实验 高效液相色谱法讲解

3
0.05 1672944 0.05
4
0.1
3392191
0.1
5
0.2
6741197
0.2
A山梨酸
0 734303 1473579 2907282 5909618 11767460
糖精钠 (mg/mL)
0 0.025 0.05 0.1 0.2 0.4
A糖精钠
0 549756 1127033 2246299 4599025 9167288
3.测定
色谱条件: 色谱柱:C18 ,4.6mm×150mm; 流动相: 甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液(5+95); 流速:1ml/min 检测波长:230nm
取样品处理液和标准系列溶液各10μl注入高效 液相色谱仪进行分离,以其标准溶液峰的保留时 间为依据进行定性。以标准溶液的浓度为横坐标, 相应的峰面积为纵坐标,分别绘制标准曲线(或计 算回归方程),从标准曲线上查出(或根据回归方程 求出)样液中被测物质的含量,按下式计算:
Cx
?
C ? V0
?V
式中:
Cx为样品中被测物的含量,g/kg C 为在标准曲线上查得的相对应的糖
精钠、苯甲酸、山梨酸的含量,mg/ml
V0 为样品定容体积,ml V 为取样体积,ml
[ 思考题]
1.为什么被测溶液需要除去二氧化碳? 2.采用230nm为测定波长,对样品中山梨酸 的测定有何影响？
pH 计的使用
1.插好电极,打开电源开关 ,按模式键切换到 pH测量状态 2.用两点法进行校正 (b=2)(pH 4.01,6.86,9.18) 3.按模式进入 b=2 4.将电极浸入标准缓冲液中 (pH=6.86), 按“校正” ,当到达
终点时显示屏上显示相应校正结果 ;将电极放入第二种 标准缓冲液(pH=4.01 或9.18),按“校正” ,当到达 终点时 显示屏上显示相应校正结果 ;按“读数” ,保存校正结果 并退回到正常的测量状态 5.将电极插入到被测液中 ,调节pH到所需值
高效液相色谱法测定饮料中山 梨酸、苯甲酸和糖精钠
[ 目的与要求]
1.掌握高效液相色谱法测定饮料中糖精 钠、苯甲酸和山梨酸的原理和方法
2.熟悉高效液相色谱仪的使用方法 3.了解高效液相色谱仪的仪器结构
[ 方法原理]
在适宜的条件下 ,高效液相色谱可同时分离饮料中 的糖精钠、苯甲酸、山梨酸。样品 超声除去二氧化碳和 乙醇,调pH至近中性 ,过滤后进高效液相色谱仪 ,经反相 C18 液相色谱分离后 ,紫外检测器 230nm波长处检测。
(2)脱气： 除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡
气泡对测定的影响： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动
A.示差折射率检测器
*使折射率变化
B.UV检测器（200nm以下） *溶解氧气有吸收
C. 荧光检测器
*溶解氧气有消光作用
编号
01 2
3 45
标混液(ml) 0.00 1.25 2.5 5 10 20
蒸馏水(ml) 50.0 48.75 47.5 45 40 30
混合标样中各物质的浓度
标混号 0
苯甲酸 (mg/mL)
0
A苯甲酸 0
山梨酸 (mg/mL)
0
1
0.0125 438087 0.0125
2
0.025 853079 0.025
前处理
(1)过滤：0.45um或更小孔径滤膜
目的： 除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤 其是使用无机盐配制的缓冲液。
滤Baidu Nhomakorabea类型：
聚四氟乙烯滤膜： 适用于所有溶剂，酸和盐 醋酸纤维滤膜： 不适用于有机溶剂，特别适用于水溶剂 尼龙 66滤膜： 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以 用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜： 同样适用于水溶性样品和有机溶剂
糖精钠标准储备溶液 (10.0mg/ml): 准确称取于 120℃烘干4h后的糖精钠
(C6H4CONNaSO 2·2H2O)0.5000g, 加水溶解 后定容至 50ml 苯甲酸标准储备溶液 (5.0mg/ml):
准确称取0.2500g, 加碳酸氢钠溶液 25ml,加热溶解, 定容至 50ml 山梨酸标准储备溶液 (5.0mg/ml):
[ 注意事项]
1.流动相使用前必须经过脱气。如果流动相中含 有气体,在较高的柱压下会产生气泡,使流动相流 动受阻,对分离样品产生不利影响
2.应通过预实验调整和最后确定流动相实际配比, 以使各分析组分的分离效果最佳
3.被测溶液pH值对测定和色谱柱使用寿命均有 影响,以中性为宜
4.苯甲酸、糖精钠的灵敏波长为230nm,山梨酸灵 敏波长为254nm,在此波长测定时苯甲酸和糖精钠 的灵敏度较低,因此采用230nm为测定波长
样品
苯甲酸
山梨酸
糖精钠
标准曲线方程 Y=3×107X-55.2 Y=6×107X-37513 Y=2×107X-53409
r
1
1
1
线性范围(mg/mL)
0～0.2
0～0.2
0～0.4
[ 操作步骤]
1.样品处理:吸取10.00～20.00ml汽水,放入50ml烧 杯中, 超声除去二氧化碳,用稀氨水调pH7.0,加水定 容至50ml,用滤膜(0.45μm)过滤,备用。
准确称取0.2500g山梨酸,加碳酸氢钠溶液 25ml,加热溶 解 ,定容至 50ml 标准混合使用液
(含糖精钠1.0mg/ml, 苯甲酸0.5mg/ml,山梨酸0.5mg/ml): 准确吸取各标准储备溶液 5.0ml,加水定容至 50ml
2.配制标准系列: 取9只50ml容量瓶分别编 上号码,按下表配制标准系列。
以色谱峰的 保留时间 定性,利用色谱峰面积 在一定 范围内与浓度呈线性关系进行 定量
[ 仪器与试剂]
1.仪器: 高效液相色谱仪 ,配备二极管阵列检测器 ; 超声波清洗仪 ; 50ml 容量瓶 ;50ml 烧杯;50μ l微量进样器
2.试剂: 稀氨水(1+1);碳酸氢钠溶液 :20g/L;甲醇(色谱纯)
溶剂前处理-脱气
1. 吸气器法（流动相抽滤） *可以抑制制做流动相时产生的气泡 *只是暂时的脱气法 *不能解决因溶解气体造成的问题
2. 超声脱气法 3. 使用氟树脂膜的减压脱气法
溶剂前处理 -脱气
★使用超声波震荡器，一般超声震荡 15 分钟左右 ★注意流动相在超声震荡脱气过程中，温度会升