植物病原真菌的分离培养
实验二植物病原菌的组织分离
实验二植物病原菌的组织分离实验二植物病原菌的组织分离、培养和纯化一、实验目的通过本次实验学习植物病原菌分离培养及纯化的原理和常用的方法。
二、材料和用具玉米大斑病叶、灰斑病叶、苹果果实轮纹病及霉心病、甘薯黑斑病等材料，5%次氯酸钠溶液（有效氯为5%，见光分解，尤其紫外光，现用现配），75%酒精，剪刀，镊子，无菌水，灭菌培养皿，保鲜膜封口膜，记号笔、解剖刀，75%酒精小喷壶、酒精灯，打火机、、无菌滤纸、酒精棉、培养皿三、分离材料的选择为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。
病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。
四、植物病原菌的分离方法病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。
（一）.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，此法又分为小块组织分离和大块组织分离两种方法。
1、病斑类病原菌的分离（玉米大斑病病、灰斑病及苹果果实轮纹病的分离、甘薯黑斑病）（1）将无菌培养皿、镊子、无菌水、无菌滤纸、75%酒精小喷壶等放入无菌操作台，开紫外灯15分钟。
期间融化培养基备用。
（2）在操作台外，用酒精消毒双手，晾干。
在操作台内再次消毒双手，晾干，将融化并冷却到50℃左右的PDA以无菌操作倒入培养皿8—10ml，在桌面上轻轻摇动，敞开盖，制成平，凝固后待用。
（3）在操作台外，取分离材料，在病、健交界处剪取2—3毫米长的病组织。
（4）在无菌条件下，用5%的次氯酸钠溶液消毒3-5min，（时间长短依病组织不同而异，处理种子约5—10分钟）。
（5）用经过三次火焰灭菌的镊子将消毒的病叶移至无菌水中，漂洗3次，在滤纸上吸干水分，移至PDA平板培养基上，每皿可放均匀放3~4片，使材料与培养基紧密接触。
倒置于25—28℃恒温箱内培养。
（6）3~4天后，待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PDA培养基上，在25℃温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是否是玉米大斑病菌、灰斑病菌、黑斑病菌、轮纹病菌，若仅有这几种病原菌的分生孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。
植物病原菌分离方法
病原菌分离方法一、实验原理：植物患病组织内的真丝菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除了个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，重染病植物组织中将病原真菌与其他杂菌相分开并从寄主植物中分离出来，再将分离得到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病原的分离培养。
二、实验用具：酒精灯、手术剪、镊子、75%酒精、3%~5%次氯酸钠、灭菌水、培养皿、封口膜、乳酸等三、实验前的准备工作：1、煮培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉(AGAR)20g（10:1:1）水1000ml（1）将去皮称量好的马铃薯切片后加水煮沸15~20min（水可以适量多加200ml 左右，因为在煮的过程中会蒸发一些），待土豆煮软即可。
（2）三层纱布滤去马铃薯后将过滤的水倒入洗净的锅中，加琼脂粉搅拌充分后再加热煮沸，小火使其充分融化。
（3）加入葡萄糖并不断搅拌，待其完全融化后双层纱布过滤，定容到1000ml，分装到500ml的玻璃瓶内，每个玻璃瓶最多装300ml，121℃湿热灭菌30min。
2、培养皿干热灭菌170℃1h;蒸馏水、枪头等湿热灭菌121℃30min。
四、实验步骤：1、用75%酒精擦拭超净工作台，所有器具用紫外灯灭菌30min,分离室要保持清洁。
2、取样，病斑大小约20个（含病缘线）3、分装培养基：（1）融PDA，松盖在微波炉中加热约3min（看量多少而定）（2）待冷却至50℃后在超净工作台指示灯显绿灯时分装(3) 分装时滴入一管乳酸约20滴（每10ml培养基中加3滴乳酸）（4）左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15m1(300ml一瓶的培养基倒20多个平板)，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
4、表面消毒：（1）75%的酒精3ml~4ml没过样表面10s，快速吸掉酒精（2）3%~5%次氯酸钠（现配现用、避光）10ml消毒2~3min（3）无菌水冲洗2~3次5、转样：（1）器具经酒精灯消毒后无菌水水洗（2）培养皿上写明名称、分离时间后，在酒精灯旁转五点于培养基上。
一、植物病原真菌的分离培养及纯化技术2011
4．常规分离方法 •植物病原真菌的分离方法主要有两种：
组织分离法和稀释分离法。
•组织分离法是最常用的方法. •稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子 的病原真菌的分离。
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4.1 组织分离法
植物病原真菌的分离一般都是用组织分离法。 就是切取小块病健组织，经表面消毒和灭菌水 洗过以后，移殖在琼脂培养基平板上培养。 切取组织的大小要适宜，一般可将较大的 组织，在消毒液中消毒后切取中央部分，经灭 菌水洗过以后培养。
4、灭菌
制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。 分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、晾干 /烘干、包装好，进行干热灭菌。 灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌 化学灭菌、以及辐射灭菌等。 高压蒸汽灭菌：15磅/英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持续 15-30min，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。
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4.2.1 孢子分离法
产生大量孢子的病菌如青霉属(Penicillium)
、交链孢属(Alternaria)、小丛壳属
(Glomerella)、拟茎点霉属(Phomopsis)及茎点属
(Phoma)等，则可配制成孢子悬浮液,以稀释法或
划线法分离。
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许多真菌的孢子在成熟时有弹射的作用，这样就可以
2）向装有病组织的小碟中加入70%酒精
（约半碟）进行表面消毒，十几秒后倒掉 酒精。
注:先用70％的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡，
减少表面张力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间 较短(一般数秒至lmin)。
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3）向小碟中加入0.1%升汞或10%次氯酸钠
溶液（约半碟）进行表面消毒，处理时间 可自30秒至3分钟不等，然后倒掉废液。
植物病原真菌的分离培养精选文档
植物病原真菌的分离培养精选文档TTMS system office room 【TTMS16H-TTMS2A-TTMS8Q8-实验十三植物病原真菌的分离培养一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。
植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。
二、实验目的：植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。
三、实验材料及准备：1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。
2．分离用具（每小组为单位）酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。
四、实验方法及步骤：（一）、分离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。
若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。
病原菌的分离培养和纯化
普通植物病理学实验十七、病原菌的分离培养和纯化一、目的要求1了解分离与纯化微生物的基本原理及方法;2掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术;3掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法;二、基本原理植物病原菌的分离培养,是植物病理实验室工作中的基本技能;为了获得某微生物的纯培养,一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同,而供给它们适宜的生活条件,即让病原菌生活在适宜的培养基上,或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其他菌生长的环境,从而得到纯菌株;植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种;最常用的方法是组织分离法,而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离;病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用,在有些情况下也采用稀释分离法;为了获得分离菌的纯培养,必须要进行分离菌的纯化,纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法;三、材料、仪器与用具1．材料依当地情况进行选择,下列材料供参考1稻瘟病叶、病节、病穗颈pyricularia orycae;2玉米大斑病叶exserohilum turcicum;3玉米弯孢菌叶斑病叶curvularia lunata;4玉米小斑病叶bipolaris maydis;5番茄灰霉病果botrytis cinefca;6黄瓜菌核病果sclerotinia sclerotiorum;7黄瓜细菌性角斑病叶pseudomonas syringaepv．1achrymans;8水稻白叶枯病叶xanthomonas campestms pv.oryeue;9大豆细菌性斑点病叶pseudomonas syringaepv．glycinea;10白菜软腐病叶erudnia carotovora subsp．carotovora;2．培养基pda培养基；肉膏蛋白胨培养基；加寄主组织煎汁的培养基等;3．仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲针、接种环铒、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等;0．1％升汞溶液配制：升汞1e 浓盐酸2．5ml 蒸馏水1000ml;先将升汞溶于盐酸中,待充分溶解后,再加水稀释;升汞是剧毒药物,在操作时应特别小心;四、实验操作一病原真菌的分离1．组织分离法按照以下步骤进行：1取灭菌培养皿一个,置于湿纱布上,在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名;提示：为了保证无菌操作,应注意下面几点：工作前最好将所需的物品都放在超净工作台内,工作中临时去取容易带来杂菌；保证工作人员自身的洁净,工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；工作中,特别在使用无菌操作间时,呼吸要轻,不要说话;2用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1--2滴可减少细菌污染,然后将融化而冷至60c左右的pda培养基倒人培养皿中,每皿倒10--15ml,轻轻摇动使之成平面;凝固后即成平板培养基;提示：加入25％乳酸1～2滴,可基本保证平板上不出现污染细菌苗落;除乳酸外,在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长,也是常用的方法;加青霉素20μg／ml可以抑制g+细菌生长；加多黏霉素b5．0μg／ml可以抑制g—细菌生长；加链霉素40μg／ml或氯霉素50μg／ml可以抑制大部分细菌的生长;除了氯霉素可在灭菌前加入外,其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45c左右以手背触三角瓶感到烫,但尚可以忍耐为宜’时加入;倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领,不必在火焰上方,一般很少污染;3取真菌叶斑病的新鲜病叶或其他分离材料,选择典型的单个病斑,用剪刀或解剖刀从病斑边缘病健交界处切取小块海边长3--4mm病组织数块;提示：选择新患病的组织作为分离的材料,可以减少腐生菌混入的机会;腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生,因此,一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离;4将病组织放人70％酒精中浸3—5s后,按无菌操作法将病组织移人0．1％升汞液中分别表面消毒0．5、1、2、3、5rain也可使用其他表面消毒剂,如植物组织柔嫩,则表面消毒时间宜短；反之则可长些;然后放入灭菌水中连续漂洗三次,除去残留的消毒剂;提示：先用70％的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡,减少表面张力,70％的酒精亦用于表面消毒,处理的时间较短一般数秒至lmin;升汞溶液消毒的时间因材料而异,可自30s至30min不等,一般情况下,需时间3,5min;5用无菌操作法将病组织移至平板培养基上,每皿内放4--6块;提示：在将病组织小块移放到平板表面之前,应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水,以大大减少病组织附近出现细菌污染; 6将培养皿倒置放人2512左右恒温箱内培养;一般3—4d后观察待分离菌生长结果;7若病组织小块上均长出较为一致的菌落,则多半为要分离的病原菌;在无菌条件下,用接种针铲自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上,在25℃左右恒温箱内培养,数日后,观察菌落生长情况,如无杂菌生长,即得该分离病菌纯菌种,便可置于冰箱中保存;提示：除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外,还要在显微镜下检查,进一步确定;如果是对未知病原菌的组织分离,则要将长出的蕾落分别转出,通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌;在组织分离工作中,如果植物材料体积较大且较软如患灰霉病的番茄果实,在分离过程中可直接挖取内部患病组织移人平板培养基上,完成分离工作;2．稀释分离法1取灭菌培养皿三个,平放在湿纱布上,编号,并注明日期、分离材料及分离人姓名;2用灭菌吸管吸取灭菌水,在每一皿中分别注入0．5～1．0ml;3用移植环蘸一滴孢子悬浮液,与第一个培养皿中的灭菌水混合,再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中,混合后再移三环到第三个培养皿中;4将熔化开冷却到45～50c的培养基,分别倒在三个培养皿中为防止细菌污染,也可以向每个培养皿中事先加入1-2滴25％乳酸,摇匀,凝固,要使培养基与稀释的菌液充分混匀;提示：倒平板时的培养基温度一定要掌握好,过热易将病原菌烫死而使分离失败,过冷则倒入培养皿中后难以形成平板,而成为起伏不平的表面,不利于分离;为大体估计培养基温度,可将盛培养基的器皿靠在人手背上,如果手背感到烫但尚可以忍耐,则大体为45~50c;5将培养皿翻转后置恒温箱2513中培养,数日后观察菌落生长情况;6挑菌;将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取,接种到斜面培养基上,置25℃左右培养;待菌长出后,检查菌是否单纯,若有其他菌混杂,就要再一次进行分离纯化,直到获得纯株培养;二病原细菌的分离病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用;在进行分离之前,首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断,即经过镜检确认有喷菌现象以后,才对该病组织作分离工作;稀释分离法是最经典的标准分离法,方法同上述真菌分离;除去上述稀释分离法以外,较为方便的是划线分离法：1预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒在培养皿中,凝成平板后,翻转放在30c恒温箱中2—4h,使表面无水滴凝结;也可凝成平板后直接使用;2将病组织先用0．1％升汞表面消毒0．5--2min,再用无菌水换洗3次后,放在灭菌培养皿中的灭菌水中,用灭菌玻棒研碎,并让组织碎块在水中浸泡20—60min,让细菌释放到灭菌水中; 3用灭菌的接种铒接种环蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线,尽量不要把平板表面划破;划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼．冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线;灭菌后再划第三次线;提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要,这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大;4用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后,翻转培养皿,放在26～28c恒温箱中培养;1—3d后观察有无细菌生长,在哪些地方有单菌落生长出来其中的优势单菌落应为待分离菌形成的;5仔细挑取病原菌的单菌落,并移植到斜面培养基上;同时,再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离,经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致,并与典型描述的特征相一致时,即表明已获得纯培养;最好要经过连续三次单菌落的分离,才能确保纯化;三真菌、细菌培养性状观察1．真菌培养性状观察取已分离、纯化的某种真菌菌种,按前述稀释分离法中1--5步骤进行,待某培养皿中形成单个菌落后观察;记载以下内容：菌落颜色、菌丛密集及繁茂程度、是否有色素分泌出来而渗透到培养基中、菌落生长速度快慢等;同时要记载培养基种类成分及ph 和培养温度、光照条件;2．细菌培养性状观察1仿照上述真菌菌落形成步骤,观察记载以下内容：菌落颜色、菌落边缘形状、菌落表面是光亮还是粗糙或有皱折、菌落隆起情况、是否有色素分泌到培养基中,菌落生长速度快慢,是否有特殊气味形成等;同时要记载培养基种类成分及ph和培养温度、光照条件;2用接种铒环蘸细菌菌种后,通过无菌操作在肉膏蛋白胨等斜面培养基表面从下向上划一直线,过2～3d后长出的细菌群体称为菌苔,可仿照观察记载细菌菌落的记载内容,记载菌苔颜色、边缘形状、表面是光亮还是粗糙有皱折、隆起情况、是否有色素分泌到培养基中,是否有特殊气味生成,生长速度快慢等;也要记载培养基种类成分及ph和培养温度、光照条件;3用接种铒环蘸取细菌菌种后,通过无菌操作,将其接种在某种液体培养基中,数日后观察记载培养基中是否变混浊、是否有色素、气体、沉淀生成,培养液表面是否可生成菌膜等;也要记载培养基种类成分及ph和培养温度、光照条件;五、所需时间流程1．病原真菌分离组织分离：切取病组织,表面消毒,无菌水洗移人平板：1h;稀释分离：配孢子悬液,倒平板il培养7--10d分离菌移人斜面30min培养7--10d检查斜面上分离菌产孢30min 保存菌种2．病原细菌分离划线分离：倒平板沾菌悬液划线,1h;稀释分离3．病原真菌、细菌菌落培养性状观察平板上形成单菌落1--3d观察迦些写报告4．病原细菌菌苔培养性状观察斜面上形成菌苔i-3d观察30min写报告5．病原细菌液体培养性状观察接菌于液体培养基30min培养2--3d观察30min写报告六、实验作业l.上交分离的病原真菌、细菌菌种;2．写出病原真菌、细菌培养性状观察的实验报告;七、思考题1．如果要分离的病原真菌是鞭毛菌中的腐霉菌、疫霉菌等应当如何进行才会获得更好的效果2．在分离病原真菌时,向平板培养基中加人乳酸为什么会大大减少细菌的污染3．如果要从土壤中分离某种病原菌,应当采取什么样的分离方法会更有效4．观察记载真菌及细菌的培养性状有何意义5．怎样才能知道你获得的病原真菌、细菌的菌种是否是纯培养附1 常用的几种典型的病原菌分离方法1．斑点病原菌的分离;从病斑部分切取每边3—5mm的小块组织,在70％酒精中浸数秒钟后,移人0．1％的升汞水溶液中处理3—5rain,以灭菌水冲洗3次,移置培养皿的培养基中,然后培养;2．维管束组织内病原菌的分离;从根茎维管束组织分离病菌,可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒,将表皮组织用灭菌的解剖刀削去,然后切取其中小块变色的维管束组织,用升汞或漂白粉液消毒后,用灭菌水冲洗几次,移置培养基面上;3．根腐病病原菌的分离;根腐或基腐病的分离,由材料的大小决定;材料小的可仿照斑点病的分离法,材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法;4．肉质组织中病原菌的分离;多肉的根、茎及果实等,可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织,切取小块病组织分离;如有杂菌感染可采用“直接接种”法,待出现症状后,用此法再行分离;5．种子内病原菌分离;将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒升汞或漂白粉,用灭菌水洗涤后,移置培养基上;6．孢子分离法;能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等,则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之;7．土壤带菌分离法;为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形,从有病的土壤中分离它们是必要的;分离方法是将土壤取出少许,配制成悬浮液,然后用稀释法或划线法分离;。
植物病原真菌的鉴定方法
植物病原真菌的鉴定方法
1.细胞学观察方法
细胞学观察是一种基本的方法，可以通过显微镜观察到真菌的形态特征，包括菌丝、分生孢子、子囊果或担子菌等。
通常需要在标本中涂抹或切片，并使用染色技术（如孢子染色）增强对真菌结构的观察。
这种方法可以快速初步确定是否存在真菌感染。
2.分离培养方法
将病部组织切片或分离的孢子直接接种在富含营养物质的培养基上，可以有效地分离出感染的真菌。
不同真菌对培养基的需求不同，例如选择富含蔗糖、白蛋白、琼脂（PDA）的培养基，则可以培养出广泛的真菌种类。
培养后真菌形成的菌落形态也是进行鉴定的重要参考依据。
3.DNA分子鉴定方法
分子鉴定方法基于真菌特定的DNA序列进行分析，通过PCR扩增和测序技术可以确定真菌的物种。
这种鉴定方法具有高度的准确性和重复性，可以快速识别具有高度相似形态特征的真菌。
4.抗体检测方法
抗体检测方法利用特异性抗体与真菌的抗原结合，通过形成特定的免疫复合物来确定真菌的存在。
这种方法常用于快速筛查和初步鉴定真菌感染，但受到抗体的特异性和敏感性的限制。
5.生物学鉴定方法
生物学鉴定方法通过观察真菌的生物学特性，如生长速度、菌落形态、分生孢子形态和产孢情况，进行鉴定。
这些特性可能受到环境条件的影响，因此需要与其他鉴定方法相结合使用。
植物病原真菌的鉴定方法
植物病原真菌的鉴定方法植物病原真菌是导致植物疾病的主要原因之一，对其进行准确的鉴定可以帮助农民和植物病理学家采取正确的防治措施。
本文将介绍常用的植物病原真菌鉴定方法。
一、外部形态鉴定法外部形态鉴定法是最常用的真菌鉴定方法之一。
通过观察真菌的菌丝、孢子、子实体等形态特征，可以初步确定其属种。
一般可以从患病植物的病斑、病果或病茎中采集样本，将其放置在玻璃片上，加入适当的溶液后，在显微镜下观察和测量其形态特征，比如颜色、形状、大小等。
二、组织学鉴定法组织学鉴定法主要是通过显微镜下观察真菌在植物组织中的生长和病变情况，从而确定其病原性和感染方式。
常用的方法包括石蜡切片法和组织分离培养法。
石蜡切片法是将植物组织固定在石蜡中，然后用切片机将其切成薄片，再染色并观察。
组织分离培养法是将植物组织切碎，然后将其接种到适当的培养基上，观察真菌的菌丝和孢子的生长情况。
三、生物学鉴定法生物学鉴定法是通过观察真菌在不同培养基上的生长特性、菌丝和孢子的形态特征以及生殖方式等，来确定其属种。
常用的生物学鉴定方法包括培养特性观察法、生殖器官观察法和生理生化特性观察法。
培养特性观察法是将真菌接种到不同培养基上，观察其生长速度、菌落形态和色素产生情况。
生殖器官观察法是观察真菌的生殖器官，如子实体、子囊盘和拟囊等，以确定其属种。
生理生化特性观察法是通过观察真菌在不同培养条件下的生理生化特性，如温度和pH值对其生长的影响，以及酶特性等。
四、分子生物学鉴定法分子生物学鉴定法是一种较为准确的真菌鉴定方法，通过分析真菌的DNA序列来确定其分类地位。
常用的分子生物学鉴定方法包括PCR方法和序列分析方法。
PCR方法是在真菌DNA中选择特异的基因片段进行扩增，并通过电泳检测扩增产物的大小和形态，从而确定真菌的分类。
序列分析方法是通过测定真菌DNA序列，与数据库中已知真菌的序列进行比对，从而确定其物种分类。
植物病原真菌的鉴定方法有外部形态鉴定法、组织学鉴定法、生物学鉴定法和分子生物学鉴定法等。
植物真菌类病害组织病原菌的分离及抑菌圈实验[技巧]
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植物真菌类病害组织病原菌的分离及抑菌圈实验1、病原菌的分离培养及保存1.1材料：（1）病害组织（2）分离培养基（PDA培养基）：20%土豆煮汁，2%琼脂条，1%葡萄糖，蒸馏水，121℃高温灭菌（3）次氯酸钠（4）试管斜面培养基：成分为PDA培养基，121℃高温灭菌1.2方法：剪取作物病害部位，将病害部位用次氯酸钠表面消毒后，置于分离培养基上，然后放置于28℃恒温培养箱内培养。
7天后取出，通过菌落形态和孢子镜检挑选出所要分离的病原菌转接试管斜面，然后将斜面放置于28℃恒温培养箱内培养。
7天后取出，包好放于4℃冰箱内低温保存。
2、病原菌摇瓶菌丝体的培养及菌液的制备2.1材料：（1）试管斜面孢子（2）摇瓶培养基：20%土豆煮汁，1%葡萄糖，蒸馏水，121℃高温灭菌。
2.2方法：将试管斜面孢子转接到摇瓶培养基，然后将摇瓶放到220转/分的摇床上培养，2—3天后，摇瓶菌丝体长到一定的成熟状态（不同真菌菌丝体不同）后，取下摇瓶，放于4℃冰箱内低温保存，待需要做抑菌圈实验时，将摇瓶从冰箱内取出，用组织捣碎机将摇瓶菌丝体高速捣碎2分钟左右，至菌液状态。
3、供试药剂的抑菌圈实验3.1材料：（1）打碎的病原菌菌液（2）底层培养基：2%琼脂粉、蒸馏水，121℃高温灭菌。
（3）上层培养基：成分同PDA培养基，121℃高温灭菌。
（4）链霉素溶液：2400U/mL3.2方法：（1）融化底层培养基，待温度降至70℃，倒入测定木盘，放平至凝固。
（2）融化上层培养基，待温度降至54℃，用无菌移液管加入1mL链霉素溶液以防杂菌干扰；继续降温至48℃，用无菌移液管加入6—12mL的病原菌菌液后迅速晃匀后，倒入测定木盘，放平，待凝固后，即做成抑菌圈实验所用的测定盘。
（3）稀释供试药剂到制定浓度。
（4）在测定盘内摆放牛津杯。
（5）用P型移液器将稀释好的药剂滴入牛津杯内，滴液量为0.26mL/杯，然后盖上玻璃板，放置于28℃恒温培养箱内培养，培养时间为16—18小时。
一植物病原真菌的分离培养及纯化技术
从受害的边缘部分分离这一原则，对于绝大部 分病害都是适用的。
例如： •果实的腐烂病，就应该从刚开始腐烂的部分分离。 •根腐病和枯萎病也是如此，应该尽可能从病株离土需较 远的部分分离。 •值得注意的是有些有晕圈的斑点病（如野火病），病菌 局限在斑点中央的坏死组织中，从病斑的边缘是分离不到 病菌的。当然，这类病害是比较少的。
或三角瓶中。
➢试管分装时，使用玻璃漏斗。
➢装入量视试管大小及用途而定，固体培养基的
分装量为管高的1/5左右，用三角瓶分装培养基时， 容量不宜超过容积的1/3----1/2。
注意：不要将培养基沾到管口或瓶口上，以免沾 湿棉塞而引起污染。
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4、灭菌 制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。
分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、晾干/ 烘干、包装好，进行干热灭菌。
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采得的材料如已经败坏而沾染大量的腐生菌，有时可以 采用接种后再分离的方法，即将沾染有腐生菌的病组织作 为接种材料，直接接种在健全的植物组织工植株上，等发 病后再从病株或病组织分离。先接种再分离的方法，用得 较多的是植物病原细菌的分离。
引起果实和蔬菜腐烂病的真菌，如腐霉属(Pythium)和疫霉属 (Phytophthora) 的真菌，用这种方法分离的效果也很好。
•1.5 无菌操作前还要用70％酒精擦手；
•1.6 工作中，特别在进行无菌操作时，呼吸要轻，不 要说话等。
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2．分离材料的选择
分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响。 • 病害材料应尽可能新鲜，如可选择新近发病的植株、器 官或组织作为分离的材料，可以减少腐生菌的污染。
• 最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料 新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃 ，容易分离成功。
【精品】植物病原真菌的分离培养
【精品】植物病原真菌的分离培养植物病原真菌的分离培养是植物病害学研究中的常规技术，它是诊断病原微生物的重要手段。
通过环境、罹病组织或病株上的真菌分离，可以准确地确定病原物种，病害发生的原因和病害防治的策略。
本文将介绍植物病原真菌的分离培养方法及其注意事项。
一、实验材料1. 植物体、果实或病株。
2. 无菌匀质培养基：具备营养丰富，pH约为7.0，含有适量的蔗糖、氨基酸、维生素和矿物质元素。
3. 无菌器具：试管、培养皿、匀质棒、无菌酒精灯、注射器等。
二、分离方法1. 选材：选择患病植物或病株，减少环境污染的干扰，以便于真菌分离和培养。
2. 分离：在实验室中进行无菌操作，将病株或罹病组织的表皮割去，注意不要带皮层或子叶，然后用30%的酒精或75%的酒精消毒5-10秒，沥干后放入无菌盘中。
3. 培养：将培养基煮沸，冷却后加入抗生素，避免杂菌污染，用培养皿接种盘，置于26℃左右的恒温箱中孵育。
初次孵育检查时间视病原真菌的生长速度而定，通常在1-2周内可见初生菌丝和菌落。
如果没有生长或生长极为缓慢，可能需要增加孵育时间或重新分离。
4. 子培养：将孵育的菌落通过匀质棒挑选到其他含有抗生素的培养基中，进行子培养，以保证分离出的真菌种属的准确性。
如培养子菌落中有杂菌或真菌菌落与初步分离的不一致，应重新分离。
5. 稳定培养：对于经过检查并确认是病原真菌的菌株，应进行深层冻存或贮存，以免失掉纯度，同时要做好鉴定记录。
三、注意事项1. 操作要无菌，防止环境污染，避免误诊。
2. 病株样品与周围环境隔离，减少环境干扰。
3. 选用适当的培养基，保证真菌菌落的生长和营养。
4. 操作时注意安全，避免接触真菌孢子、毒素等对人体有害的物质。
5. 菌落的检查应在暗的环境下进行，以免光照影响观察结果。
四、结语植物病原真菌的分离培养是诊断和定位植物病害的一个重要工具。
通过正确的操作方法和注意事项，可以准确地分离出病原菌，并对其性质和特征进行鉴定和确认。
土壤和植物中真菌的分离培养方法
土壤和植物中真菌的分离培养方法土壤和植物中的真菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，它们在生态系统中发挥着重要的作用。
了解土壤和植物中真菌的分离培养方法对于研究真菌的多样性、功能以及与植物的互作关系具有重要意义。
本文将介绍一种常用的真菌分离培养方法——基于菌丝体的分离培养方法。
一、准备工作1. 备好培养基：选择适合真菌生长的培养基，如马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）或玉米葡萄糖琼脂培养基（CZ）等。
2. 采集样品：在需要研究的土壤样品或植物根际中采集菌丝体，避免太多土壤或根部残留物的混入。
3. 消毒工具：将培养皿、培养瓶、锥形瓶等工具用高温或酒精等消毒，避免细菌或其他真菌的污染。
二、分离培养方法1. 样品处理：将采集到的土壤样品或植物根际样品放入无菌研钵中，加入适量的无菌蒸馏水或生理盐水，用力搅拌均匀使菌丝体分散。
2. 稀释处理：将悬浮液进行稀释，取适量悬浮液分别接种到含有培养基的培养皿或培养瓶中，用无菌铁环均匀涂布在培养基表面。
3. 培养条件：将培养皿或培养瓶放入恒温培养箱中，温度一般控制在25-28℃，光照条件视具体真菌而定，一些真菌需要暗培养。
4. 纯化菌株：观察培养皿或培养瓶中的菌落形态，选取单独的菌落进行传代培养，直至获得纯化的真菌菌株。
5. 储存菌株：将纯化的真菌菌株进行冷冻保存或液氮保存，以备进一步研究使用。
三、注意事项1. 避免污染：在整个分离培养过程中，要注意无菌操作，避免其他微生物的污染，尤其是细菌和其他真菌的干扰。
2. 培养基选择：不同真菌对培养基的要求不同，可以根据具体需要选择不同的培养基，也可以尝试不同的培养基，以寻找最适合目标真菌生长的培养基。
3. 培养条件调节：真菌的生长受到温度、光照、湿度等环境因素的影响，可以根据具体研究需要对培养条件进行调节，以促进或抑制真菌的生长。
4. 观察与记录：在培养过程中，要及时观察并记录菌落的形态、颜色等特征，以及菌丝的生长情况，为进一步研究提供参考。
植物病原接种实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本次实验旨在通过学习植物病原真菌、细菌、病毒和线虫的分离、培养和接种方法，掌握其基本原理，并了解植物传染性病害研究中常用的接种方法。
通过实验操作，观察不同接种方法对病害发生发展过程与外界环境的影响，为植物病害的防治提供理论依据。
二、实验材料与用具1. 材料：- 新鲜的真菌和细菌病害材料：辣椒炭疽病果、水稻稻瘟病病叶片、水稻白叶枯病叶、烟草花叶病和番茄根结线虫病等。
- 番茄青枯菌/番茄、水稻稻瘟菌/水稻幼苗、水稻白叶枯病菌/稻苗、烟草花叶病/烟草。
2. 用具：- 喷雾器、纱布、酒精灯、酒精缸、火柴、接种饵（针）、长镊子、玻棒、小木块、解剖刀、刀片、载玻片、蒸馏水（滴瓶）、漂白粉精片、研缸、漏斗、皱纹纸、毛笔、针、剪刀、三角瓶、试管、记号笔、标签、金刚砂、保湿罩、弥雾机。
- 70%乙醇、0.1%升汞、灭菌培养皿（吸管）、灭菌水、灭菌培养基（PDA和NA）。
三、实验方法1. 病原真菌的分离和培养：- 在无菌操作室或超净工作台上进行。
- 将受病组织边缘靠近健全组织的部分分离，减少污染。
- 将分离得到的组织块接种于PDA培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养。
2. 病原细菌的分离和培养：- 同样在无菌操作室或超净工作台上进行。
- 将受病组织块接种于NA培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养。
3. 病原病毒的分离和培养：- 取烟草花叶病叶片，用研磨法提取病毒。
- 将病毒稀释液接种于烟草幼苗上，观察症状。
4. 病原线虫的分离和培养：- 从番茄根结线虫病病根中提取线虫。
- 将线虫接种于含有新鲜植物组织的培养皿中，观察线虫生长情况。
5. 接种方法：- 采用喷雾法、点种法、穿刺法等接种方法，将病原菌接种于健康植物上。
四、实验结果与分析1. 病原真菌的分离和培养：- 成功分离得到辣椒炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、水稻白叶枯病菌等。
- 在PDA培养基上，观察到菌落形态、颜色和生长速度等特征。
2. 病原细菌的分离和培养：- 成功分离得到番茄青枯菌、水稻白叶枯病菌等。
植物病原真菌的分离原理
植物病原真菌的分离原理
植物病原真菌的分离原理主要包括以下几个步骤：
1. 采样：选择受感染的植物部位，如叶片、茎、果实等，并避免采样过程中的污染。
2. 表面消毒：使用消毒剂如70%酒精或10%次氯酸钠溶液，对样品进行表面消毒，以杀灭植物表面的细菌和真菌。
3. 组织处理：将消毒后的植物组织切碎或切割成小块，以增加真菌的释放。
4. 培养基接种：将处理后的植物组织均匀地分散于含有适宜营养物质和抑菌剂的培养基上，如琼脂培养基。
5. 培养条件：将接种好的培养基置于适宜的温度和湿度条件下，有利于真菌的生长。
6. 观察和分离：观察培养皿上是否有真菌生长，如果有，则进行分离，通常通过挑取单个真菌菌丝并转移到新的培养基上进行单菌种的培养。
7. 鉴定和纯化：通过对分离得到的真菌进行形态学观察、生理生化特性研究以及分子生物学分析等方法，鉴定其属种和病原性，并进行纯化培养。
通过以上步骤，可以将植物病原真菌从植物组织中分离出来，并得到纯化的菌种，为进一步研究真菌的生物学特性和病害防治提供了基础。
简述植物病原真菌组织分离法和稀释(孢子)分离法的适用材料及优缺点-概述说明以及解释
简述植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的适用材料及优缺点-概述说明以及解释1.引言植物病原真菌是引起农作物疾病的主要病原体之一，研究植物病原真菌的组织分离方法和稀释（孢子）分离方法对于疾病的诊断和防治具有重要意义。
植物病原真菌组织分离法是通过从感染植物组织中分离出纯种的真菌菌落，从而研究其特性和致病机制。
稀释（孢子）分离法则是通过将真菌孢子稀释到一定浓度后分离，利用分离得到的孢子进行研究和防治。
本文将对这两种方法的适用材料、优点和缺点进行简述和总结，以期为植物病原真菌研究提供参考。
）分离法的缺点":{}}}}请编写文章1.1 概述部分的内容1.2文章结构文章结构是指文章的整体架构和组织方式，帮助读者更好地理解和掌握文章的内容。
本文主要介绍植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的适用材料及其优缺点。
具体的文章结构如下：1. 引言1.1 概述1.2 文章结构1.3 目的2. 正文2.1 植物病原真菌组织分离法2.1.1 适用材料2.1.2 优点2.1.3 缺点2.2 稀释（孢子）分离法2.2.1 适用材料2.2.2 优点2.2.3 缺点3. 结论3.1 总结植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的适用材料3.2 总结植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的优点3.3 总结植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的缺点在文章结构中，逐步展开对植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的介绍，包括适用材料、优点和缺点等方面的内容。
最后通过结论对两种方法进行总结和概括，使读者对这两种方法有个整体的认识。
1.3 目的本文的目的是对植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的适用材料及其优缺点进行简要描述和分析。
通过介绍这两种常用的真菌分离方法，旨在帮助读者更好地了解和选择适合的实验方法，提高病原真菌的分离效率。
具体而言，我们将详细介绍植物病原真菌组织分离法的适用材料，包括所需的培养基、植物组织、分离介质等。
病原物的分离与培养
病原物的分离与培养病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。
一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。
所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。
病原物的分离与培养，需经以以几个步骤:1.有关器皿的灭菌和消毒；2.制作培养基；3.病原菌的分离4.病原菌的培养。
－、灭菌与消毒灭菌与消毒是两个不同的概念。
灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。
消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。
消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。
(一) 热力灭菌热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。
1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。
在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。
因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。
但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。
干热灭菌使用的仪器是烘箱。
干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。
火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。
涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。
通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。
此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。
进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
植物病原菌分离方法
植物病原菌分离方法（综合版）植物病原细菌分离方法：分离培养基（NA）植物病原细菌的方法一般采用稀释分离法：1.取灭菌研钵加无菌水适量，切去4 mm大小病块组织，经过表面消毒和无菌水冲洗3次后放入研钵中研碎，静置10-15 min，使组织中的细菌进入水中制成悬浮液；2.配制不同稀释度的细菌悬浮液；准备3-5个灭菌培养皿，每个加200 µl无菌水；3.用灭菌移植环从第1个培养皿中移植1-2环细菌悬浮液到第2个培养皿中，充分混匀后再从第2个培养皿移植1-2环到第3个培养皿中，依次类推；4.平板划线分离，28℃培养2-3天；5.挑取单菌落划线再次纯化；菌落形态观察：1.形状和大小、颜色和光泽、表面是否隆起或凹陷、边缘的形状、透明度和粘度、培养基颜色的变化等；2.菌苔表面有光滑的、不平整的和皱褶的、易挑取、质地均匀3.菌苔颜色也不同，质地有粘质的、膜质的或蜡质的。
有透明的、半透明的或不透明的，表面有暗色或发亮的4.菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等特征注：1.若分离成功，平板上菌落形态和大小比较一致，即使出现几种不同形状的菌落，终有一种是主要的；2.如果菌落类型很多，且不分主次，很可能未分离到病原细菌，应考虑重新分离；3.如果不熟悉一种细菌菌落的性状，就应选择几种不同类型的菌落，分别培养后接种测定其致病性，最终确定病原菌；4.一种细菌病害一般由一种病原菌引起的，平板上出现几种不同类型的菌落实质上只有一种是真正的病原细菌；5.腐烂型的细菌病害即使是混合侵染的，但也有一种是主要的。
6.各种植物病原细菌生长快慢不同：假单胞菌属和欧文氏菌属1-2天土壤杆菌属细菌2-3天黄单胞菌属细菌3-4天棒杆菌属的细菌5-8天才出现明显的菌落植物病原细菌生长量测定法直接法测体积粗放的方法，将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心，然后观察沉降物的体积。
称干重采用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10%~20%。
植物病原真菌的分离培养
实验十三植物病原真菌的分离培养一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体,如果给予适宜的环境条件,除个别种类外,一般都能恢复生长与繁殖。
植物病原菌的分离就就是指通过人工培养,从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开,并从寄主植物中分离出来,再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化,这个过程总称植物病菌的分离培养。
植物病原真菌的分离一般都就是采用组织分离法,就就是切取小块病组织,经表面消毒与灭菌水洗过后,移到人工培养基上培养。
二、实验目的:植物病原菌的分离培养就是植物病理学实验最基本的操作技术之一,它对原害鉴定,病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都就是经常使用的研究手段。
通过本实验,要求植物病原菌分离培养的一般原则与方法。
三、实验材料及准备:1.分离材料:梨黑斑病(Alternaria kikuchiana),柿树圆斑病(Pestnlotia sp)及杉木炭疽病(Glomerella cingolata)新发病的病叶;杨树烂皮病(Cytospora chrysosperma)国槐腐烂病(Dothiorella sp、)的带有新病斑的枝条;油松种子。
2.分离用具(每小组为单位)酒精灯4个,手术剪4把,眼科镊4把,PDA培养基3瓶,培养皿(Φ9cm)24套,小烧杯(5ml)4个,大烧杯1个,斜面培养基12管,灭菌水4瓶,75%酒精瓶1个(内放脱脂棉球)0、1%升汞瓶1个,5%乳酸瓶(60ml)1个,火柴1盒,湿、干纱布各4张。
四、实验方法及步骤:(一)、分离前的准备工作:1.工作环境的清洁与消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台(超净工作台)上进行,无菌室与无菌箱要经过喷雾除尘,并用药物或紫外线照射消毒(常用消毒药物为70%酒精,2%煤酚皂液,5%石炭酸液等喷雾。
若用紫外线灯照射则需20-30分钟)。
在没有上述设备条件时,在清洁房间里关闭门窗,避免空气流动,经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作,也可获得较好的结果。
一植物病真菌的分离培养
（三）组织表面消毒 最常用的表面消毒剂有0.1%升汞溶液和70%酒精溶液。组织表面消 毒时间，因不同材料而不同，一般用1-3分钟。
升汞溶液图片
（四）分离方法
1.取熔化的马铃薯培养基，温度降至40℃时滴入抑菌剂，摇匀 后将管口经酒精灯火焰上灭菌后将培养基注入灭菌皿内，轻轻 转动培养皿，使培养基迅速平铺皿底，制成平板。 2.取新鲜病叶病组织4-5小块（约0.2-0.3cm2），置70%酒精内1 秒钟降低表面张力，然后置0.1%升汞里消毒1-2分钟。 3.用灭菌镊子将消毒组织移入灭菌皿中，用灭菌水换洗三次。 4.然后用灭菌镊子小心将小块病组织小心、迅速移入培养基平 板上，每皿4-5块，均匀放置。
实验一 植物病真菌的分离培养
作 者：杨明秀
副教授
单 位：东北农业大学农学院
一、目的要求
学习植物病原真菌的一般分离培养方法。 二、材料
玉米大斑病叶片。
三、实验内容 （一）准备工作：分离工作应在清洁的环境下进行，最好在无菌操作箱内 进行，没有无菌操作室和无菌操作箱可以在普通洁净的实验室内进行。
（二）分离材料选择 取材料后选择新鲜、症状典型的病组织，一般分离时采用病健 组织交界部分作为分离材料。
5.将培养皿置于25℃温箱培养，一周后观查结果。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ结果图片
五、作业 每组进行病原菌分离，记录实验结果 ，写出实验报告，分析分离成功与失败的原 因。
玉米大斑病症状
Exserohilum turcicum 形态图
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实验十三植物病原真菌的分离培养
一、实验原理
植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。
植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。
二、实验目的：
植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。
三、实验材料及准备：
1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。
2．分离用具（每小组为单位）
酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）0.1%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。
四、实验方法及步骤：
（一）、分离前的准备工作：
1．工作环境的清洁和消毒
分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。
若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。
在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。
工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。
将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新洁尔灭擦手。
2．分离用具的消毒
凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、镊、针等）都要随时（至少在使用时）保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次（刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火）。
再次使用时必须重复灭菌。
培养皿、试验等要
经过干热灭菌。
培养基及洗涤或稀释用蒸馏水都需要事先经过高压蒸气灭菌。
3．分离材料的选择
用新发病的植株、器官或组织做为分离材料，可以减少腐生菌的污染。
任何植物坏死部分的内部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑点病害应从邻近健全组织，即从病、健组织交界处获得分离材料。
（二）、植物病原菌的分离
1．叶斑类和枝杆病斑类（非维管束侵染）病原菌分离：
首先选择具有典型症状的新鲜病叶作为分离材料，按下述步骤操作：
①培养基平板制备：将PDA培养基在微波炉中加热熔化验，以无菌操作法将溶化过的培养基倾注入灭过菌的培养基中，每皿经12毫升，可形成2-3毫米厚的平板。
（为防止细菌污染，倒碟前给每三角瓶内加6%乳酸4-6滴）。
②病叶或病枝经自来水冲洗，从病斑周转1-2毫米处的健组织部位剪下（若为枝干，则将带有病斑的皮层剥下，但）。
③取10毫升小烧杯经酒带消毒，放入分离材料，倒入0.1%升汞液适量作表面消毒一分钟，或用1%漂白粉消毒均可。
④消毒后倾出消毒液，用无菌水冲洗2——3，最后一次无菌水不要倒掉。
⑤用灭菌镊，剪在无菌水中将分离材料剪成2——3毫米大小的方块，每块组织均应为病健相间组织。
用灭菌镊子夹取剪好的材料，放入培养基平板上，轻轻按压。
每皿4——5块，排放均匀。
⑥用蜡笔在培养皿上注明分离代号，日期、姓名，将培养皿翻转放置于23—25℃
⑦3——4日后挑选由分离材料上长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，于25℃温箱中培养。
2．种子内病菌的分离：
将整粒种子或种子的一部分进行冲洗，再经表面消毒（升汞或漂白粉），最后用灭菌水洗涤后移到人工培养基平板上培养（或者直接放在皿内保湿培养于25℃温箱中）。
3．为害输导组织病原的分离（以枯萎病为代表）
先将分离茎作表面消毒，然后用灭菌刀剥去表皮，剪取其中小块变色的维管束组织，再用漂白粉进行表现消毒后，移于培养基平面上培养。
4．分离物的纯化
前述方法获得分离物，必须经过纯化，才能成为培养，纯化的方法有单孢子分离法和边续稀释培养法两种，后者简便，为了一般研究所常用。
连续稀释法：对真菌材料来说，就是从典型菌落边缘切取含有菌丝的培养基一小块，移植于另一培养基平板上，待菌落形成后，再依此法移植。
如此数次，直至菌落形态典型，无杂菌时即可移入斜面试管中培养保存。
附：
1、0.1%升汞液的配制：升汞1克，浓盐酸2.5毫升；加水1000毫升。
注意要先将升汞用盐酸溶解，然后加水稀释。
2、P.D.A培养基成分；马铃薯200克，葡萄糖10—20克，洋菜17—20克，水1000毫升。
3、水洋菜培养基成分，洋菜17—20克，水1000毫升。
作业：
1、简述病原菌分离步骤；
2、报告分离培养结果，并分析成功或污染的原因；。