产几丁质酶酵母菌的筛选与鉴定
抗稻瘟病几丁质酶产生菌的筛选及产酶条件的研究
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温度 （ ℃）
图 ４ 温 度 对 菌 株 产 酶 活 力 的 影 响
取在 Ｌ Ｂ培 养 液 中培养 ２ ｄ的 Ｈ３和 Ｈ９菌株种
第２ １卷 第 １ 期
２１ ０ １年 ３月
湖 南 工 程 学 院 学 报 Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｕ ａ ｎ ｔｔ ｔ ｆＥｎ ｉ ｅ ｒｎ ｏ ｒ ａ ｆＨ ｎ ｎ Ｉ ｓｉｕ ｅｏ ｇｎ ｅ ｉｇ
Ｖｏ ． １ Ｎｏ １ １２ ． ．
Ｍ ａ． ｒ ２Ｏｌ ｌ
抗 稻 瘟 病 几 丁 质 酶 产 生 菌 的 筛 选 及 产 酶 条 件 的研 究
参照 中国科学 院上海植 物生理研 究所和 上海市 植 物 生 理 学 会 主 编 的 《 代 植 物 生 理 学 实 验 指 现
南》 ［ ．
１ ３ 稻 瘟 病 病 原 茵 细 胞 壁 悬 浮 物 制 备及 菌 株 筛选 ．
质 的降解 产物 一几丁寡糖 能诱导启 动植 物的 防御 系 统， 刺激植 物生 长发育Ｌ ． 丁质酶 产生菌是 一类 能 ２几 ］ 够 利用几 丁质为碳 源 而 生长 的 微生 物 ， 其共 同特征
隔 １ ２ｈ检 测一 次几 丁质 酶 活 力 ． 结果 如 图 ３所 示 ，
Ｈ３菌株从 ６ ０ｈ开始 产 酶活力 增 长加 快 ， ７ 到 ２ｈ时 达 到最 高值 ． ２ｈ后 酶 活性 逐 渐 下 降． 可 能 是 随 ７ 这 着 时 问的延 长 ， 养 液 中 产 生 大 量 芽 孢 ，营养 体 生 培 成 减少 ， 导致 产 酶能 力 下 降． Ｈ９菌株 酶 活力 增 长 比
产几丁质酶芽孢杆菌的筛选鉴定和酶活力测定_顾真荣
上海农业学报2001,17(3):92～96 Acta Agriculturae Shanghai 文章编号:1000-3924(2001)03-92-05产几丁质酶芽孢杆菌的筛选鉴定和酶活力测定顾真荣 马承铸(上海市农业科学院植物保护研究所,上海201106)韩长安(上海市农业技术推广服务中心,上海201103) 摘 要 从103份采自中国各地的土样中分离得到了312株芽孢杆菌,用平板透圈法筛选到3株产几丁质酶菌株G 1、G 2和G3。
经鉴定,G1为短芽孢杆菌(Bacillus brevis );G2为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis );G3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )。
它们在几丁质平板上的透明圈直径以G1>G 3>G2为序,在以Schales '法测定壳聚糖酶活力时,其摇瓶发酵上清液的酶活力以G 3>G1>G2为序。
本文首次报道短芽孢杆菌产生几丁质酶和壳聚糖酶。
关键词 芽孢杆菌;几丁质酶;筛选;鉴定;测定中图分类号:Q 55;Q 939.124 文献标识码:A 几丁质又称甲壳素,是广泛分布于自然界的生物多聚物,每年都有上百亿吨的生物量产生,数量仅次于纤维素。
几丁质和几丁质酶的利用一直是生命科学中的重大课题,在环境保护、医学、化学和农业等方面具有重大的潜在应用价值[1,2]。
几丁质酶广泛存在于植物、动物和微生物中。
细菌的几丁质酶由于潜在的商业用途倍受人们关注,粘质沙雷氏菌(Serratia marc enscens )是人们长期来研究的热点[3]。
对环境和卫生方面安全的芽孢杆菌亦有较多的研究。
已报道能产几丁质酶的芽孢杆菌有环状芽孢杆菌(B .circulans )[4,5]、蜡状芽孢杆菌(B .cereus )[4]、地衣芽孢杆菌(B .licheniformis )[4]和枯草芽孢杆菌(B .subtilis )[4,6]。
产几丁质酶的筛选及活力测定
产几丁质酶的筛选及活力测定一、实验材料1.菌种：白僵菌，或其他菌种及土壤采样等(菌种接种于PDA斜面上，28℃，80％RH 培养14 d后分别置于4℃和20℃备用。
)2.试剂：DNS试剂:（称取3，5-二硝基水杨酸3．15 g，加水500 mL。
，搅拌5 s，水浴至45。
然后逐步加入100 mL 0．2g/mL的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌。
直到溶液清澈透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃)。
再逐步加入四水酒石酸钾钠91．0 g苯酚2．5 g和无水亚硫酸钠2．5 g。
继续45"C水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。
停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000 mL。
用烧结玻璃过滤器过滤，取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。
室温下存放7 d后可以使用。
) 几丁质酶基础培养基(g／L)：葡萄糖5．09，蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，FeS04·2H20 0．1 g，pH 7．0。
几丁质酶诱导培养基(g／L)：蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，ZnS04·7H202 0．01 g，胶体几丁质10 ml，pH 7．0。
（胶体几丁质固体培养基。
0.5 g K2HPO4，0.5 gKH2PO4，0.5 g MgSO4·H2O，0.1 g FeSO4·7H2O，0.1 gZnSO4·7H2O 500 ml 1%胶体几丁质，500 ml蒸馏水，15 g 琼脂，pH7.2，121℃灭菌15 min，冷却至50℃左右倒平板）马铃薯培养基(PDA)；去皮的马铃薯200 g切块，沸水煮30 min，纱布过滤，20 g蔗糖，209琼脂，加热至全部溶解，定容至1 L。
二、筛选1.初筛采用平板透明圈法。
用0．1 mL孢子悬液(1×107／mL)滴于几丁质平板的中央(每个样品重复3次)，28℃培养7d，其菌落周围有透明圈出现。
酵母工程菌表达的几丁质酶分离及酶学性质研究
酵母工程菌表达的几丁质酶分离及酶学性质研究几丁质酶是一类能够水解几丁质的酶，能够降低几丁质所在的生物体的病虫害和抗生物性。
因此几丁质酶在生物医学、环境治理、食品加工等方面具有广泛的应用前景。
酵母工程菌表达是一种获得几丁质酶的重要方法之一，可以通过对酵母基因进行克隆和表达来大量生产几丁质酶。
本文探讨了酵母工程菌表达的几丁质酶分离及酶学性质研究。
一、几丁质酶的分离1.1 几丁质酶的来源几丁质酶普遍存在于真菌和细菌中，虽然如此，但是几丁质酶的得率较低，而且纯化起来困难，影响了其应用的发展。
因此一些主动研究几丁质酶的学者将目光转向了酵母工程菌表达领域。
酵母工程菌表达可以在核糖体级别上表达目标蛋白质，具有更高的表达量和纯化比例。
1.2 几丁质酶的纯化几丁质酶的纯化一般采用离子交换层析和逆向相色谱层析两种方法，这两种方法对于几丁质酶的杂质蛋白质具有较高的选择性和纯度。
其中，离子交换层析的原理是在载体上的阳离子基团与目标蛋白质的阴离子基团之间形成静电吸引力，从而实现目标蛋白在溶液基质中的分离。
逆向相色谱层析则是通过静电吸引力和疏水作用将目标分子分离。
这两种方法配合使用，对于几丁质酶纯化有着较好的效果。
二、几丁质酶的酶学性质研究2.1 酶动力学参数的研究几丁质酶的酶动力学参数主要包括催化常数（kcat）、米氏常数（Km）和催化效率（kcat/Km）。
这些参数的测定需要建立适当的反应体系和测定方法。
酶动力学参数的研究可以为几丁质酶的应用提供重要的理论基础。
2.2 产物的研究几丁质酶所作用的产物主要是N-乙酰葡萄糖胺。
可以通过高效液相色谱、甲醛定量法和微波辐射法等手段对样品进行检测，从而分析产物的含量、比例和结构。
这些产物的研究也对几丁质酶的应用和工业生产有重要的现实意义。
2.3 抑制剂的研究抑制剂是一类可以与几丁质酶结合从而抑制其催化活性的化学物质。
对于抑制剂的研究不仅可以为几丁质酶的反应机理提供重要的信息，同时也具有药物研究和工业应用方面的潜在价值。
病原芽胞杆菌几丁质酶产生菌的筛选与活性鉴定
作者 简介 ：蔡亚 君 （ ９０ ，女 ，博 士 ，讲 师 ，研究 方 向：应用 微生 物遗传 改 良 １８一）
基 金项 目：武汉 纺织 大学校 基金 项 目 （０ ８ ２ ２０Ｚ ４）．
第２ ４卷 第 ３期
２ １ 年 ０ 月 ０１ ６
武
汉
纺
织
大
学
学
报
Ｖｂ ．４ Ｎ ｏ－ １２ ３ Ｊ ｕｎ． ２０１１
Ｊ０ Ｕ ＲＮ Ａ Ｌ Ｏ Ｆ Ｗ Ｕ Ｈ Ａ Ｎ Ｔ ＥＸ Ｔ Ｉ Ｅ Ｕ Ｎ Ｉ ＥＲ ＳＩ Ｙ Ｌ Ｖ Ｔ
病原 芽胞杆菌几丁质酶产 生菌 的筛选 与活性鉴定
几 丁质 （ ｈｔ ｃ ｉｎ）为 聚 Ｂ一 ，４ 乙酰葡萄 糖胺 ，是一 种广泛 存在 于 自然界 的直链状 高分 子生物 多聚体 。 ｉ １ 一
自然界 每年 生成 的几 丁质数 以百亿 吨计 ，是 储量 仅次 于纤 维 素的天 然聚合 物 。几 丁质是许 多 真菌细胞 壁 的 主要成 分 ，也 大量存 在 于 昆虫 或节 肢 动物 的 甲壳 及 昆虫 的 中肠 中。几丁 质酶 （ ｈｉａｅ ｃｉｎｓ ）可催 化水 解几 丁 ｔ 质 的 ｐ一 ， １ ４糖苷键 生成 Ｎ 乙酰 一 一 一 Ｄ 氨基 葡萄糖 （ Ａ ，广 泛存 在于微 生物 、植物 、昆虫 和脊椎 动物 中 ， Ｎ Ｇ） 在环境 保护 和农业 等方 面有着 广泛 的应用 前景 。 至今 ， 芽胞 杆菌 属 中已有环 状芽 胞杆菌 （ ａｉｕ ｃ ｅｌｎ ） Ｂ ｃｌｓ ｉ ｕ ｓ， ｌ ｒ ａ 蜡 状芽 胞杆 菌 （ ｇ ｃｓ ｒｕ，简称 Ｂ ） 云金 芽胞杆 菌 （ ｔｕｉ ｉ ｓｓ ｅ，苏 ｈｒ ｇｅ ｉ，简称 研 ）等相继 发现产 几 丁质 酶 ｎ ｎ
几丁质酶产生菌的筛选、发酵条件与酶法制备几丁寡糖的研究的开题报告
几丁质酶产生菌的筛选、发酵条件与酶法制备几丁寡糖的
研究的开题报告
一、研究背景
几丁质是一种天然高分子有机化合物，广泛存在于无脊椎动物外壳、菌壳、藻壳及发酵食品中，并具有广泛的生物活性。
几丁质酶是一种水解几丁质的酶，广泛应用
于食品、医药、生物技术等领域。
近年来，随着环保意识的增强，几丁质和几丁寡糖，尤其是具有生物活性的几丁寡糖，成为了一种新型的、天然的、可再生的环保材料，
受到了广泛的关注。
因此，筛选一株高效的几丁质酶产生菌，并进行酶法制备几丁寡
糖的研究成为了当前的研究热点。
二、研究目的
本文旨在筛选一株高效的几丁质酶产生菌，优化其发酵条件，研究酶法制备几丁寡糖的最佳工艺，并探讨几丁寡糖的抗氧化和抗菌活性。
三、研究内容
1. 筛选几丁质酶产生菌，并分析其生物学、生理学特性，确定最适发酵条件。
2. 采用单因素试验和响应面试验优化几丁质酶产生菌的发酵条件，包括温度、
pH值、碳源、氮源等。
3. 采用响应面试验研究最佳酶法制备几丁寡糖的最佳工艺，包括反应时间、反应温度、底物浓度等因素。
4. 利用紫外光谱、红外光谱、高效液相色谱等手段对制备的几丁寡糖进行表征分析。
5. 研究几丁寡糖对氧化应激和抗菌作用的影响。
四、研究意义
1. 筛选高效的几丁质酶产生菌，为几丁质酶的产业化生产提供了有效的菌株资源。
2. 优化几丁质酶的发酵条件，提高酶的产量和活性，为规模生产几丁质酶提供了技术支持。
3. 研究酶法制备几丁寡糖，优化其制备工艺，扩大几丁寡糖的应用范围。
4. 对几丁寡糖的生物活性进行研究，为其在医药、食品等领域的应用提供科学依据。
几丁质酶高产菌的筛选及其产酶条件的优化研究_邓红梅
基金项目: 茂名市重点科学计划资助项目( 201173) 收稿日期: 2009- 12- 28 作者简介: 邓红梅( 1965- ) , 女, 广东 茂名人, 副教授, 从事生物技术方面的教学与研究。E- mail: dhm005@ 126. co m。
邓红梅等: 几丁质酶高产菌的筛选及其产酶条件的优化研究/ 2010 年第 5 期
of enzyme by strain X
由图 3 可知, 菌株 X 在 30~ 35 e 温度范围内产酶 活性较高, 且较稳定。最适产酶温度在 30 e , 酶活达 1. 02 U # mL - 1, 在 40 e 时菌株产酶活性最低。表明 菌株 X 较适宜在低温环境中产酶, 过高的温度会抑制 其产酶活性。 2. 4 初始 pH 值对菌株 X 产酶的影响
1 实验
1. 1 土样及试剂 5 份土样采自茂名沿海地区。 几丁质粉, 上海市生物制品有限公司; 其它试剂均
为国产分析纯。 1. 2 培养基
平板分离培养基( g # L- 1 ) : 胶体几丁质 5, K2 HPO4 0. 7, KH2 PO4 0. 3, MgSO4 # 7H2 O 0. 5, FeSO4 # 7H2 O
图 1 菌株 X 的菌落形态和透明圈( a) 、显 微镜下的形态( b) 、芽孢在显微镜下的形态( c) Fig. 1 Colony shape and clear zones of strain X( a) , strain X observed by microscope( b) , spore of strain X observed by microscope( c)
高产几丁质酶菌株的筛选与CK1-3菌株几丁质酶的纯化与鉴定的开题报告
高产几丁质酶菌株的筛选与CK1-3菌株几丁质酶的纯化与鉴定的开题报告摘要：几丁质酶是一种特殊的酶，在海洋生态系统中具有重要的生物学功能，因此对于高效的几丁质酶菌株的筛选和几丁质酶的纯化与鉴定具有重要意义。
本文将实验室中先前筛选出的CK1-3菌株进行体外培养，通过测定其几丁质酶的活性进行筛选，同时优化产酶条件，最终得到高产几丁质酶的菌株。
接下来对于CK1-3菌株进行几丁质酶的纯化与鉴定，使用超滤、离子交换层析和凝胶过滤三个步骤纯化CK1-3菌株的几丁质酶，测定其纯化比和比活力，同时采用SDS-PAGE和质谱分析进行鉴定。
关键词：几丁质酶；菌株筛选；纯化；鉴定；CK1-31. 研究背景随着人们对生物化学及海洋生态系统的研究深入，几丁质酶作为一种具有右旋螺旋结构的酶，逐渐成为研究重点。
它是一种特殊的酶，在海洋生态系统中，它可以释放出被几丁质包裹的有机物，为微生物提供能量和营养素。
同时，几丁质酶也被广泛应用于食品工业、纺织业等领域。
因此，对于高效的几丁质酶菌株的筛选和几丁质酶的纯化与鉴定具有重要意义。
2. 研究目的本研究旨在筛选高产几丁质酶的菌株，同时对CK1-3菌株的几丁质酶进行纯化与鉴定。
3. 研究方法3.1 菌株的培养先前从海波中分离出的CK1-3菌株通过体外培养的方式进行増菌。
用含有几丁质的培养基进行培养，其成分为（每升）：几丁质4.0 g、柠檬酸0.5 g、胰蛋白酶1.0 g、NaCl 1.0 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4 0.25 g、FeSO4 0.002 g和微量元素液体1 mL。
3.2 几丁质酶的筛选对体外培养的CK1-3菌株进行几丁质酶的筛选，分别在不同的温度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）、pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）和培养时间（12、24、36、48、72 h）下测定几丁质酶的活性，最终确定其最佳产酶条件。
3.3 几丁质酶的纯化利用超滤、离子交换层析和凝胶过滤三个步骤对CK1-3菌株的几丁质酶进行纯化，测定纯化比和比活力。
产几丁质酶菌株的筛选及酶解产物鉴定
产几丁质酶菌株的筛选及酶解产物鉴定谭海刚;李静;赵祥颖【摘要】几丁质酶是一种专一性降解几丁质的水解酶.在工业上,几丁质酶可用于制备功能性甲壳低聚糖.结合平板透明圈法和摇瓶发酵测酶活力的方法,从土壤中筛选到一株产几丁质酶的菌株L012,酶活力为0.75 IU/mL;采用离子色谱法对菌株L012产几丁质酶的酶解产物进行分析,初步确定产物中有氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖以及聚合度小于10的寡糖.【期刊名称】《粮油食品科技》【年(卷),期】2013(021)002【总页数】3页(P65-67)【关键词】几丁质;几丁质酶;几丁寡糖【作者】谭海刚;李静;赵祥颖【作者单位】山东省食品发酵工程重点实验室,山东济南 250013【正文语种】中文【中图分类】TS201.3几丁质酶专一性降解几丁质，水解得到的几丁寡糖、几丁二糖或N－乙酰葡萄糖胺在食品及药物方面有广泛的用途。
几丁质酶(chitinase，EC3.4.1.14)的酶源相当丰富，自从 Benecke［1］首次报道分离到几丁质酶产生菌以来，发现微生物中细菌、放线菌、真菌、酵母及某些病毒都能够产生几丁质酶。
不同来源的微生物的酶系有所不同，酶学性质差异较大。
一般微生物产几丁质酶的酶系含有外切几丁质酶、内切几丁质酶和几丁质二糖酶等。
本文采用平板透明圈法和摇瓶发酵相结合的方法从土壤等样品中筛选到一株产几丁质酶的菌株，并用离子色谱法对该菌株酶解产物进行了分析、鉴定。
1 材料与方法1.1 土样采自山东沿海等地区的土样。
1.2 主要试剂胶体几丁质(Colloidal chitin):按 Sun Chul Kang［2］的方法制备，细粉几丁质:济南海得贝公司，DNS试剂:参照文献［3］，磷酸缓冲液:参照文献［4］，其他试剂均为分析纯。
1.3 培养基1.3.1 富集培养基细粉几丁质 2.5 g/l，MgSO4·7H2O 0.5 g/l，K2HPO40.7 g/l，KH2PO40.3 g/l，FeSO4·7H2O 0.01 g/l，pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌 20 min。
产几丁质酶的筛选及活力测定
产几丁质酶的筛选及活力测定一、实验材料1.菌种：白僵菌，或其他菌种及土壤采样等 (菌种接种于PDA斜面上，28℃，80％RH培养14 d后分别置于4℃和20℃备用。
)2.试剂：DNS试剂 :（称取3，5-二硝基水杨酸3．15 g，加水500 mL。
，搅拌5 s，水浴至45。
然后逐步加入100 mL 0．2g/mL的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌。
直到溶液清澈透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃)。
再逐步加入四水酒石酸钾钠91．0 g 苯酚2．5 g和无水亚硫酸钠2．5 g。
继续45"C水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。
停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000 mL。
用烧结玻璃过滤器过滤，取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。
室温下存放7 d后可以使用。
)几丁质酶基础培养基(g／L)：葡萄糖5．09，蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，FeS04·2H20 0．1 g，pH 7．0。
几丁质酶诱导培养基(g／L)：蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，ZnS04·7H202 0．01 g，胶体几丁质10 ml，pH 7．0。
（胶体几丁质固体培养基。
g K2HPO4，gKH2PO4， g MgSO4·H2O， g FeSO4·7H2O， gZnSO4·7H2O 500 ml 1%胶体几丁质，500 ml 蒸馏水，15 g 琼脂，，121℃灭菌15 min，冷却至50℃左右倒平板）马铃薯培养基(PDA)；去皮的马铃薯200 g切块，沸水煮30 min，纱布过滤，20 g蔗糖，209琼脂，加热至全部溶解，定容至1 L。
二、筛选·1.初筛采用平板透明圈法。
用0．1 mL孢子悬液(1×107／mL)滴于几丁质平板的中央(每个样品重复3次)，28℃培养7d，其菌落周围有透明圈出现。
Chitinolyticbacter meiyuanensis的筛选鉴定及其发酵产几丁质酶研究
Chitinolyticbacter meiyuanensis的筛选鉴定及其发酵产几丁质酶研究几丁质是自然界含量仅次于纤维素的碳水化合物和仅次于蛋白质的含氮有机物,其水解产物N-乙酰-D-氨基葡萄糖、几丁寡糖及其衍生物在食品、医药、农业、化工等行业应用极为广泛。
几丁质酶能催化水解N-乙酰葡萄糖胺基团糖苷键,降解几丁质,生成几丁寡糖、几丁二糖或N-乙酰-D-氨基葡萄糖等,因此,研究几丁质酶基因资源、产酶发酵及基因表达调控等具有一定的理论意义和潜在的应用价值。
论文从废弃池塘底泥中筛选获得一株几丁质酶高产细菌,对该菌进行了鉴定,深入研究了其产酶条件、酶的分离纯化和酶学性质、几丁质酶的产生机理、几丁质酶的克隆与表达以及几丁质酶在水解几丁质方面的应用等,主要结果如下:1)利用透明圈法,从采自4省市的180余份土壤、枯枝、昆虫、甲壳动物尸体等样品中筛选出56株合成几丁质酶的细菌,其中有5株产酶能力较强;选择其中一株几丁质酶产量较高的菌株,从形态学、生理生化、脂肪酸组成、醌类、G+C含量及16S rRNA等方面进行了鉴定。
确定该菌属变形菌纲（Proteobacteria）、奈瑟菌目（Neisseriales）、奈瑟菌科（Neisseriaceae）下的一个新属新种,命名为Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1,并提交至中国普通微生物菌种保藏管理中心（菌株编号CGMCC 3438）和美国典型微生物菌种保藏中心（菌株编号ATCC BAA-2140）保藏。
2)利用单因素实验和响应面分析法对C. meiyuanensis SYBC-H1的发酵培养基及培养条件进行了优化。
利用单因素实验筛选出对几丁质酶产量影响较大的10个因子,利用Plackett-Burman Design实验筛选出影响几丁质酶合成的关键因子:菊芋粉、尿素及硫酸钠,再利用Central Composite Design建立模型,获得了最佳发酵培养基组成（g/L）:菊粉3.55,尿素3.10,几丁质3.80,Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>0.32,K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·3H<sub>2</sub>O0.70,KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>0.30,MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O0.5,FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.01。
一株产几丁质酶菌株的筛选及其产酶条件的研究_李静
第37卷第3期 2007年6月工业微生物Industrial M icrobiology Vol .37No .3 Jun .2007山东省科技攻关计划项目(NO .031010115)。
作者简介:李静(1982～),女,硕士研究生。
一株产几丁质酶菌株的筛选及其产酶条件的研究＊李 静1, 刘建军2,3, 赵祥颖2(1.青岛农业大学食品科学与工程学院,青岛266109;2.山东省食品发酵工程重点实验室,济南250013;3.山东轻工业学院食品与生物工程学院,济南250100)摘 要 采用平板透明圈法从土壤中分离筛选到一株产几丁质酶放线菌株L 12,用250mL 摇瓶发酵初筛和复筛,酶活力为0.63U m L 。
通过产酶条件实验,初步确定了该菌株较适产酶培养基和摇瓶发酵条件。
条件优化后,30℃、250m L 摇瓶发酵48h ,几丁质酶活力达到1.06U mL 。
关键词:几丁质; 几丁质酶; 筛选; 酶活力 几丁质(Chitin )又称甲壳素、甲壳质,是以β-1,4-N -乙酰氨基葡萄糖为基本单位的直链多聚物,其含量在天然聚合物中仅次于纤维素居第二位[1,2]。
几丁质在医药、化工、食品、化妆品、印染、造纸、农业、环保等方面具有广泛的用途。
几丁质酶(ChitinaseEC3.3.1.14)[3]是一种专一性降解几丁质的酶类,可将几丁质完全水解为几丁单糖或几丁寡糖,直接被人体吸收利用,从而使几丁质用途更加广泛。
本研究从采集的40份土样中,以几丁质为唯一碳、氮源,采用平板透明圈法初筛,共挑取428株产生明显透明圈的菌株。
然后经摇瓶初筛、复筛,最终获得一株产几丁质酶活力较高的菌株放线菌L 12,并对其产酶条件进行了初步研究,本文报道了产酶菌株放线菌L 12的筛选过程和产酶条件研究的结果。
1 材料与方法1.1 土样 采自山东沿海等地区的40份土样。
1.2 试剂 胶体几丁质:按Sun Chul Kang [5]的方法制备;细粉几丁质购于济南海得贝公司。
几丁质酶抑制化合物产生菌的筛选初探
几丁质酶抑制化合物产生菌的筛选初探摘要：从采自全国的200多份土样中分离出1350多株菌，利用平板透明圈法和铁氰化钾方法，以家蚕中肠几丁质酶作为靶标，从这些菌株中筛选出家蚕几丁质酶抑制化合物的产生菌1237#，经初步鉴定该菌株为假单胞菌。
本文主要介绍几丁质酶抑制化合物筛选体系的建立、活性物质性质的初步探索及目的菌株的鉴定。
关键词：几丁质酶；抑制化合物；产生菌Preliminary screening of chitinase inhibitor producing strainsXie Jie1, Zhou ZeYang1,2, Zhang XinJun1, Lan Xiqian1 and Hu JunHua1(1 The Key Sericultural Laboratory of Agricultural Ministry, Southwest Agricultural University, Chongqing 400716;2 College of Bioscience of Chongqing Normal University, Chongqing 400047)ABSTRACT In the course of screening for new chitinase inhibitor, using the silkworm chitinase as a target, and transparent inhibition zone plate assay and potassium ferricyanide method, a strain belonging to the Pseudomonas, named#1237 was isola ted among 1350 strains from 200 soil samples. The screening procedure and the preliminary study of the culture were also reported.KEY WORDS Chitinase; Inhibitor; Producingstrain几丁质是甲壳类动物、昆虫外骨骼和真菌细胞壁的重要组成成分，它是N乙酰葡萄糖胺以β1，4键连接起来的直链多聚物。
抑制真菌病害几丁质酶产生菌的筛选、鉴定
１２ １ 固体 几 丁质 培养 基 ．．
胶 状几 丁质 １ ． ， ５ ０ｇ 酵
母粉 ３ ０ｇ （ ｎ２ Ｏ ． ， Ｓ ’ Ｈ ０ ０ ３ｇ ． ，ＮＨ ）Ｓ ４１０ｇ Ｍｇ Ｏ４５ ２ ． ，
Ｋ ２Ｏ ．６ ， Ｈ Ｐ ４ ３ 琼脂 １ ． ， １ ｇ ５０ｇ 加水至 １０ 。用 ００ｍＬ
Ｒｈ￣ ｃｏ ａ ｓｌ ｉａ ｄ Ｇｉｂｒ ｌ ￣ｔ ｉｏｔｎｉ ｏａｎ ｎ ｂ ｅ ｅｌ ｅｅ．Ｔｈ ｔａｎＷａ ＫⅣｅ ｏｂ ｅ ｃ ｉｉａｅｐ ｏ ｕ ｉ ｃｅ ｉ 。 ａ ｌ ｅｓｒｉ ｓ ｐ ｄｔ ｅａｎｗ ｈｔ ｓ －ｒ ｄ ｃｎ ｂ ｔｒｔ ｎ ｇ ａ ｍａ ｗｈｉｈｗａ ｅ ｔｆ ｄａ ｔｅ ｃ ｓｉ ｎ ｉｅ Ｓ ｒｐ－ ｄ ｉ ｓ ｔｍｙ ｅ ｏ ｉｐ ｒ ｓｂ ￣ ｈ ｌｇｃ ｄｐ ｙ ｉｃ ｅ ｃ ｈ ｒｃｅ ｓｉ ． ｏ ｃｓ ｂｓ ｏ ｕ ｙｍｏ ｏｏ ｉ ａ ｈ ｓ ｈ ｍｉａ ｃ ａａ ｔｒ ｔ ｓ ｇｌ ｌ ａｎ ｏ ｌ ｉ ｃ Ｋｅ ｒ ｓ Ｓ ｒｐｏ ｃｓｇｏ ｉｐ ｒ ｓ ｈｔ ａｅ；ｂｏｃ ｎ ｍｌ ｙｗｏ ｄ ： ｔｅ ｔｍｙ ｅ ｌｂｓ ｏ ｕ ；ｃ ｉｉ ｓ ｎ ｉ－ｏ ｔ
Ｚ ＨＥＮＧ ｕｌ， － Ｘｉ—ｉＺＩＥＮＧ —ｉｇ。Ｓ ｔ Ａｉｐｎ ＯＮＧ ｎ —ａ Ｙｏ ｇｙ ｎ，Ｚ ＨＯＵ ａｑａ ｇ。 Ｈｕ － ｉ ｎ ＴＡＮ — ｇ。 ｎ Ｆｕ ｍｎ ＬＩＰｉｇ’
（ ｃ ｓａｃ ｎｔ ｕｅｏ ｉ ｕｎＡ ｒ ｕ ｕａ ｉｅｓｙ ｉ ｕｎＷｅ ａｇ６ １ ３ Ｃ ｉ ） Ｒｉ ＲｅｅｒｈＩｓｉ ｔ ｆ ｃ ａ ｇｉ ｌ ｌ Ｕｎｖｒｉ ，Ｓｃ ａ ￣ｉ １ １０， ｈｎ ｅ ｔ Ｓｈ
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
产几丁质酶菌株的筛选与鉴定及几丁质酶酶学性质研究的开题报告
产几丁质酶菌株的筛选与鉴定及几丁质酶酶学性质研究的开题报告标题：产几丁质酶菌株的筛选与鉴定及几丁质酶酶学性质研究一、论文简介：随着人们对生态环境的关注度不断提高，利用微生物降解环境污染物已经成为了一种重要的手段。
几丁质是海洋生物、昆虫等生物体中普遍存在的一种寡聚糖，具有材料的天然，广泛应用于生物材料、食品工业等领域。
几丁质酶是一种能够降解几丁质的酶，是利用几丁质资源的关键。
本文旨在从环境中筛选出一株具有高效几丁质酶产生能力的菌株，并对该酶的酶学性质进行初步研究，为几丁质酶产业化研究提供理论参考。
二、研究目的：1. 通过环境筛选、鉴定和比较，寻找一株优异的几丁质酶产生菌株。
2. 分离、纯化并表征出所筛选的几丁质酶的分子量、催化效能、热稳定性等酶学特性。
三、研究内容与方法：1. 采用实验室分离、培养等方法，从野外样品中筛选出几个具有几丁质酶生产能力的菌株，通过形态学、生理学和生化检测等手段进行鉴定和比较。
2. 对所筛选出菌株的几丁质酶进行分离、纯化、组分鉴定和物化特性等分析，包括所得几丁质酶的分子量、催化效能、pH和温度对催化活性的影响等酶学特性。
3. 对所筛选出菌株产生的几丁质酶进行产酶条件的优化和工艺参数的调整，最终以高活力和低成本的方式实现几丁质酶的产业化生产。
四、研究意义：本文的研究旨在寻求一种高效、环保、经济的几丁质资源化利用方式。
一方面，研究结果能够为工业化生产几丁质酶提供强有力的理论依据；另一方面，研究结果有望为几丁质生物降解技术的推广和应用提供新的途径，有助于缓解环境污染问题。
五、研究展望：几丁质酶作为一种生物酶，其产生机制、分离纯化和活性调整等问题仍然存在许多亟待解决的问题。
今后的研究可以进一步探讨几丁质酶的基因结构和修饰方式，寻求提高几丁质酶催化效率和抗污染能力等优化措施。
同时，也可以借助生化技术和生物工程技术，开创出更多有益的降解技术和应用领域。
产几丁质酶真菌菌株的筛选及产酶抑菌活性的检测
产几丁质酶真菌菌株的筛选及产酶抑菌活性的检测张宇;贺丹;周鑫;田庄;郭亮;王丽【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2010(036)001【摘要】目的:分离真菌菌株,筛选出几丁质酶高产菌株,检测其粗酶液对临床常见假丝酵母的抑菌作用,为抗真菌药物的开发提供研究基础.方法:利用刚果红几丁质平板法和3,5-二硝基水杨酸(DNS)法筛选出几丁质酶高产菌株,并用纸片法检测粗酶液的抑菌作用.结果:从环境中分离的47株真菌菌株中得到产几丁质酶菌株6株,其中高产菌2株(烟曲霉JLC 50134和木霉JLC 31235);JLC 50134粗酶液对白假丝酵母、热带假丝酵母的抑制作用强于JLC 31235,抑菌圈直径分别为4～5 cm和约2 cm;JLC 31235粗酶液对克柔假丝酵母、光滑假丝酵母的抑制作用强于JLC 50134,抑菌圈直径分别为约2 cm和1 cm.结论:烟曲霉JLC 50134和木霉JLC31235是几丁质酶高产菌株,两种粗酶液对临床常见假丝酵母有抑制作用.【总页数】4页(P67-70)【作者】张宇;贺丹;周鑫;田庄;郭亮;王丽【作者单位】吉林大学基础医学院病原生物学教研室,吉林长春,130021;吉林大学基础医学院病原生物学教研室,吉林长春,130021;吉林大学基础医学院病原生物学教研室,吉林长春,130021;吉林大学基础医学院病原生物学教研室,吉林长春,130021;吉林大学基础医学院病原生物学教研室,吉林长春,130021;吉林大学基础医学院病原生物学教研室,吉林长春,130021【正文语种】中文【中图分类】R379【相关文献】1.一株产几丁质酶菌株的筛选及产酶条件研究 [J], 郑爱芳;魏和平;许远;芮辰飞;王枫;宋伟佳2.土壤产几丁质酶菌株的筛选鉴定及产酶条件 [J], 张荣奎;贺淹才;刘爱花;魏巍;李红然3.一株产几丁质酶菌株的筛选鉴定与产酶条件优化 [J], 苗飞;孟阳;王悦;袁春营;崔青曼4.产低温几丁质酶菌株的筛选、鉴定与产酶条件优化 [J], 陈立功;吴家葳;张庆芳;迟乃玉;王晓辉5.产几丁质酶菌株GXUN-20的筛选、鉴定及其产酶条件优化 [J], 张奇;王一兵;申乃坤;姜明国因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
几丁质酶高产菌的筛选及其产酶条件的优化研究
ｍ Ｌ＿。 。
关 键 词 ： 丁 质 ； 丁质 酶 ； 芽孢 杆 菌属 几 几 短 中 图 分 类 号 ： １ ． Ｑ８４１ 文 献标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ６ ２ ４ ５ ２ １ ） ５ ０ ６ ～Ｏ １ ７ —５ ２ （ ０ ０ ０ － ０ ２ ４
入到剧烈搅拌 的 ５ ％ 乙醇 （ Ｏ 至少 是 滤液 的 ５Ｂ 以上 ） Ｖ
存、 繁殖 的特殊 的微 生物群 体 ， 能通 过分泌 几丁 质酶 它
降解几 丁质为几 丁寡 糖 、 丁二糖 直 至几丁单 糖 ， 接 几 直 被 人体 吸收利用 ， 而使 几 丁质 用 途更 加 广 泛 。茂 名 从
化， 拟为 “ 渔业 垃 圾 ” 、 等 甲壳 动物 的外 壳 的再 生 虾 蟹
利 用提供 理论基 础 。
１ 实 验
１ １ ± 样 及 试 剂 ．
取 产透 明圈 直径与 菌落 直径 比最大 的菌株纯 化培养 并 保 存待用 。
按 照常规 细菌 学方法 Ｌ 鉴定 到属 。 ３ ］ １ ５ 产 酶条 件实验 方法 ．
是 一个海 滨城 市 ， 、 虾 蟹资 源非常 丰 富 ， 、 壳等废 弃 虾 蟹
中， 使胶体几 丁质沉淀析 出 ， 离心 收集胶 体几 丁质 ， 用蒸
馏水 冲洗几 次 ， 透析袋过夜 ， 置 避光保存在冰箱 中。
１ ４ 菌 种 筛 选 方 法 ．
物 一直影 响着茂 名地 区 的生态环境 。作 者在 此筛选 了
一
株几丁 质 酶 活 力 高 的 菌 株并 对 其 产 酶条 件 进 行 优
一株产几丁质酶菌株的筛选鉴定与产酶条件优化
产 酶 条件 ，建 立 二 次 回归 方 程 。试 验结 果 表 明 ，通 过 菌 株 的菌 落 形 态 、亚 显 微 形 态 特 征 和 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序
列 同 源性 分 析 ，确 定 该 菌 株 为 蜂 房 芽 孢 杆 菌 。３个 因 素对 菌 株 产 酶 的 影 响 依 次 为 培 养 时 间 ＞ 培 养 温 度 ＞胶 体 几 丁 质 含 量 。菌 株 的最 佳 产 酶 的条 件 为 ：培 养 基 中 胶 体 几 丁 质 含 量 １．６２ ｏ Ａ ，培 养 温 度 ４０℃ ，培
摘 要 ：几 丁质 酶 在 降解 几 丁 质 和 生 物 防 治 上 具 有 重 要 作 用 。采 用 平 板 筛 选 法 从 对 虾 养 殖 池 塘 底 泥
中筛 选 几 丁 质 酶 产 生 菌 株 ，以 培 养 时 间 、培 养 温 度 和胶 体 几 丁质 含 量 为 自变 量 ，响 应 面 法 优 化 该 菌 株 的
菌物 质为 几 丁 质 酶 。生 物 测 定 表 明 １．８６４的几 丁 质酶 粗酶对 蚊 幼具 有较 高 的活性 ，同 时对 苏 云金 杆 菌 （Ｂ． ｎｇ ｚ ｓ）制 剂 杀 虫 活 性 具 有 明显 的增 效 作用 。基 于此 ，笔 者从 对 虾 养殖 底 泥 中分离 并 鉴 定 一株 几 丁质 酶产 生 菌 株 ，并 采用 响应 面 法对 该 菌 株 的产酶条件进行 了优化 ，为该菌 株的进一利用 提供 理论 依据 。
第 ３７卷第 ２期 ２０１８年 ３月
水 产 科 学
ＦＩＳＨ ＥＲ ＩＥＳ ＳＣＩＥＮ ＣＥ
ＶｏＩ＿３７ ＮＯ．２ Ｍ ａｒ． ２Ｏ１８
一 株 产 几 丁质 酶 菌株 的筛 选 鉴 定 与 产 酶 条 件优 化
苗 飞 ，孟 阳 ，王 悦 ，袁 春 营 ，崔 青 曼
产几丁质酶的筛选及活力测定
产几丁质酶的筛选及活力测定产几丁质酶的筛选及活力测定一、实验材料1.菌种：白僵菌，或其他菌种及土壤采样等(菌种接种于PDA斜面上，28℃，80％RH 培养14 d后分别置于4℃和20℃备用。
)2.试剂：DNS试剂:（称取3，5-二硝基水杨酸3．15 g，加水500 mL。
，搅拌5 s，水浴至45。
然后逐步加入100 mL 0．2g/mL的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌。
直到溶液清澈透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃)。
再逐步加入四水酒石酸钾钠91．0 g苯酚2．5 g和无水亚硫酸钠2．5 g。
继续45"C水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。
停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000 mL。
用烧结玻璃过滤器过滤，取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。
室温下存放7 d后可以使用。
) 几丁质酶基础培养基(g／L)：葡萄糖5．09，蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，FeS04·2H20 0．1 g，pH 7．0。
几丁质酶诱导培养基(g／L)：蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，ZnS04·7H202 0．01 g，胶体几丁质10 ml，pH 7．0。
（胶体几丁质固体培养基。
0.5 g K2HPO4，0.5 gKH2PO4，0.5 g MgSO4·H2O，0.1 g FeSO4·7H2O，0.1 gZnSO4·7H2O 500 ml 1%胶体几丁质，500 ml蒸馏水，15 g 琼脂，pH7.2，121℃灭菌15 min，冷却至50℃左右倒平板）马铃薯培养基(PDA)；去皮的马铃薯200 g切块，沸水煮30 min，纱布过滤，20 g蔗糖，209琼脂，加热至全部溶解，定容至1 L。
二、筛选1.初筛采用平板透明圈法。
高活性几丁质酶产生菌的筛选及鉴定
高活性几丁质酶产生菌的筛选及鉴定
鲜乔;蒋家新;张拥军;李轶萍;安晓欢
【期刊名称】《中国计量学院学报》
【年(卷),期】2009(020)003
【摘要】从四川、陕西、浙江等地食用菌栽培的土壤样品中,筛选到一株性能优良、产几丁质酶活力较强的菌株BLC08609,并结合菌落形态、生理生化指标和16S rDNA序列分析对其进行鉴定.结果显示,菌株BLC08609能以食用菌细胞壁(以几丁质为主)为唯一碳源生长,在菌株BLC08609个体形态和生理生化特性鉴定的基础上,通过16S rDNA测序鉴定,确定BLC08609为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis).
【总页数】5页(P274-277,282)
【作者】鲜乔;蒋家新;张拥军;李轶萍;安晓欢
【作者单位】中国计量学院生命科学学院浙江杭州 310018;中国计量学院生命
科学学院浙江杭州 310018;中国计量学院生命科学学院浙江杭州 310018;中国计量学院生命科学学院浙江杭州 310018;中国计量学院生命科学学院浙江杭州310018
【正文语种】中文
【中图分类】X172
【相关文献】
1.几丁质酶产生菌黑木耳破壁的筛选及鉴定 [J], 鲜乔;张拥军
2.抑制真菌病害几丁质酶产生菌的筛选、鉴定 [J], 郑秀丽;郑爱萍;宋永燕;周华强;谭芙蓉;李平
3.病原芽胞杆菌几丁质酶产生菌的筛选与活性鉴定 [J], 蔡亚君;桂震;李锋;杨小俊
4.一种新的几丁质酶产生菌F_2的筛选与鉴定初报 [J], 郑秀丽;郑爱萍;王艺;李平
5.广谱抗病虫几丁质酶产生菌X2-23的筛选与鉴定 [J], 陈红;李平;郑爱萍;桂瑶;王世全;王玲霞;马炳田
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第35卷第8期东 北 林 业 大 学 学 报Vol.35No.8 2007年8月JOURNAL OF NORT HE AST F ORESTRY UN I V ERSI TY Aug.2007产几丁质酶酵母菌的筛选与鉴定1)惠丰立 冯金荣 杨柯金 文祯中(南阳师范学院,南阳,473061) 摘 要 从番茄果实表面筛选到1株产几丁质酶酵母菌株CY-6,该菌株产生的几丁质酶对番茄镰刀菌果腐病菌(Fusarium oxysporum)有较强的抗菌活性并具有较广的抗菌谱。
形态及生理生化特征测定结果表明:菌株CY-6与伊萨酵母属(Issatchenkia)中的陆生伊萨酵母(I.terricola)种的特征基本一致;测定了该菌株的26S r DNA D1/D2区域序列并根据26S r DNA构建了系统发育树;在系统发育树中,菌株CY-6与陆生伊萨酵母形成一个类群,序列同源性高达99.6%。
因此,将菌株CY-6鉴定为陆生伊萨酵母。
关键词 菌株CY-6;几丁质酶;26S r DNA;系统发育分类号 S476Screen i n g and I den ti f i ca ti on of Ch iti n a se2Produc i n g Y ea st/Hui Fengli,Feng J inr ong,Yang Kejin,W en Zhenzhong(College of L ife Science and Technol ogy,Nanyang Nor mal University,Nanyang473061,P.R.China)//Journal ofNortheast Forestry University.-2007,35(8).-66～67,70A chitinase2pr oducing yeast is olate CY26was screened fr o m the surface of t o mat o fruits.The chitinase pr oduced by strainCY26could str ongly inhibit the gr o wth of Fusariu m oxysporu m and exhibited inhibiti on against a wide2range of p lant pathogenicfungi.Mor phol ogical,physi ol ogical and bi oche mical characteristics of strain CY26sho wed that the characteristics of strain CY26were essentially consistent with those of Issatchenkia terricola.The analysis of26S r DNA D1/D2do main sequence fr o m strainCY26suggested that strain CY26was clustered t ogether with I.terricola in the phyl ogenetic tree,and the sequence identity be2t w een strain CY26and I.terricola was99.6%.The result indicates that strain CY26bel ongs t o I.terricola.Key words Yeast CY26;Chitinase;26S r DNA;Phyl ogenetic analysis 果蔬采后的病害主要由病原真菌引起[1]。
长期以来,使用化学合成杀菌剂一直是控制果蔬采后病害发生的主要手段之一,但是随着人类对食品安全、环境保护和克服有害生物抗性等问题的日益重视,化学杀菌剂的使用正受到越来越严格的限制[2-3]。
因此,研究和开发控制果蔬采后病害的新方法,对于降低腐损率、控制农残量、确保食用安全和提高产品国际竞争力具有十分重要的意义。
几丁质酶(Chitinase,Ec.3.2.14)被普遍认为是一种与重寄生、抗病防卫反应有关的酶类,许多拮抗菌通过产生几丁质酶来降解病原菌细胞壁[4]。
因此,几丁质酶产生菌在果蔬采后病害防治方面有巨大的应用潜力。
近年来,酵母菌分泌的胞外几丁质酶在果蔬采后病害生物防治中的作用已引起人们的重视。
范青等人[5]利用膜毕赤酵母(Pichia m e m branefaciens Hansen)和季也蒙假丝酵母(Candida guillier m ondii)防治桃采后的真菌病害,发现这2种酵母菌产生的几丁质酶对桃软腐病菌(Rhizopus stolonifer(Ehrenb:Fr)Vuill)孢子萌发有明显的抑制作用。
本研究从番茄果实表面分离筛选到1株产几丁质酶酵母菌株CY-6,该菌株产生的几丁质酶对番茄镰刀菌果腐病菌(Fusarium oxysporum)有较强抑制作用,并对其进行了形态、生理生化鉴定及基于26S r DNA序列的系统发育分析。
1 材料与方法菌株CY-6是从番茄果实表面分离得到;番茄镰刀菌果腐病菌(Fusarium oxysporum)及其供试病原菌由本实验室分离保存。
1)河南省自然科学基金项目(0411032300)。
第一作者简介:惠丰立,男,1965年7月生,南阳师范学院生命科学与技术学院,教授。
收稿日期:2006年10月17日。
责任编辑:潘 华。
固体几丁质培养基:胶状几丁质15.0g、酵母粉5.0g、(NH4)2S O41.0g、M gS O4・5H2O0.3g、KH2P O41.36g、H2O 1L,pH为4.5;液体几丁质培养基:固体几丁质培养基不加琼脂;P DA培养基:马铃薯200g、葡萄糖15g、琼脂13g、H2O1mL。
菌株的分离筛选:从市场上购买新鲜的苹果、梨、桃、番茄等水果样品,分别取果皮组织5g,加入45mL液体几丁质培养基中,28℃180r/m in振荡培养48h。
取0.1mL稀释一定倍数的稀释液均匀涂于固体几丁质平板上,28℃培养6d后,挑取具有明显透明圈的菌株纯化,置于4℃保存。
将初筛菌株接种于50mL液体几丁质培养基中,28℃180r/m in摇瓶发酵72h后,测定发酵液几丁质酶活力。
几丁质酶活性测定:参照Ant oni o和Masarus方法[6-7]。
1mL胶体几丁质与稀释的1mL酶液放于50℃水浴保温1h,上清液中的还原糖按DNS法测定。
一个酶活力单位定义为每小时释放相当于100μg N-乙酰氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量。
酶抗菌活性测定:采用打孔法[8]。
将供试病原菌接种于直径为9.0cm的P DA平板上,28℃培养2～4d,在菌苔周围1.0cm处打3个孔(d=0.5cm),孔中加入50μL质量浓度分别为100、200mg/L的几丁质酶,对照以等量的无菌水代替,继续培养2～3d,观察抑菌情况。
形态和培养特征:参照微生物学实验手册[9]对菌株CY-6进行形态和培养特征观察。
生理生化特征:参照微生物学实验手册和酵母菌的特征与鉴定手册[9-10],对菌株CY-6进行糖发酵、碳源同化、氮源同化、无维生素培养基生长等生理生化鉴定。
26S r DNA序列分析:参照白逢彦等方法[11]提取菌株CY-6基因组DNA,用引物NL1(5’-GCA T AT C AA T AA GCG G AGG AA AAG-3’)和NL4(5’-GGT CCG TGT TTC AAGACG G-3’)PCR扩增该菌株26S r DNA近5’端的D1/D2区域。
PCR扩增条件为94℃预变性,5m in,36个循环(94℃变性60s;56℃复性60s;72℃延伸90s),最终72℃延伸7m in。
扩增产物经纯化后,送上海生工生物工程技术服务有限公司双向测序。
测序结果用BLAST软件与Gen Bank中相关种属的26S r DNA序列进行比较,用DNAMANV4.0软件的Multi p le Sequence A lign ment进行26S r DNA同源性分析,并构建系统发育树。
2 结果与分析菌株的分离筛选:样品通过液体几丁质培养基富集后,于固体几丁质平板上进行初筛,筛选出46株几丁质酶产生菌,从中挑选出具有明显透明圈的菌株9株,分别编号为CY-1至CY-9。
9株初筛菌株的几丁质酶活性见表1。
从表1可知,在几丁质诱导下,9株初筛菌株均能产生几丁质酶,但不同菌株产酶水平相差较大,有2株菌株产酶活性较高且产酶性能较为稳定,其中来源于番茄果实表面的菌株CY-6几丁质酶活性最高,为2.41U/mL,因而选择菌株CY-6作为研究对象。
表1 9株酵母的几丁质酶活性U・mL-1 菌株酶活性菌株酶活性CY-1 1.86CY-6 2.41 CY-20.27CY-70.28 CY-3 1.34CY-80.26 CY-4 1.15CY-9 2.19 CY-50.26 酶的抗菌活性:将50μL质量浓度分别为100、200mg/L 的几丁质酶加入供试菌菌苔周围的培养基孔,继续培养2～3 d,观察抑菌情况。
结果发现,菌株CY-6产生的几丁质酶对番茄镰刀菌果腐病菌(F.oxysporum)菌丝生长有较强的抑制作用(图1);进一步研究其抗菌活性表明,菌株CY-6产生的几丁质酶对苹果霉心病菌、苹果黑点病菌和梨黑斑病菌等多种病原菌均有一定的抑制作用。
图1 几丁质酶对番茄镰刀菌果腐病菌的抑制作用1为无菌水;2为100mg/L几丁质酶;3为200mg/L几丁质酶形态和培养特征:菌株CY-6在麦芽汁液体培养基中,细胞呈卵圆形,细胞大小为(2.1～4.2)μm×(3.3～7.4)μm,无性繁殖方式为芽殖,培养液不形成璞,菌液混浊,有菌体自凝现象;在麦芽汁固体平板上菌落较厚,乳白色,边缘整齐;在Mcclary产孢培养基生成子囊,每个子囊有1～3个子囊孢子,子囊孢子呈圆形;在P DA培养基上,不形成假菌丝(图2)。
图2 菌株CY-6的细胞形态生理生化特征:菌株CY-6能发酵D-葡萄糖。
可利用L-赖氨酸和柠檬酸,不利用硝酸钾、蔗糖、D-半乳糖、L-山梨糖、赤藓糖醇、木糖醇和DL-乳酸。
在无硫胺素培养基上不能生长(表2)。
参照酵母菌的特征与鉴定手册[10]进行试验。
菌株CY-6的生理生化特征与陆生伊萨酵母(Issatchen2 kia terricola)几乎完全相同。
表2 菌株CY-6的生理生化特征特征结果特征结果D-Glucose+Xylit ol-K NO3-D L-Lactic acid-Sucr ose-Citric acid+D-Galact ose-L-lysine+L-s orbose-Gr oth of thia m in-Erythrit ol- 26S r DNA序列分析:以菌株CY-6总DNA为模板,用引物NL1和NL4进行PCR扩增,得到约600bp的PCR产物;菌株CY-6的26S r DNA D1/D2区域序列已向Gen Bank提交,其登录号(Accessi on nu mber)为DQ450883,序列长度为556bp。