生物化学思考题
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2、Folin 酚试剂中，Folin 酚甲和 Folin 酚乙在反应中各
起什么作用？见书
1、请分析，总结考马斯亮蓝染色法测定蛋白含量的优缺
点和操作注意事项？优点：染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高。
缺点：每次测量都得重新绘制标准曲线。 注意事项： 1、每次测量吸收值都应用 0 号试管中的溶液去校准，以免后面的结果偏差过大。 2、0 号试管起空白对照的作用，消除一定的系统误差。 3、6、7 号实验的关键，它们之间的吸收值应非常接近，误差保持在 10%的范围内。如果误 差超过这个范围，则实验宣告失败。
2、请列表从实验原理、操作方法、标准品使用量、线性关
系好坏比较微量凯氏定氮法、双缩脲法、Folin 法、考马斯亮
蓝染色法、紫外分光光度法测定蛋白质含量的优、缺点。
方法 灵敏度 时间
原理
干扰物质
说明
紫外吸收
50～
法
100mg，
快速
5～10分 钟
蛋白质中的 酪氨酸和色 氨酸残基在 280nm 处的
光吸收
普通 BCA 为
20～ 200mg,
微量 BCA 为
较快速 40分钟内
在碱性环境 下蛋白质与 Cu2+络合并 将 Cu2+还原
成 Cu1+
螯合剂；略 高浓度的 还原剂
0.5～ 10mg
抗干扰能力强，
思考题
1、请列表从检测原理、样品测定范围、标准品使用浓度与
消耗量、检测结果准确性、操作难易程度、测定方法的局限
性与应用等方面，对双缩脲法与 Folin 酚法测定蛋白含量
的方法进行分析归纳总结。folin 酚试剂法测定蛋白质含量是最灵敏的方
法之一。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即 Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色 反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还 原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的 量成正比。 这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多。缺点是费时间较长，要精 确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较 多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰 folin-酚反应（Lowry 反应）。
将蛋白氮转 化为氨，用 酸吸收后滴
定
各种铵盐
用于标准蛋白质含 量的准确测定；无 法区别含氮化合物
干扰；费时长
Folin－ 酚试剂 法,, , （Lowry 法）
～5mg
Βιβλιοθήκη Baidu慢速
40～60分 钟
双缩脲反 应；磷钼酸 －磷钨酸试 剂被 Tyr 和
Phe 还原
铵盐；Tris 缓冲液；甘 氨酸；各种
硫醇
耗费时间长；操作 要严格计时；颜色 深浅随不同蛋白质 变化; 标准曲线不 是严格的直线形 式，且专一性差
双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。双缩脲试剂是一个碱性的含铜 试液，呈蓝色，由 1%氢氧化钾、几滴 1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。当底物中含 有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。可通过比色法分析 浓度，在紫外可见光谱中的波长为 540nm。鉴定反应的灵敏度为 5-160mg/ml。
各种嘌吟 和嘧啶；各 种核苷酸
测定准确度较差， 干扰物质较多
双缩脲法 （Biuret
法）
1～20mg
中速
20~30分 钟
多肽键＋碱 性 Cu2＋ 紫色络合物
铵盐；Tris 缓冲液：
某些氨基 酸
用于快速测定，但 不太灵敏；不同蛋
白质显色相似
凯氏定氮 法
（Kjedah l 法）
1～5mg，
费时
8～10小 时
考马斯亮 蓝法
(Bradfor d 法)
1～5mg,
快速
5～15分 钟
考马斯亮蓝 染料与蛋白 质结合时， 其 lmax 由 465nm 变为
595nm
强碱性缓 冲液； TritonX-1
00;
SDS
较好的方法；干扰 物质少；颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋 白质变化; 标准曲 线有轻微的非线性
BCA 法
起什么作用？见书
1、请分析，总结考马斯亮蓝染色法测定蛋白含量的优缺
点和操作注意事项？优点：染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高。
缺点：每次测量都得重新绘制标准曲线。 注意事项： 1、每次测量吸收值都应用 0 号试管中的溶液去校准，以免后面的结果偏差过大。 2、0 号试管起空白对照的作用，消除一定的系统误差。 3、6、7 号实验的关键，它们之间的吸收值应非常接近，误差保持在 10%的范围内。如果误 差超过这个范围，则实验宣告失败。
2、请列表从实验原理、操作方法、标准品使用量、线性关
系好坏比较微量凯氏定氮法、双缩脲法、Folin 法、考马斯亮
蓝染色法、紫外分光光度法测定蛋白质含量的优、缺点。
方法 灵敏度 时间
原理
干扰物质
说明
紫外吸收
50～
法
100mg，
快速
5～10分 钟
蛋白质中的 酪氨酸和色 氨酸残基在 280nm 处的
光吸收
普通 BCA 为
20～ 200mg,
微量 BCA 为
较快速 40分钟内
在碱性环境 下蛋白质与 Cu2+络合并 将 Cu2+还原
成 Cu1+
螯合剂；略 高浓度的 还原剂
0.5～ 10mg
抗干扰能力强，
思考题
1、请列表从检测原理、样品测定范围、标准品使用浓度与
消耗量、检测结果准确性、操作难易程度、测定方法的局限
性与应用等方面，对双缩脲法与 Folin 酚法测定蛋白含量
的方法进行分析归纳总结。folin 酚试剂法测定蛋白质含量是最灵敏的方
法之一。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即 Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色 反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还 原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的 量成正比。 这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多。缺点是费时间较长，要精 确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较 多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰 folin-酚反应（Lowry 反应）。
将蛋白氮转 化为氨，用 酸吸收后滴
定
各种铵盐
用于标准蛋白质含 量的准确测定；无 法区别含氮化合物
干扰；费时长
Folin－ 酚试剂 法,, , （Lowry 法）
～5mg
Βιβλιοθήκη Baidu慢速
40～60分 钟
双缩脲反 应；磷钼酸 －磷钨酸试 剂被 Tyr 和
Phe 还原
铵盐；Tris 缓冲液；甘 氨酸；各种
硫醇
耗费时间长；操作 要严格计时；颜色 深浅随不同蛋白质 变化; 标准曲线不 是严格的直线形 式，且专一性差
双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。双缩脲试剂是一个碱性的含铜 试液，呈蓝色，由 1%氢氧化钾、几滴 1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。当底物中含 有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。可通过比色法分析 浓度，在紫外可见光谱中的波长为 540nm。鉴定反应的灵敏度为 5-160mg/ml。
各种嘌吟 和嘧啶；各 种核苷酸
测定准确度较差， 干扰物质较多
双缩脲法 （Biuret
法）
1～20mg
中速
20~30分 钟
多肽键＋碱 性 Cu2＋ 紫色络合物
铵盐；Tris 缓冲液：
某些氨基 酸
用于快速测定，但 不太灵敏；不同蛋
白质显色相似
凯氏定氮 法
（Kjedah l 法）
1～5mg，
费时
8～10小 时
考马斯亮 蓝法
(Bradfor d 法)
1～5mg,
快速
5～15分 钟
考马斯亮蓝 染料与蛋白 质结合时， 其 lmax 由 465nm 变为
595nm
强碱性缓 冲液； TritonX-1
00;
SDS
较好的方法；干扰 物质少；颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋 白质变化; 标准曲 线有轻微的非线性
BCA 法