PCR扩增检测乙肝病毒ppt课件
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乙型肝炎病毒PPT幻灯片课件
12
(1)表面抗原(HBsAg)
1)存在于三型颗粒中；
2)是HBV感染的主要标志；
3)可刺激产生：抗-HBs—保护性抗体 和细胞免疫应答
制备疫苗
4)分亚型
抗原表位：a, d/y, w/r;
亚型：adr(汉)、adw(少数民族)、ayr、ayw；
5)抗-HBs：有免疫力；
13
PreS1Ag、PreS2Ag
DND多聚酶等
6
(2)小球形颗粒
小球形颗粒：直径：22nm，中空颗 粒。为过剩的表面抗原，无DNA。
(3)管形颗粒
管形颗粒：由小球形颗粒聚集而成。
7
2.HBV基因结构与功能1)HBV基因结构：
不完全双链环状DNA 长链(负股)：3200核苷酸
短链(正链)：50~100% 粘性末端：5′-250个核苷
4
(1)大球形颗粒(Dane颗粒)
大球形颗粒：有感染性的完整的病毒颗粒。 直径：42nm 外层=包膜：脂质双层+HBsAg、
PreS1Ag、 PreS2Ag
主蛋白：HBsAg（226） 中蛋白：HBsAg-PreS2Ag（281） 大蛋白：HBsAg-PreS2Ag-PreS1Ag（400）
5
内层=衣壳：20面体、27nm 衣壳蛋白：HBcAg+ HBeAg 核心：不完全双链环状DNA、
1)具有吸附表位；
2)与病毒的复制有关---病毒复制指标；
3)可刺激产生：抗- PreS1
抗- PreS2：
阻断结合
见与急性肝炎恢复期的早期，
提示HBV正在或已经清除；
4)抗-PreS1：较长
抗-PreS2：急性期血清，持续时间仅2~3个月；
14
(1)表面抗原(HBsAg)
1)存在于三型颗粒中；
2)是HBV感染的主要标志；
3)可刺激产生：抗-HBs—保护性抗体 和细胞免疫应答
制备疫苗
4)分亚型
抗原表位：a, d/y, w/r;
亚型：adr(汉)、adw(少数民族)、ayr、ayw；
5)抗-HBs：有免疫力；
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PreS1Ag、PreS2Ag
DND多聚酶等
6
(2)小球形颗粒
小球形颗粒：直径：22nm，中空颗 粒。为过剩的表面抗原，无DNA。
(3)管形颗粒
管形颗粒：由小球形颗粒聚集而成。
7
2.HBV基因结构与功能1)HBV基因结构：
不完全双链环状DNA 长链(负股)：3200核苷酸
短链(正链)：50~100% 粘性末端：5′-250个核苷
4
(1)大球形颗粒(Dane颗粒)
大球形颗粒：有感染性的完整的病毒颗粒。 直径：42nm 外层=包膜：脂质双层+HBsAg、
PreS1Ag、 PreS2Ag
主蛋白：HBsAg（226） 中蛋白：HBsAg-PreS2Ag（281） 大蛋白：HBsAg-PreS2Ag-PreS1Ag（400）
5
内层=衣壳：20面体、27nm 衣壳蛋白：HBcAg+ HBeAg 核心：不完全双链环状DNA、
1)具有吸附表位；
2)与病毒的复制有关---病毒复制指标；
3)可刺激产生：抗- PreS1
抗- PreS2：
阻断结合
见与急性肝炎恢复期的早期，
提示HBV正在或已经清除；
4)抗-PreS1：较长
抗-PreS2：急性期血清，持续时间仅2~3个月；
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PCR扩增检测乙肝病毒
� 剂 试 要 主. 2
心离转00001�钟分01浴水沸�lμ04液取提
。应反RCP做lμ4液清上取�钟分5
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物合混PTNd种4
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糖脂 琼g8.0 取称
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极负 性 阴V B H
照对性阴VBH
极正
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。钟分03泳电�V05�压稳�”-“接端样点�泳电③
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niahC esaremyloP(应反链酶合聚
′3→′ 5
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照对性阳VBH
孔样点
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荧光定量PCR检测乙肝病毒DNA的临床意义ppt课件
10
九 具体治疗
1. 抗病毒治疗 干扰素治疗 核苷（酸）类似物治疗 (拉米夫定等 ) 免疫调节治疗 其他抗病毒药物及中药治疗 2 其他对症治疗 抗炎保肝治疗 抗纤维化治疗
11
谢谢大家！
12
定量PCR检测乙肝病毒-DNA 的临床意义
1
一、流行病学
HBV感染呈世界性流行，但不同地区HBV感 染的流行强度差异很大。据世界卫生组织 报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中 3.5亿人为慢性HBV感染者，每年约有100 万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和 原发性肝细胞癌 (HCC)
地长期抑制或消除HBV，减轻肝细胞炎症坏死及 肝纤维化，延缓和阻止疾病进展，减少和防止肝 脏失代偿、肝硬化、HCC 及其并发症的发生，从 而改善生活质量和延长存活时间。 慢性乙型肝炎治疗主要包括抗病毒、免疫调 节、抗炎保肝、抗纤维化和对症治疗，其中抗病 毒治疗是关键，只要有适应证，且条件允许，就 应进行规范的抗病毒治疗。
(3) 如ALT <2 ×ULN， 但肝组织学显示Knodell HAI ≥4，或≥G2 炎症坏死。具有(1)并有(2) 或 (3) 的患者应进行抗病毒治疗；对达不到上述治疗 标准者，应监测病情变化，如持续HBV DNA定量 阳性，且ALT 异常，也应考虑抗病毒治疗。
9
八 治疗方案
治疗的总体目标 慢性乙型肝炎治疗的总体目标是：最大限度
5
四 实验室检测方法
一 传统实验室检测方法 1.血清学检测(两对半检测) ①HBsAg②抗-HBs ③HBeAg ④ 抗-HBe ⑤ 抗-HBc
2.肝功能检测(ALT,AST) 二新型实验室检测方法 1.乙肝病毒定量 2.赖药性基因检测 3.乙肝病毒基因分型
九 具体治疗
1. 抗病毒治疗 干扰素治疗 核苷（酸）类似物治疗 (拉米夫定等 ) 免疫调节治疗 其他抗病毒药物及中药治疗 2 其他对症治疗 抗炎保肝治疗 抗纤维化治疗
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谢谢大家！
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定量PCR检测乙肝病毒-DNA 的临床意义
1
一、流行病学
HBV感染呈世界性流行，但不同地区HBV感 染的流行强度差异很大。据世界卫生组织 报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中 3.5亿人为慢性HBV感染者，每年约有100 万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和 原发性肝细胞癌 (HCC)
地长期抑制或消除HBV，减轻肝细胞炎症坏死及 肝纤维化，延缓和阻止疾病进展，减少和防止肝 脏失代偿、肝硬化、HCC 及其并发症的发生，从 而改善生活质量和延长存活时间。 慢性乙型肝炎治疗主要包括抗病毒、免疫调 节、抗炎保肝、抗纤维化和对症治疗，其中抗病 毒治疗是关键，只要有适应证，且条件允许，就 应进行规范的抗病毒治疗。
(3) 如ALT <2 ×ULN， 但肝组织学显示Knodell HAI ≥4，或≥G2 炎症坏死。具有(1)并有(2) 或 (3) 的患者应进行抗病毒治疗；对达不到上述治疗 标准者，应监测病情变化，如持续HBV DNA定量 阳性，且ALT 异常，也应考虑抗病毒治疗。
9
八 治疗方案
治疗的总体目标 慢性乙型肝炎治疗的总体目标是：最大限度
5
四 实验室检测方法
一 传统实验室检测方法 1.血清学检测(两对半检测) ①HBsAg②抗-HBs ③HBeAg ④ 抗-HBe ⑤ 抗-HBc
2.肝功能检测(ALT,AST) 二新型实验室检测方法 1.乙肝病毒定量 2.赖药性基因检测 3.乙肝病毒基因分型
最新浅谈乙肝病毒检测ppt课件
地区的特点和情况，采取特殊政策和灵
④民族团结是实现民族平等的政治基础
A．①③
B．②④
C．①④
D．②③
37
【分析】题干主要反映了民族区域自治制度的优越 性及民族团结的重要性，②③正确且符合题意，故 选D项。①与题意不符，不选；民族平等是实现民 族团结的政治基础，④说法错误，不选。
答案 D
38
•
认为“民族区域自治就是少数民族
自己管理自己”
7.洗涤
洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸 泡时间）
8.显色
每孔加入A、B底物50 μL，混匀，37℃暗置15分钟
9.终止
每孔加50 μL终止液50 μL，混匀
10.测定
酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各空OD值，记 录结果,30分钟内测定完成）
4.结果判定
民族区域自治制度已载入《中华人民共
和国宪法》，成为我国的一项基本政治
制度。坚持民族区域自治制度也是党和
政府坚持依法行事的体现。
31
•
我国民族区域自治制度的优越
性
•
（1）有利于维护国家统一和安全：
民族区域自治是以领土完整、国家统一为
前提和基础的，是国家的集中统一领导与
民族区域自治的有机结合。它增强了中华
自治法所规定的，涉及政治、经济、文化和
社会生活各个方面，但不同于特别行政区的
高度自治权。民族区域自治是以领土完整、
国家统一为前提和基础的。
30
•
④明确实行民族区域自治制度的
原因。首先，实行民族区域自治是适合
我国国情的必然选择，是由我国的历史
特点和现实情况决定的。其次，民族区
乙肝病毒核酸检测实验操作流程ppt课件
主要内容hbvdna的检测原理hbvdna操作流程hbvdna检测结果分析临床意义dna提取pcr扩增标本采集检测原理hbv用一对乙型肝炎病毒特性引物primer和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针配以pcr反应液耐热dna聚合酶taq酶四种脱氧核苷酸单体dntps等成分用pcr体外扩增法定量检测乙型肝炎病毒dna原理图信号强度与结合探针的dna分子数成正比操作流程二
乙肝病毒核酸检测 实验操作流程
广西临床检验中心 唐 娟
.
1
主要内容
➢ HBV-DNA的检测原理
➢ HBV-DNA操作流程
标本采集 DNA 提取
PCR 扩增
➢ HBV-DNA检测结果分析
➢ 临床意义
.
2
检测原理
.
3
HBV ：
用一对乙型肝炎病毒特性引物（Primer）和一 条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反 应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧 核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩 增法定量检测乙型肝炎病毒DNA
吸取上层血清，转移至 1.5ml灭菌离心管
用一次性无菌注射器抽取 受检者静脉血2毫升，注
血 入含EDTA或枸橼酸钠抗凝 浆 剂的试管
的 采
立即轻轻颠倒玻璃管混合 5～10次，使抗凝剂与静
集 脉血充分混匀
5～10分钟后即可分离出 血浆，转移至1.5ml灭菌 离心管
.
7
注意事项
血清血清
尽量吸取血清的上层液，有纤维蛋白的标本应离心去除 脂类浑浊标本拒收 （离心4000rpm，5min）
.
10
注意事项
3.浓缩离心后若出现有“絮状悬浮物”，去上清时应一 并把“絮状悬浮物”吸除，不影响实验结果。如不 吸取絮状悬浮物会导致实验结果偏低。
乙肝病毒核酸检测 实验操作流程
广西临床检验中心 唐 娟
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1
主要内容
➢ HBV-DNA的检测原理
➢ HBV-DNA操作流程
标本采集 DNA 提取
PCR 扩增
➢ HBV-DNA检测结果分析
➢ 临床意义
.
2
检测原理
.
3
HBV ：
用一对乙型肝炎病毒特性引物（Primer）和一 条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反 应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧 核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩 增法定量检测乙型肝炎病毒DNA
吸取上层血清，转移至 1.5ml灭菌离心管
用一次性无菌注射器抽取 受检者静脉血2毫升，注
血 入含EDTA或枸橼酸钠抗凝 浆 剂的试管
的 采
立即轻轻颠倒玻璃管混合 5～10次，使抗凝剂与静
集 脉血充分混匀
5～10分钟后即可分离出 血浆，转移至1.5ml灭菌 离心管
.
7
注意事项
血清血清
尽量吸取血清的上层液，有纤维蛋白的标本应离心去除 脂类浑浊标本拒收 （离心4000rpm，5min）
.
10
注意事项
3.浓缩离心后若出现有“絮状悬浮物”，去上清时应一 并把“絮状悬浮物”吸除，不影响实验结果。如不 吸取絮状悬浮物会导致实验结果偏低。
PCR技术在医学检验中应用PPT
PCR技术在医学检验中应 用
PCR技术是一种用于扩增DNA片段的技术，通过反复进行离子交换、退火和 DNA复制等步骤，可在短时间内从细胞或病原体中快速检测和鉴定特定基因 序列。
什么是PCR技术
PCR技术（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的方法，可以从少量DNA 片段扩增为大量。它由三个关键步骤组成：变性、退火、延伸。
乙肝病毒
PCR技术能够检测乙肝病毒的DNA，及早发现感染者，进行干预治疗，降低乙肝炎的发病 和死亡率。
PCR技术在遗传病筛查中的基因 突变，评估遗传病风险，并提供 遗传咨询和辅助生育建议。
人类基因组计划
分子诊断检测
PCR技术在人类基因组计划中发 挥重要作用，加速研究和理解人 类遗传变异对健康和疾病的影响。
PCR技术的原理
PCR技术的原理基于DNA聚合酶的特殊性质，通过循环反应的方式，在不断调整温度条件下，实现DNA片段 的扩增和复制。
PCR技术在医学检验中的应用
1
疾病诊断
PCR技术可用于检测常见疾病的致病因子，如心血管病、肿瘤、传染病等，为 早期诊断和治疗提供重要依据。
2
个体化治疗
PCR技术能够检测个体基因差异，为临床治疗制定个体化方案，提高疗效和减 少不良反应。
PCR技术作为分子诊断的主要手 段，广泛应用于遗传病和染色体 疾病的检测和诊断。
PCR技术的优势和局限
优势
• 高灵敏度和特异性 • 快速和可靠的结果 • 扩增效率高
局限
• 容易受到污染 • 复杂的试剂和仪器要求 • 对样本质量和处理要求高
结论和要点
PCR技术在医学检验中发挥着重要的作用，可用于疾病诊断、个体化治疗、病毒检测和遗传病筛查。它具有 高灵敏度和特异性，但也存在污染和仪器要求高的局限。
PCR技术是一种用于扩增DNA片段的技术，通过反复进行离子交换、退火和 DNA复制等步骤，可在短时间内从细胞或病原体中快速检测和鉴定特定基因 序列。
什么是PCR技术
PCR技术（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的方法，可以从少量DNA 片段扩增为大量。它由三个关键步骤组成：变性、退火、延伸。
乙肝病毒
PCR技术能够检测乙肝病毒的DNA，及早发现感染者，进行干预治疗，降低乙肝炎的发病 和死亡率。
PCR技术在遗传病筛查中的基因 突变，评估遗传病风险，并提供 遗传咨询和辅助生育建议。
人类基因组计划
分子诊断检测
PCR技术在人类基因组计划中发 挥重要作用，加速研究和理解人 类遗传变异对健康和疾病的影响。
PCR技术的原理
PCR技术的原理基于DNA聚合酶的特殊性质，通过循环反应的方式，在不断调整温度条件下，实现DNA片段 的扩增和复制。
PCR技术在医学检验中的应用
1
疾病诊断
PCR技术可用于检测常见疾病的致病因子，如心血管病、肿瘤、传染病等，为 早期诊断和治疗提供重要依据。
2
个体化治疗
PCR技术能够检测个体基因差异，为临床治疗制定个体化方案，提高疗效和减 少不良反应。
PCR技术作为分子诊断的主要手 段，广泛应用于遗传病和染色体 疾病的检测和诊断。
PCR技术的优势和局限
优势
• 高灵敏度和特异性 • 快速和可靠的结果 • 扩增效率高
局限
• 容易受到污染 • 复杂的试剂和仪器要求 • 对样本质量和处理要求高
结论和要点
PCR技术在医学检验中发挥着重要的作用，可用于疾病诊断、个体化治疗、病毒检测和遗传病筛查。它具有 高灵敏度和特异性，但也存在污染和仪器要求高的局限。
实验三PCR扩增制备目的基因PPT课件
生物信息学分析
利用生物信息学软件对PCR产 物进行序列比对、基因注释、
结构预测等分析。
结果解读与讨论
目的基因扩增成功与否
杂带和引物二聚体的处理
根据电泳结果判断目的基因是否成功扩增 ，如果没有扩增出目的基因或扩增效果不 佳，需要检查实验条件和引物设计。
如果电泳结果显示有杂带或引物二聚体， 需要优化PCR条件或重新设计引物，以确保 获得更纯净的目的基因产物。
10×PCR Buffer
04 提供PCR反应所需的离子环境
。
DNA模板
05 含有目的基因的DNA片段。
去Hale Waihona Puke 子水稀释PCR反应体系。06
设计引物
01
02
03
04
引物设计原则
选择合适的引物，确保引物与 目的基因的特异性结合，避免
非特异性扩增。
引物长度
通常为15-30个碱基。
引物序列
根据目的基因序列，利用引物 设计软件进行设计。
pcr 技术的应用领域
01
02
03
遗传疾病的诊断
通过PCR技术可以检测出 人类基因突变，从而对遗 传疾病进行诊断。
病原微生物检测
PCR技术可以快速、准确 地检测出细菌、病毒等病 原体，为疾病预防和控制 提供有力支持。
基因克隆和表达
通过PCR技术可以克隆出 目的基因，并在体外进行 表达和纯化，为基因工程 研究和应用提供基础。
05
pcr 扩增实验结果分析
结果分析方法
琼脂糖凝胶电泳
通过观察电泳结果，判断PCR 产物的大小是否与预期一致， 并判断是否有杂带或引物二聚
体。
测序验证
将PCR产物进行测序，与预期 的基因序列进行比对，验证 PCR产物的准确性。
利用生物信息学软件对PCR产 物进行序列比对、基因注释、
结构预测等分析。
结果解读与讨论
目的基因扩增成功与否
杂带和引物二聚体的处理
根据电泳结果判断目的基因是否成功扩增 ，如果没有扩增出目的基因或扩增效果不 佳，需要检查实验条件和引物设计。
如果电泳结果显示有杂带或引物二聚体， 需要优化PCR条件或重新设计引物，以确保 获得更纯净的目的基因产物。
10×PCR Buffer
04 提供PCR反应所需的离子环境
。
DNA模板
05 含有目的基因的DNA片段。
去Hale Waihona Puke 子水稀释PCR反应体系。06
设计引物
01
02
03
04
引物设计原则
选择合适的引物，确保引物与 目的基因的特异性结合，避免
非特异性扩增。
引物长度
通常为15-30个碱基。
引物序列
根据目的基因序列，利用引物 设计软件进行设计。
pcr 技术的应用领域
01
02
03
遗传疾病的诊断
通过PCR技术可以检测出 人类基因突变，从而对遗 传疾病进行诊断。
病原微生物检测
PCR技术可以快速、准确 地检测出细菌、病毒等病 原体，为疾病预防和控制 提供有力支持。
基因克隆和表达
通过PCR技术可以克隆出 目的基因，并在体外进行 表达和纯化，为基因工程 研究和应用提供基础。
05
pcr 扩增实验结果分析
结果分析方法
琼脂糖凝胶电泳
通过观察电泳结果，判断PCR 产物的大小是否与预期一致， 并判断是否有杂带或引物二聚
体。
测序验证
将PCR产物进行测序，与预期 的基因序列进行比对，验证 PCR产物的准确性。
乙肝丙肝实验室检测及临床意义PPT课件
丙型肝炎抗体测定（ Anti-HCV）
血浆/血清/全血 250403014 20元 酶免
每天上午10：00前样本当天可出报告，10:00后样本第二天下午 出报告
HBV 血清学检测
HBV DNA检测
HBeAg
HCV RNA检测
HBV DNA 分子检测 HBV DNA 定量检测
HBV 耐药突变株检测
③ PCR检测结果与其它检测 项目不同，一般量值变化 在一个数量级内均视为没 有变化
乙型肝炎病毒(HBV)DNA检测意义
缩短“窗口期”，有利于感染的早期诊断
HBV感染后至血液中出现可检出的HBsAg或HBV特异抗体需要一定时间。
HBV DNA先于 HBsAg出现于外周
血循环中 实时荧光定量PCR检
HBeAg
HCV RNA检测
表面抗原 (HBsAg) e 抗原(HBeAg) 表面抗体(抗-HBs) e抗体(抗-HBe)
HBV血清学检测——乙肝两对半
+ 定性（qualitative） 判断阴阳性
+ 定量（quantitative） 单位：ng/ml、IU/ml、IU/L、PEIU/ml
定性-乙肝“两对半”
HBV DNA高精度检 全血、血清、血浆 促凝管 4℃ 测
每周一、周四10:30 前样本，15:00出报 告
每周四11:00前样本 ，当日16:30出报告
HCV RNA检测 全血、血清、血浆 促凝管 4h内送 每周三10:00前样本
至实验室
，15:00出报告
HBV耐药基因检测 全血、血清、血浆 促凝管 4℃
－
－
接种疫苗获得免疫力
相关检验项目详情
检验科（84005）
检测
最新乙型肝炎血清学和分子生物学检测技术PPT课件
现 健康携带者 慢性乙肝，病毒长期携带 HBV近期感染，恢复期 HBV既往感染，已恢复 乙肝疫苗接种
HBs 抗A HB gs
+
﹣
+
﹣
﹣﹣
抗-HBc IgG IgM
﹣﹣ ++ ﹣+
﹣ ﹣+﹣
+
﹣ + +/-
+
-
+ +/-
﹣
+
+ +/-
﹣ +/- +﹣ ﹣
﹣
+ ﹣﹣
HBe A 抗-HBe g
+/﹣ ﹣
+
➢HBV耐药突变的检测
HBV基因型/基因亚型
病
疾病进展
临床表现
对
毒
干耐
基
扰药
因
素变
HBV DNA
HBeAg
(HCC) (LC)
突 变
急 性 乙 型 肝 炎
慢 性 乙 型 肝 炎
肝
肝细 硬胞 化癌血
清 学 转 换
生 化 学 改 善
清 除
应异 答
21
血清与资料收集 HBV DNA 提取
乙肝病毒基因分析技术路线
干燥和洁净。
其它注意事项
▪ 避免在有挥发性物质及次氯酸类消毒剂（如84消毒液） 的环境下操作。
▪ 加液时须用加样器，并经常校对加样器的准确性。加入不 同样品或不同试剂组分时，应更换加样器吸头和加样槽。
▪ 封板膜不能重复使用，以防出现交叉污染。 ▪ 所用样品，废液和废弃物都应按传染物处理，终止液为硫
抗-HBc IgM 通常在出现症状时即可检出，一般持续约6个月，提 示HBV 复制，是急性感染的重要指标，也是慢性活动性肝炎的重 要标志
HBs 抗A HB gs
+
﹣
+
﹣
﹣﹣
抗-HBc IgG IgM
﹣﹣ ++ ﹣+
﹣ ﹣+﹣
+
﹣ + +/-
+
-
+ +/-
﹣
+
+ +/-
﹣ +/- +﹣ ﹣
﹣
+ ﹣﹣
HBe A 抗-HBe g
+/﹣ ﹣
+
➢HBV耐药突变的检测
HBV基因型/基因亚型
病
疾病进展
临床表现
对
毒
干耐
基
扰药
因
素变
HBV DNA
HBeAg
(HCC) (LC)
突 变
急 性 乙 型 肝 炎
慢 性 乙 型 肝 炎
肝
肝细 硬胞 化癌血
清 学 转 换
生 化 学 改 善
清 除
应异 答
21
血清与资料收集 HBV DNA 提取
乙肝病毒基因分析技术路线
干燥和洁净。
其它注意事项
▪ 避免在有挥发性物质及次氯酸类消毒剂（如84消毒液） 的环境下操作。
▪ 加液时须用加样器，并经常校对加样器的准确性。加入不 同样品或不同试剂组分时，应更换加样器吸头和加样槽。
▪ 封板膜不能重复使用，以防出现交叉污染。 ▪ 所用样品，废液和废弃物都应按传染物处理，终止液为硫
抗-HBc IgM 通常在出现症状时即可检出，一般持续约6个月，提 示HBV 复制，是急性感染的重要指标，也是慢性活动性肝炎的重 要标志
PCR扩增技术ppt课件
.
PCR仪
凝胶成像系统
.
三. 实验方法
１．向无菌的200μl Eppendorf管中依次加入以下溶液
反应物
体积
10×buffer
2.5μl *5 12.5
4×dNTP(1mM) 2.5μl *5 12.5
无菌水
18μl *5
90
Taq酶 (1U/l)
0.5μl *5
2.5
混合，吸取24.5μl
引物 上
0.5μl *5
2.5
引物 下
0.5μl *5
2.5
模板ＤＮＡ (20ng) 0.5μl
总体积
25μl
.
2. 反应体系混匀，离心 3. 在ＰＣＲ仪上按以下方式循环
９4℃变性 5分钟 ９4℃变性 45秒 30个循环 55℃退火 45秒 72℃延伸 1分钟 ７２℃延伸反应10分钟。 4. 取5μl反应液加4μl Loading buffer在１.５％琼脂糖凝胶上120伏，电 泳2小时。 5. 在凝胶成像系统上观察记录实验结果
ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ， 引物和４种脱氧核苷酸存在的条件 下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物 和模板ＤＮＡ结合的特异性。 反应分三步：①变性（denaturation）；② 退火（annealing）；③延伸（ex tension），反应过程见图。
.
模板ＤＮＡ在９４℃条件下变性形成单链； 在５ ５℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分 别与其同源序列结合；７０℃下在耐热性ＤＮＡ 聚合酶Taq 酶催化下， 在４种dNTP存在条件下 延伸形成双链。完成一次循环。 接着又以新合成 的ＤＮＡ为模板进行同样反应，如次往复循环30 次，由于每次循环目标ＤＮＡ都以２n次幂扩增， ３０次循环后目的DNA的量增加１０６－７倍。成 功的ＰＣＲ反应要求反应有很好的特异性和相当 的扩增效率。 要达此目的ＰＣＲ反应要注意以下 问题：
PCR临床应用ppt演示课件
一般不存在于血循环中
HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM
提示HBV处于复制状态
HBeAg：HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良好
.
22
HBV
（二） HBV-DNA与“两对半” 1. “两对半” ：机体的免疫反应状态；
FQ-PCR：检测的是HBV本身的遗传物质—DNA，是 病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。
四 TORCH感染特点与检测
TOX : Toxoplasma gondii
RV:
CMV:
Rubella virus
Human cytomegalovirus
HSV:
Herpes simplex virus
.
51
TORCH
TORCH感染特点
1. 母-胎传播的主要病原体 2. 引起胎儿畸形新生儿缺陷的重要原因 3. 自然状态下呈隐性感染 4. 怀孕、多次输血、AIDS等易发生显性感染 5. 可致多发性、全身性感染 6. 只有风疹可获得长久的免疫力，可用疫苗预防
3. 发病趋势： a. 男性多于女性。 b. 城市走向农村， c. 高收入阶层向低收入阶层扩展
4. 人对淋球菌感染无天然抵抗力，免疫不持 久，再感染和慢性患者普遍存在。
5. 如母亲为淋病患者，婴儿出生时易患上淋球菌性结膜炎
. 32
CT
沙眼衣原体感染与致病
1. 严格的细胞内寄生。 2. 不仅可致眼部感染、肺部感染、也是STD的主要 病原体。 3. 近年来在欧美等国，沙眼衣原体的感染率和危害 性已超过淋球菌而居STD之首。
TB：Tubercle bacilli CP：Chlamydia pneumonia
MP：Mycoplasmal pneumonia
HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM
提示HBV处于复制状态
HBeAg：HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良好
.
22
HBV
（二） HBV-DNA与“两对半” 1. “两对半” ：机体的免疫反应状态；
FQ-PCR：检测的是HBV本身的遗传物质—DNA，是 病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。
四 TORCH感染特点与检测
TOX : Toxoplasma gondii
RV:
CMV:
Rubella virus
Human cytomegalovirus
HSV:
Herpes simplex virus
.
51
TORCH
TORCH感染特点
1. 母-胎传播的主要病原体 2. 引起胎儿畸形新生儿缺陷的重要原因 3. 自然状态下呈隐性感染 4. 怀孕、多次输血、AIDS等易发生显性感染 5. 可致多发性、全身性感染 6. 只有风疹可获得长久的免疫力，可用疫苗预防
3. 发病趋势： a. 男性多于女性。 b. 城市走向农村， c. 高收入阶层向低收入阶层扩展
4. 人对淋球菌感染无天然抵抗力，免疫不持 久，再感染和慢性患者普遍存在。
5. 如母亲为淋病患者，婴儿出生时易患上淋球菌性结膜炎
. 32
CT
沙眼衣原体感染与致病
1. 严格的细胞内寄生。 2. 不仅可致眼部感染、肺部感染、也是STD的主要 病原体。 3. 近年来在欧美等国，沙眼衣原体的感染率和危害 性已超过淋球菌而居STD之首。
TB：Tubercle bacilli CP：Chlamydia pneumonia
MP：Mycoplasmal pneumonia
乙肝病毒(HBV)PCR检测
乙肝病毒（HBV）PCR检测
试剂盒组成
DNA提取液：裂解病毒蛋白外壳，使病毒DNA游离
PCR反应管：含有扩增HBV特异DNA片段的引物、 dNTPs、Taq酶、PCR缓冲液、Mg2＋等，只需加入 模板即可进行扩增反应。
阳性模板：纯化的HBV －DNA，无病毒外壳，无 感染性，直接加入PCR反应管扩增后用作阳性对照。
加好样的PCR反应管放入PCR扩增仪的反应板上， 扩增程序：
（1）93ºC 3分钟 预变性 （2）三步循环：
93ºC 45秒（变性） 55ºC 45秒（复性） 共35个循环 72ºC 1分钟（延伸）
（3）72ºC 保温5分钟 （防止延伸不完整）
3. 电泳检测： 直接取PCR反应产物加入2％琼脂糖凝胶上电泳 20分钟，EB染色后在紫外灯下观察，若在314bp 处（与阳性对照处于同一位置）出现条带，则怀 疑为HBV阳性。
1. 标本处理： 每六人一组，取血清40ul加入0.5离心管，再加入 40ulDNA提取液，沸水浴10分钟，10000rpm离心 5分钟，上清用于扩增反应。
2. PCR反应： 每两人一组 其中一人取一PCR反应管，取1步骤离心后的上清2ul， 加入PCR反应管底层溶液中，6000rpm离心数秒。 另一人取一PCR反应管，取阳性模板2ul加入加入 PCR反应管底层溶液中，6000rpm离心数秒。
扩增人ß – actin特异片段
每两人一组ห้องสมุดไป่ตู้在一0.5离心管中加入以下组分：
模板
4ul
引物
2ul
dNTPs
1ul
Taq酶
0.5ul
10×PCR缓冲液 2.5ul
ddH2O
15ul
（反应体系为25ul）
（所发0.5ml离心管已加好除模板以外的所有组分，请 加入4ul昨日所提取的基因组DNA溶液即可进行扩增）
试剂盒组成
DNA提取液：裂解病毒蛋白外壳，使病毒DNA游离
PCR反应管：含有扩增HBV特异DNA片段的引物、 dNTPs、Taq酶、PCR缓冲液、Mg2＋等，只需加入 模板即可进行扩增反应。
阳性模板：纯化的HBV －DNA，无病毒外壳，无 感染性，直接加入PCR反应管扩增后用作阳性对照。
加好样的PCR反应管放入PCR扩增仪的反应板上， 扩增程序：
（1）93ºC 3分钟 预变性 （2）三步循环：
93ºC 45秒（变性） 55ºC 45秒（复性） 共35个循环 72ºC 1分钟（延伸）
（3）72ºC 保温5分钟 （防止延伸不完整）
3. 电泳检测： 直接取PCR反应产物加入2％琼脂糖凝胶上电泳 20分钟，EB染色后在紫外灯下观察，若在314bp 处（与阳性对照处于同一位置）出现条带，则怀 疑为HBV阳性。
1. 标本处理： 每六人一组，取血清40ul加入0.5离心管，再加入 40ulDNA提取液，沸水浴10分钟，10000rpm离心 5分钟，上清用于扩增反应。
2. PCR反应： 每两人一组 其中一人取一PCR反应管，取1步骤离心后的上清2ul， 加入PCR反应管底层溶液中，6000rpm离心数秒。 另一人取一PCR反应管，取阳性模板2ul加入加入 PCR反应管底层溶液中，6000rpm离心数秒。
扩增人ß – actin特异片段
每两人一组ห้องสมุดไป่ตู้在一0.5离心管中加入以下组分：
模板
4ul
引物
2ul
dNTPs
1ul
Taq酶
0.5ul
10×PCR缓冲液 2.5ul
ddH2O
15ul
（反应体系为25ul）
（所发0.5ml离心管已加好除模板以外的所有组分，请 加入4ul昨日所提取的基因组DNA溶液即可进行扩增）
乙肝病毒的实验室检测(ppt)
Q 3’ 5’
Taq
3’ 5’
Taq
3’ 5’
R 5’
R
Taq
R
Taq
R
l
R
3’
退火
1. 链取代
3’
5’
2. 水 解
3’
5’
3. 聚 合
3’
5’
4. 检测荧光
3’
乙肝病毒的感染
乙肝病毒的感染
（一） 乙型肝炎病毒结构及特点
HBsAg：是HBV感染的主要标志 HBsAb：保护性抗体
HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内，
HBV DNA检测的临床意义
HBV DNA是HBV存在最直接的依据 HBV DNA是HBV复制的标志 HBV DNA是患者具有传染性的标志 HBV DNA对乙肝两对半起补充作用 HBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标 HBV DNA可检测出隐匿性慢性乙型肝炎
PCR检测 HBV HCV HIV
• 每个PCR体系含4种主要成分：含有待扩增序列的DNA模板 、引物、TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核酸三磷酸（dNTP）
荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光 标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过 标准曲线对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始 模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的 核酸测定中最灵敏的方法。
HBV DNA检测的临床意义
提供直接证据缩短“窗口期”
“窗口期” 56 70 22
核酸检测缩短的“窗口期”的天数 6-15 41-60 10-15
有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断
HBV DNA检测的临床意义
调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处于 HBV复制期，具有传染性；也不是所有“小三阳” 的病人HBV都无复制。因此，要准确知道HBV是否 处于复制状态，最准确的方法还是通过检测HBV DNA来决定。
Taq
3’ 5’
Taq
3’ 5’
R 5’
R
Taq
R
Taq
R
l
R
3’
退火
1. 链取代
3’
5’
2. 水 解
3’
5’
3. 聚 合
3’
5’
4. 检测荧光
3’
乙肝病毒的感染
乙肝病毒的感染
（一） 乙型肝炎病毒结构及特点
HBsAg：是HBV感染的主要标志 HBsAb：保护性抗体
HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内，
HBV DNA检测的临床意义
HBV DNA是HBV存在最直接的依据 HBV DNA是HBV复制的标志 HBV DNA是患者具有传染性的标志 HBV DNA对乙肝两对半起补充作用 HBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标 HBV DNA可检测出隐匿性慢性乙型肝炎
PCR检测 HBV HCV HIV
• 每个PCR体系含4种主要成分：含有待扩增序列的DNA模板 、引物、TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核酸三磷酸（dNTP）
荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光 标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过 标准曲线对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始 模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的 核酸测定中最灵敏的方法。
HBV DNA检测的临床意义
提供直接证据缩短“窗口期”
“窗口期” 56 70 22
核酸检测缩短的“窗口期”的天数 6-15 41-60 10-15
有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断
HBV DNA检测的临床意义
调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处于 HBV复制期，具有传染性；也不是所有“小三阳” 的病人HBV都无复制。因此，要准确知道HBV是否 处于复制状态，最准确的方法还是通过检测HBV DNA来决定。
乙型肝炎病毒ppt课件
二、基因组结构和编码蛋白
HBV基因组结构，1979年
• 根据HBV全基因序列差异≥8%或S区基因序列差异≥4%，目 前HBV分为A-H八个基因型。各基因型又可分为不同亚型。 我国主要是B和C。
• IFN治疗HBV应答率：A＞D，B＞C，A、D＞B、C基因型是 否影响核苷类似物的疗效尚未确定。
• 65℃10h、煮沸10min或高压蒸气均可灭活HBV。
如何治疗？
能治愈吗？
★ 目前极少能治愈！ ★ 是可以治疗的！ ★ 病毒DNA整合于宿主肝细
胞染色体
谁需要治疗？
不论是大三阳还是小三阳，有以下情况者均需治疗： ★ 肝功能异常。
★ 有明显的肝炎症状：乏力、厌食、黄疸、肝区隐痛不适 等。
★ HBV DNA＞103copy/ml)
抗病毒：目前尚无一种能迅速、直接杀死清除乙肝病毒的 药物，最好的抗病毒药物疗效也仅能达到50％左右。目前 国际医学界公认的治疗慢性乙肝有确切疗效的抗病毒药物 主要有两大类： 干扰素：重组人α-1b干扰素、α- 2a、 α-2b干扰素等。 核苷类似物：拉米夫定、阿德福韦。
PCR反应过程
3’
5’
5’
3’
Primers
d.NTPs
Taq 酶
反应组分
变
性
3’ 5’
3’
Taq
5’
3’
退
火
5’
Taq
延
伸
3’
重
复
3’ 3’ 3’ 3’
3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
3’
循环2 4个拷贝
5’ 3’ 5’ 3’
5’ 3’ 5’ 3’
实验五PCR扩增PPT课件
仪器误差
PCR仪器的性能和稳定性对扩增结果至关 重要，应选择性能稳定、精度高的仪器， 并定期进行维护和校准。
06
pcr 扩增实验展望与未来 发展
pcr 技术的发展趋势
自动化与智能化
随着技术的进步，PCR仪器的自 动化和智能化程度将进一步提高，
减少人工操作，提高实验效率。
高通量与快速检测
未来PCR技术将向高通量和快速检 测方向发展，能够同时检测多个基 因或样本，缩短检测时间。
05
pcr 扩增实验注意事项与 误差分析
实验注意事项
实验前准备
确保实验室环境清洁、无污染，实验 器材灭菌处理，实验试剂储存得当， 避免过期或污染。
操作规范
严格遵守实验操作规程，避免交叉污 染和意外事故。
样本处理
确保样本质量，避免样本降解或污染， 按照实验要求进行样本处理。
实验后处理
及时清理实验废弃物，对实验器材进 行清洗和消毒，保持实验室整洁。
将DNA模板进行必要的处理和纯化，以去 除杂质和不必要的片段。
根据反应体系要求，将DNA模板、引物、 dNTPs、Taq酶等试剂加入PCR管中。
PCR扩增程序设置
PCR扩增执行
根据目标DNA片段的特性和扩增要求，设 置PCR仪的扩增程序（包括变性、退火、延 伸等温度设置和循环次数）。
将配置好的PCR反应混合液放入PCR仪中， 按照设定的程序进行扩增。
pcr 技术的原理
PCR技术的基本原理是利用DNA双链复制的原理，在DNA聚 合酶的作用下，以一对寡核苷酸引物为模板，在适宜的温度 和环境下，进行DNA片段的扩增。
pcr 技术的发展历程
pcr 技术的起源
PCR技术最早由美国科学家凯利·穆 利斯在1983年发明，最初被称为“ 穆利斯放大法”。
PCR仪器的性能和稳定性对扩增结果至关 重要，应选择性能稳定、精度高的仪器， 并定期进行维护和校准。
06
pcr 扩增实验展望与未来 发展
pcr 技术的发展趋势
自动化与智能化
随着技术的进步，PCR仪器的自 动化和智能化程度将进一步提高，
减少人工操作，提高实验效率。
高通量与快速检测
未来PCR技术将向高通量和快速检 测方向发展，能够同时检测多个基 因或样本，缩短检测时间。
05
pcr 扩增实验注意事项与 误差分析
实验注意事项
实验前准备
确保实验室环境清洁、无污染，实验 器材灭菌处理，实验试剂储存得当， 避免过期或污染。
操作规范
严格遵守实验操作规程，避免交叉污 染和意外事故。
样本处理
确保样本质量，避免样本降解或污染， 按照实验要求进行样本处理。
实验后处理
及时清理实验废弃物，对实验器材进 行清洗和消毒，保持实验室整洁。
将DNA模板进行必要的处理和纯化，以去 除杂质和不必要的片段。
根据反应体系要求，将DNA模板、引物、 dNTPs、Taq酶等试剂加入PCR管中。
PCR扩增程序设置
PCR扩增执行
根据目标DNA片段的特性和扩增要求，设 置PCR仪的扩增程序（包括变性、退火、延 伸等温度设置和循环次数）。
将配置好的PCR反应混合液放入PCR仪中， 按照设定的程序进行扩增。
pcr 技术的原理
PCR技术的基本原理是利用DNA双链复制的原理，在DNA聚 合酶的作用下，以一对寡核苷酸引物为模板，在适宜的温度 和环境下，进行DNA片段的扩增。
pcr 技术的发展历程
pcr 技术的起源
PCR技术最早由美国科学家凯利·穆 利斯在1983年发明，最初被称为“ 穆利斯放大法”。
RT-qPCR技术的原理及应用ppt课件
出率较HBeAg( - ) 者高; 22 例HBsAg ( - ) 肝组织, 有16 例可
检测到HBx DNA 或RNA,HBsAg( - ) 的隐匿性感染在中国人
终末期肝病中有较高的检出率72. 7%; HBV 病毒转录体
trRNA 在肝癌及肝硬化组织中的检出率明显高于其他肝脏
疾病( P < 0. 05) . 结论: HBV隐匿性感染与中国人终末期肝病
•理想的PCR反应：
•
X=X0*2n
•非理想的PCR反应：
•
X=X0 (1+Ex)n
•
•
•
•
n：扩增反应的循环次数
X：第n次循环后的产物量
X0：初始模板量
Ex：扩增效率
实时荧光定量PCR 原理 --------- DNA 产物的荧光标记
非特异性荧光标记：
1、 SYBR Green
特异性荧光标记：
2、TaqMan
3. MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物
4. 反应Buffer 体系的优化
5. 反应温度和时间参数:由酶和引物决定
6. 其他与常规PCR相同
SYBR Green 法
应用范围
起始模板的测定
基因型的分析
融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规
PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一
PCR 及RT PCR 扩增HBV XDNA, XRNA, fRNA 和
trRNA, 琼脂糖凝胶电泳显示产物, Southern blot 杂交验
证PCR 扩增的可靠性. 结果: 27 例HBsAg ( + ) 肝组织, 19 例
HBx DNA/ RNA 检测均为阳性, 其中HBeAg ( + ) 者fRNA 检
检测到HBx DNA 或RNA,HBsAg( - ) 的隐匿性感染在中国人
终末期肝病中有较高的检出率72. 7%; HBV 病毒转录体
trRNA 在肝癌及肝硬化组织中的检出率明显高于其他肝脏
疾病( P < 0. 05) . 结论: HBV隐匿性感染与中国人终末期肝病
•理想的PCR反应：
•
X=X0*2n
•非理想的PCR反应：
•
X=X0 (1+Ex)n
•
•
•
•
n：扩增反应的循环次数
X：第n次循环后的产物量
X0：初始模板量
Ex：扩增效率
实时荧光定量PCR 原理 --------- DNA 产物的荧光标记
非特异性荧光标记：
1、 SYBR Green
特异性荧光标记：
2、TaqMan
3. MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物
4. 反应Buffer 体系的优化
5. 反应温度和时间参数:由酶和引物决定
6. 其他与常规PCR相同
SYBR Green 法
应用范围
起始模板的测定
基因型的分析
融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规
PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一
PCR 及RT PCR 扩增HBV XDNA, XRNA, fRNA 和
trRNA, 琼脂糖凝胶电泳显示产物, Southern blot 杂交验
证PCR 扩增的可靠性. 结果: 27 例HBsAg ( + ) 肝组织, 19 例
HBx DNA/ RNA 检测均为阳性, 其中HBeAg ( + ) 者fRNA 检
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实验三：PCR扩增检测乙肝病毒
PCR扩增检测乙肝病毒
1
乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎， 我国发病率很高 ，HBV的检测极其重要。
HBV DNA存在就可以引起乙肝的传染，乙 肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒复 制的发动机 。
PCR扩增检测乙肝病毒
2
PCR技术可以检测出极微量的病毒，是判 断其传染性最直接、最可靠的证据。PCR技术 已成为公认的对病毒性肝炎的诊断、疗效观察 及预防研究工作最理想的方法之一。
引 物(小分子DNA片段）
加入提取好的标本4μl，6000转离心10秒。
PCR扩增检测乙肝病毒
12
3.PCR仪上扩增：
三个扩增步骤温度及时间
变性
温度 93℃
时间 45″（首次5′）
退火
55 ℃
45″
延伸
72 ℃
60″（末次5′）
循环次数：25次
PCR扩增检测乙肝病毒
13
加入标本
6000转离心10秒
DNA提取液
PCR扩增检测乙肝病毒
10
四、操作步骤
1.标本处理：取患者血清40μl，加入DNA
提取液40μl，沸水浴10分钟，10000转离心 5分钟，取上清液4μl做PCR反应。
PCR扩增检测乙肝病毒
11
10×扩增缓冲液
2.加样：
取试剂盒中PCR反应管
4种dNTP混合物
TapDNA聚合酶 Mg2+
PCR仪上扩增
PCR扩增检测乙肝病毒
离心
14
4.电泳检测：
①制备2%琼脂糖凝胶
电泳槽的准备：
2%琼脂糖的制备：
称取 0.8g琼 脂糖
40mlTBE 加入 电泳缓冲液 冷却
（PH8.0) 60℃左右 煮沸溶解
加入 溴乙啶
EB20μl
倒胶
PCR扩增检测乙肝病毒
15
``
②加样：取扩增后的产物10 ul点样于凝胶孔
PCR扩增检测乙肝病毒
3
一、实验目的
1.掌握PCR技术扩增的原理 2.熟悉PCR扩增检测乙肝病毒的基本操作
过程。
PCR扩增检测乙肝病毒
4
二、实验原理
聚合酶链反应(Polymerase Chain
Reaction) 简称PCR,是在体外条件下利 用DNA聚合酶、催化一对引物间的特 异性DNA片段合成的基因体外扩增技 术，它包括三个基本过程：
Tap酶
3’
两条子代DNA
5’
经过25-35次循环后，目的片段扩增2n倍
PCR扩增检测乙肝病毒
7
三、主要器材及试剂
1.主要器材：
9700型PCR仪
电泳槽、电泳仪
PCR扩增检测乙肝病毒
8
紫外分析仪
台式高速离心机
PCR扩增检测乙肝病毒
Байду номын сангаас
9
2.主要试剂：
HBV阳性标本 PCR反应管
HBV-PCR定性检测试剂盒
2. 反应液的表面为固体封盖剂，电泳取样时从 反应管底部吸液。
3. EB为强致癌物，操作过程应注意防护。 4. 注意无菌操作，以免出现假阳性。
PCR扩增检测乙肝病毒
18
Thank you!
PCR扩增检测乙肝病毒
19
感谢您的聆听，下载文档 可以自由编辑！
PCR扩增检测乙肝病毒
5
1.变性：加热使双链DNA变为单链 2.退火：急速降温使引物和互补模板
在局部形成杂交链 3.延伸：耐热DNA聚合酶按5 ′→3′
方向催化以引物为起始点的 延伸反应
PCR扩增检测乙肝病毒
6
一 次 循 环
5’
3’
5’
3’ 模板DNA
3’
5’
高温变性
低温退火
适温延伸
5’
3’
引物
取样
点样
PCR扩增检测乙肝病毒
16
③电泳：点样端接“-”，稳压，50V，电泳30分钟。
五、结果观察：紫外分析仪下观察，出现橙黄色
条带则为HBV阳性
点样孔
HBV阳性对照
HBV阳性
HBV阴性对照
HBV阴性
正极
负极
PCR扩增检测乙肝病毒
17
五、注意事项
1. 试剂盒内阳性标本及DNA提取液使用前需充 分融化离心。
PCR扩增检测乙肝病毒
1
乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎， 我国发病率很高 ，HBV的检测极其重要。
HBV DNA存在就可以引起乙肝的传染，乙 肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒复 制的发动机 。
PCR扩增检测乙肝病毒
2
PCR技术可以检测出极微量的病毒，是判 断其传染性最直接、最可靠的证据。PCR技术 已成为公认的对病毒性肝炎的诊断、疗效观察 及预防研究工作最理想的方法之一。
引 物(小分子DNA片段）
加入提取好的标本4μl，6000转离心10秒。
PCR扩增检测乙肝病毒
12
3.PCR仪上扩增：
三个扩增步骤温度及时间
变性
温度 93℃
时间 45″（首次5′）
退火
55 ℃
45″
延伸
72 ℃
60″（末次5′）
循环次数：25次
PCR扩增检测乙肝病毒
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加入标本
6000转离心10秒
DNA提取液
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四、操作步骤
1.标本处理：取患者血清40μl，加入DNA
提取液40μl，沸水浴10分钟，10000转离心 5分钟，取上清液4μl做PCR反应。
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10×扩增缓冲液
2.加样：
取试剂盒中PCR反应管
4种dNTP混合物
TapDNA聚合酶 Mg2+
PCR仪上扩增
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离心
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4.电泳检测：
①制备2%琼脂糖凝胶
电泳槽的准备：
2%琼脂糖的制备：
称取 0.8g琼 脂糖
40mlTBE 加入 电泳缓冲液 冷却
（PH8.0) 60℃左右 煮沸溶解
加入 溴乙啶
EB20μl
倒胶
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``
②加样：取扩增后的产物10 ul点样于凝胶孔
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一、实验目的
1.掌握PCR技术扩增的原理 2.熟悉PCR扩增检测乙肝病毒的基本操作
过程。
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二、实验原理
聚合酶链反应(Polymerase Chain
Reaction) 简称PCR,是在体外条件下利 用DNA聚合酶、催化一对引物间的特 异性DNA片段合成的基因体外扩增技 术，它包括三个基本过程：
Tap酶
3’
两条子代DNA
5’
经过25-35次循环后，目的片段扩增2n倍
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三、主要器材及试剂
1.主要器材：
9700型PCR仪
电泳槽、电泳仪
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紫外分析仪
台式高速离心机
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Байду номын сангаас
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2.主要试剂：
HBV阳性标本 PCR反应管
HBV-PCR定性检测试剂盒
2. 反应液的表面为固体封盖剂，电泳取样时从 反应管底部吸液。
3. EB为强致癌物，操作过程应注意防护。 4. 注意无菌操作，以免出现假阳性。
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1.变性：加热使双链DNA变为单链 2.退火：急速降温使引物和互补模板
在局部形成杂交链 3.延伸：耐热DNA聚合酶按5 ′→3′
方向催化以引物为起始点的 延伸反应
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一 次 循 环
5’
3’
5’
3’ 模板DNA
3’
5’
高温变性
低温退火
适温延伸
5’
3’
引物
取样
点样
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③电泳：点样端接“-”，稳压，50V，电泳30分钟。
五、结果观察：紫外分析仪下观察，出现橙黄色
条带则为HBV阳性
点样孔
HBV阳性对照
HBV阳性
HBV阴性对照
HBV阴性
正极
负极
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五、注意事项
1. 试剂盒内阳性标本及DNA提取液使用前需充 分融化离心。