组织培养的步骤

组织培养的步骤

一、Ms培养基配制

1.各种母液的配置

（1）配制MS大量元素母液

一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。

分别称取

NH4NO3 165g

KH2PO4 17g

KNO3 190g

CaCl2·2H2O 44g

MgSO4·7H2O 37g

各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

（2）配制MS微量元素母液一般将微量元素配制成100倍母液。

依次称取

KI 0.083g

Na2MoO4·2H2O 0.025g

H3BO3 0.62g

CuSO4·5H2O 0.0025g

MnSO4·H2O 1.69g 或MnSO4·4H2O 2.23g

CoCl2·6H2O 0.0025g

ZnSO4·7H2O 0.86g

配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。分别称取

CuSO4·5H2O 0.05g

CoCl2·6H2O 0.05g

各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。

（3）配制MS有机母液一般配制成100倍MS有机母液。

依次称取

肌醇10g

盐酸硫胺素（VB1）0.01g

烟酸0.05g 甘氨酸0.2g

盐酸吡哆醇（VB6）0.05g

配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

（4）配制MS铁盐母液一般配制成100倍MS铁盐母液。

依次称取

EDTA二钠3.73g

FeSO4·7H2O 2.78g

配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液，共8种母液。

（5）激素母液的配制各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或0.1ml/L的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用0.1ml/L的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。

2、配制培养基

以配置1L MS培养基为例，按顺序进行如下操作：

（1）先在烧杯中放入一些蒸馏水。

（2）分别取上面八种母液10ml倒入。

（3）一般称取30g蔗糖倒入，搅拌溶解。

（4）加蒸馏水用量筒定溶至1L。

（5）按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取，减少误差。

（6）用精密试纸或酸度计调整PH至5.7-5.8。（有条件的话使用酸度计，比较精确）可配0.1ml/L的HCL和0.1ml/L的NaOH用来调溶液PH值。0.1ml/LHCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。0.1ml/LNaOH配制：称取NaOH 4g 配成100ml溶液。（7）称取6~10g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉),倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化。

（8）稍微冷却后，分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧。

（9）放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右。

0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1-0.15MPa，20分钟。（10）灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。

二、接种

2.1 成熟种子的表面消毒

选取成熟饱满、颜色和大小相对一致的成熟小麦，用70%(v/v)酒精浸泡5 min，无菌水冲洗2~3 次，再经0.1%的升汞（HgCl2）浸泡20 min，无菌水冲洗6~8 次后，置于无菌保湿滤纸上，33℃黑暗条件下预培养 2 h。

2.2 成熟胚愈伤组织的诱导和继代

待种子露白，用解剖刀在胚上纵切一刀，横切两刀，腹沟向下接种在诱愈培养液浸润的滤纸上，(26±1)℃暗培养8 d。挑选胚性愈伤组织，每2~3 周继代一次。

2.3 胚性愈伤组织的分化再生

选取胚性愈伤组织转入分化培养基，(26±1)℃暗培养10 d 后，转入同温条件下光培养，光照强度为40 μmol/(m2·s)，光照时间16h/d。经过40 d 的分化培养(每10 天更换1 次新鲜培养基)，形成绿芽原基和绿芽。待分化出的绿芽长至2~3cm时，切取绿芽转至生根培养基，使之生根。

2.4 再生植株的春化及移栽

具有正常根系的再生植株长至6~8 cm 时，4℃冰箱春化6~8 w（16 h 光周期，光照强度为40 μmol/(m2·s)，然后敞开培养瓶瓶口，温室中炼苗 1 w，移栽入温室花盆中[(26±2)℃，16 h 光周期，光照强度为80 μmol/(m2·s)]，生长至成熟。

三无菌操作

（1）在接种4小时前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外线灯进行杀菌；

（2）在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；

（3）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；

（4）上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面；

（5

处，对培养皿要过火烤干；

（6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；

（7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。

无菌接种步骤：

(1) 将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。

（2）材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm平方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。

（3）用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作过程（以试管为例）是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管口靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上，以放1-3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放（尖端向上）外，其他尚无统一要求。接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟。并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包口纸里面也要过火。