产几丁质酶酵母菌的筛选与鉴定

第35卷第8期东　北　林　业　大　学　学　报Vol.35No.8 2007年8月JOURNAL OF NORT HE AST F ORESTRY UN I V ERSI TY Aug.2007

产几丁质酶酵母菌的筛选与鉴定1)

惠丰立　冯金荣　杨柯金　文祯中

(南阳师范学院,南阳,473061)

摘　要　从番茄果实表面筛选到1株产几丁质酶酵母菌株CY-6,该菌株产生的几丁质酶对番茄镰刀菌果腐

病菌(Fusarium oxysporum)有较强的抗菌活性并具有较广的抗菌谱。形态及生理生化特征测定结果表明:菌株CY-

6与伊萨酵母属(Issatchenkia)中的陆生伊萨酵母(I.terricola)种的特征基本一致;测定了该菌株的26S r DNA D1/

D2区域序列并根据26S r DNA构建了系统发育树;在系统发育树中,菌株CY-6与陆生伊萨酵母形成一个类群,

序列同源性高达99.6%。因此,将菌株CY-6鉴定为陆生伊萨酵母。

关键词　菌株CY-6;几丁质酶;26S r DNA;系统发育

分类号　S476

Screen i n g and I den ti f i ca ti on of Ch iti n a se2Produc i n g Y ea st/Hui Fengli,Feng J inr ong,Yang Kejin,W en Zhenzhong

(College of L ife Science and Technol ogy,Nanyang Nor mal University,Nanyang473061,P.R.China)//Journal of

Northeast Forestry University.-2007,35(8).-66～67,70

A chitinase2pr oducing yeast is olate CY26was screened fr o m the surface of t o mat o fruits.The chitinase pr oduced by strain

CY26could str ongly inhibit the gr o wth of Fusariu m oxysporu m and exhibited inhibiti on against a wide2range of p lant pathogenic

fungi.Mor phol ogical,physi ol ogical and bi oche mical characteristics of strain CY26sho wed that the characteristics of strain CY26

were essentially consistent with those of Issatchenkia terricola.The analysis of26S r DNA D1/D2do main sequence fr o m strain

CY26suggested that strain CY26was clustered t ogether with I.terricola in the phyl ogenetic tree,and the sequence identity be2

t w een strain CY26and I.terricola was99.6%.The result indicates that strain CY26bel ongs t o I.terricola.

Key words　Yeast CY26;Chitinase;26S r DNA;Phyl ogenetic analysis

果蔬采后的病害主要由病原真菌引起[1]。长期以来,使用化学合成杀菌剂一直是控制果蔬采后病害发生的主要手段之一,但是随着人类对食品安全、环境保护和克服有害生物抗性等问题的日益重视,化学杀菌剂的使用正受到越来越严格的限制[2-3]。因此,研究和开发控制果蔬采后病害的新方法,对于降低腐损率、控制农残量、确保食用安全和提高产品国际竞争力具有十分重要的意义。

几丁质酶(Chitinase,Ec.3.2.14)被普遍认为是一种与重寄生、抗病防卫反应有关的酶类,许多拮抗菌通过产生几丁质酶来降解病原菌细胞壁[4]。因此,几丁质酶产生菌在果蔬采后病害防治方面有巨大的应用潜力。近年来,酵母菌分泌的胞外几丁质酶在果蔬采后病害生物防治中的作用已引起人们的重视。范青等人[5]利用膜毕赤酵母(Pichia m e m branefaciens Hansen)和季也蒙假丝酵母(Candida guillier m ondii)防治桃采后的真菌病害,发现这2种酵母菌产生的几丁质酶对桃软腐病菌(Rhizopus stolonifer(Ehrenb:Fr)Vuill)孢子萌发有明显的抑制作用。本研究从番茄果实表面分离筛选到1株产几丁质酶酵母菌株CY-6,该菌株产生的几丁质酶对番茄镰刀菌果腐病菌(Fusarium oxysporum)有较强抑制作用,并对其进行了形态、生理生化鉴定及基于26S r DNA序列的系统发育分析。

1　材料与方法

菌株CY-6是从番茄果实表面分离得到;番茄镰刀菌果腐病菌(Fusarium oxysporum)及其供试病原菌由本实验室分离保存。

1)河南省自然科学基金项目(0411032300)。

第一作者简介:惠丰立,男,1965年7月生,南阳师范学院生命科学与技术学院,教授。

收稿日期:2006年10月17日。

责任编辑:潘　华。

固体几丁质培养基:胶状几丁质15.0g、酵母粉5.0g、(NH

4

)

2

S O41.0g、M gS O4・5H2O0.3g、KH2P O41.36g、H2O 1L,pH为4.5;液体几丁质培养基:固体几丁质培养基不加琼

脂;P DA培养基:马铃薯200g、葡萄糖15g、琼脂13g、H

2

O1mL。

菌株的分离筛选:从市场上购买新鲜的苹果、梨、桃、番茄等水果样品,分别取果皮组织5g,加入45mL液体几丁质培养基中,28℃180r/m in振荡培养48h。取0.1mL稀释一定倍数的稀释液均匀涂于固体几丁质平板上,28℃培养6d后,挑取具有明显透明圈的菌株纯化,置于4℃保存。将初筛菌株接种于50mL液体几丁质培养基中,28℃180r/m in摇瓶发酵72h后,测定发酵液几丁质酶活力。

几丁质酶活性测定:参照Ant oni o和Masarus方法[6-7]。1mL胶体几丁质与稀释的1mL酶液放于50℃水浴保温1h,上清液中的还原糖按DNS法测定。一个酶活力单位定义为每小时释放相当于100μg N-乙酰氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量。

酶抗菌活性测定:采用打孔法[8]。将供试病原菌接种于直径为9.0cm的P DA平板上,28℃培养2～4d,在菌苔周围1.0cm处打3个孔(d=0.5cm),孔中加入50μL质量浓度分别为100、200mg/L的几丁质酶,对照以等量的无菌水代替,继续培养2～3d,观察抑菌情况。

形态和培养特征:参照微生物学实验手册[9]对菌株CY-6进行形态和培养特征观察。

生理生化特征:参照微生物学实验手册和酵母菌的特征与鉴定手册[9-10],对菌株CY-6进行糖发酵、碳源同化、氮源同化、无维生素培养基生长等生理生化鉴定。

26S r DNA序列分析:参照白逢彦等方法[11]提取菌株CY-6基因组DNA,用引物NL1(5’-GCA T AT C AA T AA GCG G AGG AA AAG-3’)和NL4(5’-GGT CCG TGT TTC AAG