOBP对配体的选择性具有普遍性，因此，OBP在化学刺激物的运输和识别过程中还起着滤器的作用，使到达受体的刺激性化学物的种类减少。

(3)OBP使刺激分子通过特殊的途径到达受体蛋白，使信号传导更易于进行
(4)OBP可能清除外周感受器中不需要的或有毒物质
(5)气味分子刺激受体后，OBP迅速地使其失活
通过对PBP的研究提出了性信息素分子是经亲脂性孔道穿过淋巴液到达树突上受体的观点。

受体分子受刺激后，PBP在几秒内迅速与性信息素结合使之失活，然后通过酯酶和谷胱甘肽转移酶等降解清除。

整个过程涉及到气味结合蛋白(OBPs)、嗅觉受体(olfactory receptors，ORs)、气味降解酶(odor degrading enzymes，ODEs)等这一蛋白集团(Nikonov等，2001；Vogt等，2002)。

参考文献
1．娄永根，程家安. 昆虫的化学感觉机理. 生态学杂志，2001 20 (2)：66-69
2．王桂荣，郭予元，吴孔明.. 昆虫触角气味结合蛋白的研究进展. 昆虫学报，2002,45 (1)：131-137.
3. 黄恩炯，郭晓霞，赵彤言.昆虫嗅觉反应机理的研究进展[J].寄生虫与医学昆虫学报，
2008,15(2)：115-119
4. 钱荷英，徐安英. 2007.昆虫信息素结合蛋白研究进展[J].安徽农学通报，13 (23)：128-130 5．巩中军，周文武，祝增荣，程家安. 2008.昆虫嗅觉受体的研究进展[J].昆虫学报，51(7):-761-768
6. 穆兰芳，董双林，修伟明. 2005. 无脊椎动物是怎样感受外界化学信号的? 自然杂志，26
(5) : 3052309.
6. Pelosi P., Zhou JJ., Ban LP., Calvello M., 2006. Soluble proteins in insect chemical
communication. Cell. Mol. Life. Sci., 63: 1658-1676.
7. Bianchet M, Bains G, Pelosi P, Pevsner J, Snyder S, Monaco H, Amizel M. 1996. The three
dimersional structure of bovine odorant binding protein and its mechanism of odor recognition. Nat. Struct. Biol., 3:934-939
8. Breer H. 1990. A novel class of binding proteins in the antennae of the silk moth Antherata
pernyi.Insect Biochemistry., 20(7):735-740
9. Callahan FE, Vogt RG, Tucker ML, Dickens JC, Mattoo AK. 2000. High level expression of “male
specific” pheromone binding protein (PBPs) in the antennae of female noctuiid moths. Insect Biochem Mol Biol., 30:507-504
10.Calvello M., Guerra N., Brandazza A., 2003. Soluble proteins of chemical communication in the
social wasp polistes dominulus. Cell. Mol. Life. Sc., 60:1933-1943
12Horst R, Damberger F, Luginbuhl P, 2001. NMR structure reveals intramolecular regulation mechanism for pheromone binding and release. PANS, 98(25): 14374-14379
13Ikematsu M, Takaoka D, Yasuda M, 2005. Odorant binding initially occurring at the central pocker in bovine odorant-binding protein. Biochemical and Biophysical Research Communications., 333: 1227-1233
14Jin X, Brandazza A, Navarrini A, Ban L, Zhang S, Steinbrecht R.A., Zhang L, Pelosi P., 2005.
Expression and immunolocalisation of odorant-binding and chemosensory proteins in locusts.
Cell. Life. Sci. 62: 1156-1166
15.Lee D, Damberger F.F, Peng G, 2002. NMR structure of the unliganded Bombyx mori
pheromone-binding protein at physiological pH. FEBS Lett, 531:314-318
16.Pelosi P, Maida R. 1995. Odorant-binding proteins in insects. Comp. Biochem. Physiol.,
111(3):503-514
17.Zhou Jing-jiang, Huang Wensheng, Zhang Guo-An, Pickett J. A., Field L. M.,2004. “Plus-C”
odorant-binding protein genes in two Drosophila species and the malaria mosquito Anopheles gambiae. Gene., 327: 117-129。