第六章 亚病毒(Subvirus)

第六章亚病毒（Subvirus）
亚病毒（Subvirus）又称亚病毒因子（Subviiral agents），以往习惯上将亚病毒分为类病毒（viroid）、拟病毒（Virusoid）及朊病毒（Virino），在1995年的病毒分类与命名第六次报告中则分为类病毒、卫星因子（Satellites）和朊病毒三类。

经典的病毒均是由一种类型的核酸（RNA或DNA）与至少一种结构蛋白组成有一定形态的病毒子，为真病毒（euvirus）。

亚病毒则是比真病毒更为简单的致病因子，是一小分子量的RNA或DNA或一种蛋白质，为迄今发现的最小生命单位。

如果现阶段病毒的概念包括真病毒和亚病毒，那么病毒的定义要比原有的更为概括。

病毒是一种具有生命特征的遗传单位。

对于亚病毒的分类，最新的国际病毒分类系统，对朊病毒和卫星因子未做科、属的划分，而将类病毒分为2个科、7个属，即鳄梨白斑类病毒科包括鳄梨白斑类病毒属和桃潜隐花叶类病毒属，马铃薯纺缍形块茎类病毒科包含马铃薯纺缍形块茎类病毒属、酒花矮化类病毒属、锦紫苏类病毒属、椰子死亡类病毒属和苹果北美果疤类病毒属。

第一节类病毒（Viroid）
1971年Diener发现了马铃薯纺缍形块茎病的病原，不同于传统的病毒：（1）该病原在机体内是一种未核衣壳化的RNA；（2）在受染的组织中未发现病毒样的颗粒；（3）感染性RNA的分子量很小；（4）感染性RNA可在敏感细胞内自我复制，不需要辅助病毒；（5）感染性RNA只由一种分子所组成。

因而，该作者称其为类病毒（Viroid）。

一、类病毒的特性
类病毒是使植物发病的感染因子。

系单股共价闭合的环状RNA分子，没有蛋白质，分子质量为120KD，为小RNA病毒的感染性RNA的1/10或还要小，感染性极高，10个分子的马铃薯纺缍形块茎类病毒就足以使马铃薯感染。

自1971年以来，现已发现有几十种类病毒，且对其中20多种进行了比较全面的鉴定，证明类病毒的全长均在246～375 nt （nucleotide）之间。

二、类病毒的结构
1．基因组：类病毒RNA基因组全序列为单链共价闭合的RNA分子。

至今已对40多个类病毒毒株进行序列测定，病毒不同组成RNA的碱基数不同，在246～375 nt之间，无mRNA活性。

2．结构域：根据序列和结构的同源性，已知序列的类病毒可分为二类：第一类只有苹果锈果类病毒（ASBV）；第二类包括其他所有类病毒，与PSTV（马铃薯纺缍形块茎类病毒）相似。

ASBV虽然推测有杆状结构，这点与其它类病毒相似，但是，它的A﹕U (腺嘌呤﹕尿嘧啶)比例很高，序列同源性也较低。

PSTV样类病毒任何两个成员间的同源性至少
是35%，所有毒株有一中央保守的U形凸出区。

（1）C结构域在所有类病毒中是最保守的，有95个核苷酸。

在TASV（番茄顶矮化类病毒）和CEV-A（柑桔裂皮类病毒-A）之间有99 %的同源性，整个同源性是73 %。

C 结构域的5＇端5～9位核苷酸和3＇端7～15位核苷酸处在一个9个核苷酸的反向重复，这一反向重复可以形成一杆状环圈，C结构域可能是复制中间体RNA加工的信号。

图PSTV样类病毒的5个结构域（T1，P，C，V，T2）模式图
注：箭头所示为反向重序列，可以形成杆状结构
（2）P结构域除CCCV（椰子死亡类病毒）外，所有的PSTV样类病毒中有一P结构域，包括长约15～17个核苷酸的主要是A的嘌呤区，在相反的链上在寡U 4～7序列。

P结构域与症状有关。

（3）V结构域这一区段易于变异，最相近的毒株之间的同源性小于50 %。

（4）T结构域在PSTV样类病毒的T结构域中同源性是最有意义的。

在T1结构域有CCUC，在T2结构域有CCUUC保守序列。

这些序列有利于依赖于DNA的RNA多聚酶II的结合，后者可能是类病毒在机体内的复制酶。

3．ASBV的结构：ASBV在结构上不同于PSTV样类病毒，ASBV中A＋U为62%，而PSTV样类病毒则为40%～44%；ASBV中A﹕V＋G﹕V占65%，而在PSTV样类病毒则为32%～48%。

而且，ASBV在整个序列与其它成员的同源性也较低，它没有中央保守的凸出区和9个核苷酸反向重复的侧翼区。

在ASBV，RNA的加工是在特殊位点上。

三、类病毒的复制
类病毒RNA本身无mRNA活性，不编码任何蛋白。

因此，类病毒复制所必需的酶类必须事先就存在于宿主细胞内，所有的类病毒复制是RNA-RNA直接转录，不涉及DNA。

类病毒复制的最终产物是单体环状类病毒（+）RNA分子，也就是成熟的感染性类病毒，然而也伴有小的线状分子，这可能是由于尚未环化或已环化的成熟分子又被核酸酶切割所造成。

在类病毒感染的细胞中，采用分子杂交技术可以发现多体的类病毒（+）和（－）RNA，以及含有两者的复合物，这说明至少有一条链的合成是通过滚环样机制。

类病毒在植物宿主细胞中，第一步是感染性单体类病毒（+）RNA在依赖于DNA的RNA多聚酶II 的作用下转录成多体的（－）RNA拷贝，这一多体（－）RNA又在依赖于DNA的RNA 多聚酶I的催化下再转录成（+）RNA多聚物，再从（+）RNA多聚物前体，通过类似于剪接的过程形成单体RNA分子。

这一过程可由植物细胞内存在的依赖于RNA的RNA聚合酶催化，在试管内复制类病子RNA。

四、类病毒与内含子
众所周知，许多真核基因被一些内含子所间隔。

在基因表达时，mRNA前体中的内含子必须被去除，外显子则依次连接，成为成熟的mRNA，这一过程称为剪接（Splicing）。

内含子被剪接后，可以作为线状分子，或者也可环化。

根据内含子的剪接机制和RNA结构，现已知至少有4种类型的内含子。

第一种，核mRNA中的内含子，在其剪接的连接处有一保守序列，何酶参与剪接不清。

第二种，是核tRNA内含子，在剪接位点处无保守序列，在内含子内也无保守序列。

切割的酶有内核酸酶、磷酸酶和连接酶等。

第三种，是线粒体和叶绿体的某些mRNA内含子，Michel和Pujon（1982）称这种内含子为II组，在其3＇端的100个核苷酸中有一条保守序列。

它所涉及的机制与第一种内含子相似。

第四种，内含子有保守序列和结构上的特点，存在于线粒体的mRNA、rRNA基因、叶绿体RNA基因中，也存在于核RNA基因中。

这种内含子的特点是有一16个核苷酸的保守序列，即I组保守序列。

在类病毒以及卫星因子也具有与I组内含子在序列上和结构上的同源性，究尽类病毒由内含子进化而来，还是两者均由一个共同的祖先分子进化而来，尚不清楚。

第二节卫星因子（Satellites）
在RNA植物病毒中，有些病毒包含两种相关的、但在抗原上又完全不同的病毒颗粒，一种是它本身的较大的颗粒，另一种是较小的病毒颗粒；有些病毒的病毒粒子中，除包含它的基因组RNA外，还含有一种与病毒基因组一起包壳的小分子RNA。

这些小病毒颗粒的RNA或与病毒基因组一起包壳的小分子RNA与各自有关的病毒基因组或寄主基因组核苷酸序列没有同源性，也不能单独侵染和复制，必须依赖它们有关的病毒复制。

前者称为卫星病毒，后者称为卫星RNA，统称为卫星因子或病毒卫星，其复制有关的病毒则称谓辅助病毒。

因为病毒卫星依赖其辅助病毒复制，又干扰辅助病毒复制，多数还能改变由其辅助病毒引起的寄主植物病状，又把病毒卫星看作是分子寄生物。

因此，卫星因子是由核酸分子组成的一种亚病毒，必须依赖宿主细胞内共感染的辅助病毒才能复制。

迄今发现的卫星因子包括：卫星双股DNA（dsDNA satellites），卫星双股RNA（ds RNA satellite），卫星单股RNA（ssRNA satellites），卫星单股DNA病毒（ssDNA satellite viruses）和卫星单股RNA病毒（ssRNA satellite viruses）。

这些卫星因子大多以植物病毒为辅助病毒，也有动物病毒的一些卫星因子。

一、卫星因子的一般特性
卫星因子以其对辅助病毒的依赖性为特征，多数卫星因子是基因复制性依赖，但也有一些卫星因子是壳体化的依赖。

但是少数卫星病毒可于某些特定条件下在无辅助病毒存在时，呈现轻度增殖。

卫星因子不构成统一的分类学类群。

某些卫星因子归属于相应的病毒科或属，例如卫星双链DNA P4被列入肌病毒科（Myoviridae），单股DNA腺联病毒归入细小病毒科依赖病
毒属（Dependovirus），而单股RNA δ病毒则归列于δ病毒属（Deltavirus），但还有许多卫星因子尚无归属。

由此可见，目前所讲的卫星因子包含过去划分于缺损病毒中卫星病毒，过去亚病毒中的拟病毒，是指卫星RNA而言，而现在的卫星核酸则不仅是RNA一种，所以卫星因子包括的范围比过去更广。

卫星病毒不同于依赖辅助病毒的缺损病毒（defective interfering病毒粒子，DI病毒粒子），虽然两者均需利用另一病毒的基因产物，才能进行自我复制，但不同于DI粒子的是这类病毒本身从结构上看并不缺损，另外辅助病毒是在结构上与其毫不相似的病毒。

卫星病毒、卫星RNA和DI颗粒的比较
二、卫星病毒
40年代初，英国Bawden等在研究一些烟草坏死病毒（TNV）的分离物时，发现其中有的病毒含有大小不同和沉降速率有别的两种核蛋白颗粒，他们设想较小的病毒颗粒是由较大的病毒颗粒产生的。

60年代初，英国Kassanis等证实，TNV中较大的病毒颗粒（直径约30nm）能自身复制，而较小的病毒颗粒（直径约17nm），不能单独侵染和复制，只有较大的颗粒存在时才能复制，而且两种病毒颗粒在抗原上完全不同。

因此把较小一种病毒颗粒称作卫星病毒（STNV），把较大的病毒颗粒称作辅助病毒。

进一步研究证明，这种卫星病毒的RNA由1239个核苷酸组成，只能为其本身编码一种195个氨基酸的外壳蛋白。

它的RNA在体内外很稳定，具有高度的碱基配对，3＇端有两个象三叶草样的结构。

在动物病毒中见有的卫星病毒如腺联病毒（一种单股DNA卫星病毒）、δ肝炎病毒（单股RNA 卫星病毒，由1700 nt组成）。

三、卫星RNA
1972年，法国番茄上发生一种致死性坏死病害，研究结果证明是由黄瓜花叶病毒（CMV）引起的，奇怪的是由这种病毒引起的植物病状与普通的CMV引起的病状不一样，后来在其中的一个株系CMV-S中发现提纯的CMV制备物中，除含有4个本身基因组RNA1～4外，还含有一个较小的RNA5。

1976年，美国Kaper等指出，RNA5是一种缺损的，与CMV-S有关的象卫星的RNA，称作CA RNA5。

此后又找到了能减轻辅助病毒引起植物病状的卫星RNA。

目前在黄瓜花叶病毒组中至少发现了10种不同的卫星RNA分离物，多数已确定了核苷酸序列，约由334～386个核苷酸组成，且证明不同卫星RNA分离物的核
苷酸之间有高度的序列同源性。

其中只有CMV-S株卫星RNA在体外能合成两个小的多肽，但不知其功能，多数卫星RNA不具备编码蛋白质的能力，必须借助其辅助病毒，与其辅助病毒一起包壳在相同的病毒颗粒中，因此在抗原上是不能区分的。

卫星RNA的核苷酸序列与其辅助病毒基因组没有同源性。

除黄瓜花叶病毒组中的卫星RNA外，在蠕传病毒组中发现了烟草环驳病毒卫星RNA、番茄黑环病毒卫星RNA等8种病毒的卫星RNA；在番茄丛顶病毒组中，发现了番茄丛顶矮化病毒卫星RNA和芜菁皱缩病毒卫星RNA。

此外，还发现绒毛烟斑驳病毒（VTMoV）、莨菪斑驳病毒（SNMV）、苜蓿暂时性条斑病毒（LTSV）和地下三叶草斑驳病毒均有一条线状、单链、约由4500个nt组成的基因组RNA（RNA1）和两种小RNA，其中一种是共价闭环状分子（RNA2），另一种是大小和碱基序列与RNA2相同的线状分子（RNA3），它们约有324～386 nt长，与RNA1在序列上无任何同源性。

这4 种病毒的RNA2和RNA3某些性质象类病毒，曾被称为拟病毒或壳内类病毒。

象类病毒是指它们的分子大小，具备环状结构，有高度的碱基配对和体外无信使功能等，但它们的RNA2不能单独侵染和复制，必须依赖RNA，进行复制和包壳，说明RNA2是一种卫星RNA，故称象类病毒的卫星RNA。

RNA3则是RNA2的线状形式。

Francki等（1985）认为，类病毒样RNA可能来源于植物病毒和类病毒的共同感染，从而导致类病缺失，而依赖于辅助病毒。

但两者之间确有很多明显的差异，前者依赖于RNA 多聚酶在胞浆内复制，而且在受染植物中浓度很高；后者利用核内的RNA多聚酶II在受染细胞核内复制，浓度很低。

据此，Francki的假说难以置信，而根据它们的序列和结构推测，类病毒可能来源于内含子。

卫星核酸和卫星病毒也有可能与类病毒一样是同一来源。

第三节朊病毒（Virino）
在植物上，新的类病毒正在被不断发现，但在动物中，却从未发现过类病毒及其引起的疾病。

然而，人和动物存在着一类被称为亚急性海绵样脑病的中枢神经系统疾病，包括人的库路病（Kuru）、克-雅氏病（Creutzfeld-Jakob disease）、阿耳茨海默病（Alzheimer disease）、格-史氏综合症（Gerstmann-Straussler syndrome）、羊搔痒病（Scrapie）、水貂传染性脑病（Transmissible mink encephalopathy）、黑尾鹿和糜鹿的慢性消耗病（Chronic wasting disease of mule deer and elk）以及牛海绵状脑病（Bovine spongiform encephalpopathy）。

这些疾病具有一些共同的特性：①潜伏期长，一般为几个月、几年甚至十几年以上；②机体感染后不发热，不出现炎症症状，也不发生特异性免疫应答反应；③临床上出现进行性共济失调、震颤、痴呆和行为障碍等神经症状；④病程缓慢进行，但均终于死亡；⑤病理剖检变化以脑灰质的海绵样变为特征。

以上这些疾病均由朊病毒引起。

朊病毒又名蛋白侵染子（Prion，Proteinaceous infectious agents），它与真病毒和类病毒、卫星因子全然不同，仅为一种约27KD左右的蛋白质大分子，迄今尚未发现有任何核酸与此感染性因子有关。

由于对各种朊病毒的本质了解不够，采用“因子”命名似乎较为恰当。

一、朊病毒特性与本质
由于搔痒（痒疫）因子易于人工感染小鼠和仓鼠，并能顺利传代，因此关于朊病毒特
性和本质的研究，大多来自搔痒因子。

这种感染因子对蛋白酶、蛋白变性剂敏感，而对核酸酶、核苷酸的修饰剂和核酸变性剂等有抵抗力。

纯化的感染因子为一种特殊的糖蛋白，分子量为27～30KD，称为PrP，即蛋白酶抗性蛋白（Proteinase resisrant protein）或朊病毒蛋白（Prion protein）。

据Prusiner 等（1983）报道，PrP分子在一定条件下形成杆状结构或纤维状结构（见于感染脑组织内），并排列成丛，均具有传染性。

由于PrP的氨基酸序列已被部分测出，约250个左右的氨基酸，所以有可能构建寡核苷酸探针和cDNA文库。

令人深感兴趣的是，从正常动物组织中很易测到PrP mRNA。

随后发现PrP基因是一个单拷贝基因，具有2个外显子和1个很大的内含子，在正常和不正常（痒疫相关）的PrP基因或mRNA之间似乎没有差别。

因此，痒疫相关PrP是由大多数细胞均有的一个正常内源性基因编码的。

正常脑组织和痒疫脑组织中这种蛋白的差异表现在PrP本身的理化学性质上。

在正常脑组织中的去污剂抽提物中，PrP不能聚集成大分子的纤维样结构，且对蛋白酶K高度敏感。

相反，痒疫感染脑中的PrP聚集成电镜下可见的大分子纤维样结构，且在温和性去污剂溶液中对蛋白酶K具有抵抗力。

根据目前对搔痒因子的研究结果，对其本质提出诸多解释，归纳起来主要有“唯蛋白论”和“核蛋白论”两种说法。

前者认为，痒疫因子没有核酸，只是正常宿主PrP33～35C蛋白的修饰形式；后者认为，既然痒疫因子存在许多不同的毒株，呈现不同的表型，那就证明必然有核酸作为其组成成分。

1991年Weissman提出了统一这两种假设的所谓联合学说。

按照这一学说，痒疫因子感染组织的粗提物中的感染因子，即“完全朊病毒”（holoprion），由两个成分组成，其中一个成分是PrP SC（前体PrP33～35），即使没有核酸，PrP SC也能诱发疾病；另一成分是核酸，可能存在许多变型，并因修饰PrP SC的生化特性而决定后者的株特异性，这种核酸可能正常地连结于PrP SC上，但也存在于未感染的宿主细胞中。

没有核酸的PrP SC侵入细胞后，可能激活某个细胞核酸，使其呈现朊病毒核酸的作用。

朊病毒核酸借助正常细胞酶（聚合酶）而复制，这一过程由PrP SC所激发，甚至可能依赖PrP SC的存在。

因此，PrP SC是致病成分，但其原始结构由宿主基因所编码，而朊病毒核酸则是传播性遗传成分。

所以，无论是完全朊病毒或PrP SC，侵入敏感细胞后，均可发生增殖过程。

二、现已发现与朊病毒有关的人和动物疾病
1．库鲁病（Kuru）：又称震颤病，是1966年确定的第一种人类亚急性海绵样脑病。

发生于巴布亚新几内亚Eastern Highland省局限范围内的一个称为Fore的部落中。

这种病是由于该部落人有吃死人脑和死人肉的习俗而传播的，随着这一习俗的废除，库路病已经得到有效控制。

患者表现共济失调和震颤等小脑症状，随后瘫痪死亡。

2．克-雅氏病（Creutzfeldt-Jakob病）：即C-J病（CJD），又称传染性早老痴呆，最早发现于1920年，但到60年代后期才被确定为是由非典型病毒引起的中枢神经系统传染病。

该病的发病率约百万分之一，似有一定的家族性，我国1986年才有首例尸检报告。

应用人源或动物源的生物制剂可能是该病传播的一个重要途径。

本病似乎还与吃污染有痒疫因子的羊肉，特别是羊脑有一定关系。

该病表现，肌纤维自发性收缩（肌阵挛），共济失调，嗜睡以及进行性痴呆。

病灶变化与库鲁病相似。

发病年龄平均为65岁，很少发生于青年人，但最近英国发现的10个病例，
平均年龄只27.5岁，甚至有几个十几岁的少年。

3．阿耳茨海默病和格-史氏综合症（格斯特曼氏综合症）：是人类另外两种亚急性海绵样脑病。

前者具有与老年性痴呆相似的病理学变化，可能是克-雅氏病另一临床-病理型。

格-史氏病是由左侧角回病灶所致的左右失认，计算不能和右侧偏盲症。

4．羊搔痒病（Scrapie）：又称痒疫，是绵羊和山羊中枢神经系统的一种慢性进行性疾病。

早在18世纪中叶就发生于英格兰，随后传播至欧洲许多国家，20世纪30～40年代报道于北美，蔓延于世界许多地区，1983年我国在从英国进口羊群中发现疑似病例。

主要症状为步态不稳，共济失调，逐渐恶化，直至死亡。

病绵羊与易感山羊接触，可将痒疫传给山羊，出现搔痒症，人工感染小鼠与健鼠接触，也可使后者感染发病，已证明了母羊对胎儿的垂直传染途径。

5．水貂传染性脑病：是成年貂的一种类似痒疫的疾病。

有人认为，水貂不是本病的自然宿主，而是因吃食痒疫病羊的肉或脏器等而遭致感染的，但是流行病学调查表明，本病更可能因水貂间的互咬而传播。

6．鹿慢性消耗病：1978年，美国Colorado的黑尾鹿群中发现一种慢性消耗性疾病。

其临床症状和神经系统的病理变化，与羊的痒疫极为相似。

人工接种健康黑尾鹿亦已成功。

1982年又在附近的麝鹿中发现这样的疾病。

7．牛海绵状脑病：1985年在南英格兰的牛群中发现一种海绵样脑病，俗称疯牛病，至1995年5月，英国饲养的约15万头牛感染或可能感染本病。

初步认为是牛吃食了病牛或污染痒疫的肉骨粉而发生的。

本病已发现于欧洲多数国家，加拿大、阿曼和苏丹等也从英国进口的牛中发现了本病。

对于本病，迄今尚无牛→牛或羊→牛间的传播的确切证据。

应用病牛脑接种小鼠，可以使其感染发病。

1994年2月以来，英国发现12例克-雅病患者，并已死亡8人。

据英国海绵状脑病咨询委员会的调查、分析，认为这些病例同1989年禁止食用特定牛内脏之前同疯牛病接触有关。

1988年7月英国禁止反刍动物源蛋白饲料喂牛，1995年计划屠杀和烧毁400万头牛。

许多国家，包括我国，亦开始禁止从英国进口牛肉和牛肉产品。

复习思考题
1．何谓亚病毒、类病毒、朊病毒、卫星因子（卫星病毒、卫星RNA）？
2．试述朊病毒的特性和本质。