药品生物检定技术(项目二)

模块七 基因工程药物检测
②非反义核酸药物 分为免疫调节剂CpG、DNA和诱饵核酸等 CpG表示核苷酸对，其中G在DNA链中紧随C后。CpG 对很少出现在人类基因中。然而，在许多基因的启动子或 转录起始位点区域周围，甲基化经常被抑制。这些区域包 含浓度相对较高的CpG对，与染色体一起称作CpG岛，其 长度通常在几百到几千核苷酸的长度内变化。 CpG寡核苷酸是一种高效低毒的免疫佐剂,在许多疾病的 基因治疗中具有广阔的应用价值。 ③基因疫苗 即一些病原体基因，将其导入机体后刺激机体产生特异 的免疫力，以抵抗这些病原体的侵袭。将DNA表达质粒注入 体内，通过表达相应编码蛋白而诱导机体产生特异性免疫应 答。
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（2）核酸药物
①反义核酸药物 反义核酸是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断其翻译 的RNA或DNA分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达， 使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术。它包括反 义RNA、反义DNA和核酶三大技术。反义核酶作为一种基因下 向调节作用因子，在抑制一些有害基因的表达和失控基因的过 度表达上发挥着重要作用。 反义核酸药物是能根据碱基互补原则抑制、封闭或破坏靶 基因，从而抑制一些有害基因的表达和失控基因的过度表达的 反义核酸。
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一、检验岗位 药物检验工 二、工作目标 掌握基因工程药物的检测原则和方法。 三、操作准备 （一）职业形象：药品检验人员，应从思想上明确不合格药品的 危害，不得有丝毫马虎。操作要严格按无菌操作进行。 （二）职场环境：无菌室清洁整齐，定期检查无菌室空气细菌情 况 （三）参考资料：《中国生物制品规程》、《中国药品检验标准操 作规范》、《中国药典》
以干扰素为例： 当人或动物受到某种病毒感染时，体内会产生一种物质，它会 阻止或干扰人体再次受到病毒感染，故人们把此种物质称为干扰素 （Interfero,简称IFN），是1957年英国科学家多萨克斯和林德曼 在研究流感病毒干扰现象时发现的。干扰素具有广谱抗病毒的效 能，是一种治疗乙肝的有效药物，国际上批准治疗丙型病毒性肝炎 的药物只有它。但是，通常情况下人体内干扰素基因处于“睡眠” 状态，因而血中一般测不到干扰素。只有在发生病毒感染或受到干 扰素诱导物的诱导时，人体内的干扰素基因才会“苏醒”，开始产 生干扰素，但其数量微乎其微。即使经过诱导，从人血中提取1mg 干扰素，需要人血8000ml，其成本高得惊人。据计算：要获取1磅 （453g）纯干扰素，其成本高达200亿美元。使大多数病人没有使 用干扰素的能力。1980年后，干扰素与乙肝疫苗一样，采用基因工 程进行生产，其基本原理及操作流程与乙肝疫苗十分类似。现在要 获取1磅（453g）纯干扰素，其成本不到1亿美元。
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③蛋白质含量测定：微量法 即Folin---酚法测定蛋白质含量 原理：磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下，易被酚类化合物还 原而呈蓝色反应．蛋白质中含有代酚基的酪氨酸，故有此反 应．Folin---酚法的灵敏度是双缩脲法的100倍． ④纯度检查：非还原型SDS-PAGE法：经扫描仪扫描纯度应 符合要求。 高效液相色谱法：波长280nm检测，应呈一个吸收峰， 或主峰峰面积不低于总峰面积的百分比纯度规定。
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⑥分子量测定：还原型SDS-PAGE法
电泳槽
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SDS-PAGE，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS （十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带 负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量 成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺 凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的 状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。蛋白上样缓冲液 (SDS-PAGE loading buffer是一种以溴酚蓝为染料，5倍 浓缩的SDS-PAGE凝胶电上样缓冲液,用于常规的SDSPAGE蛋白电泳样品上样。
pH测定仪由传感器和二次表两部分组成。 可配三复合或两复合电极，以满足各种 使用场所。配上纯水和超纯水电极，可 适用于电导率小于3μs/cm的水质（如化 学补给水、饱和蒸气、凝结水等）的pH 值测量。
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②水分含量确定：用卡尔· 费休水分测定法，一般 水分含量不得高于3.0% 。
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五、基础知识 1、基因工程药物：将生物体内生理活性物质的基因，利用重组 DNA技术加以改 造，然后使其在细菌、酵母、动物细胞中大量表达的新型药物。 2、基因工程药物的分类 主要包括重组蛋白多肽药物和核酸类药物 （1）重组蛋白多肽药物：重组细胞因子、重组人生长激素、重组 人胰岛素、重组溶血酸药物、基因工程血液代用品、重组可溶 性受体等。 重组人胰岛素 为重组DNA技术生产的由51个氨基酸残基组成的蛋白质，宿 主细胞为大肠杆菌。按干燥品计算，每1mg含重组人胰岛素不得 少于27.5单位。重组人胰岛素中残余宿主DNA和宿主细胞蛋白质 为与生产过程相关的、潜在的特异性杂质，必须在生产过程中严 格控制，其限度应符合有关规定。
其原理是仪器的电解池中的卡氏试剂 达到平衡时注入含水的样品，水参与 碘、二氧化硫的氧化还原反应，在吡 啶和甲醇存在的情况下，生成氢碘酸 吡啶和甲基硫酸吡啶，消耗了的碘在 阳极电解产生，从而使氧化还原反应 不断进行，直至水分全部耗尽为止， 依据法拉第电解定律，电解产生碘是 同电解时耗用的电量成正比例关系的。
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（二）检定方法 1、理化检定 （1）外观检查：通过特定的人工光源检测药物的外观，其颜色、状态 和加入蒸馏水后的澄清度应符该药物的规程要求。 （2）化学检定：除水分检查项外，按规定加入一定量灭菌注射用水溶 解后进行。 ①pH值测定： pH值测定方法（电位法），玻璃电极酸度计测定 用两种标准缓冲溶液校正或核对，误差不得超过0.05 。
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④基因药物
基因工程药物是先确定对某种疾病有预防和治疗作 用的蛋白质，然后将控制该蛋白质合成过程的基因取 出来，经过一系列基因操作，最后将该基因放入可以 大量生产的受体细胞中去，这些受体细胞包括细菌、 酵母菌、动物或动物细胞、植物或植物细胞，在受体 细胞不断繁殖过程中，大规模生产具有预防和治疗这 些疾病的蛋白质，即基因疫苗或药物。 在医学和兽医 学中应用正逐步推广。
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四、检定原则和方法 （一）检定原则 依据：《中国生物制品规程》 规程对每个制品的检验项目、检验方法和质量指标都有明确的规定， 质检人员必须严格按照规程对药物进行检定，以保证人民用药 安全、有效。 基因工程药物的检定随生产过程需要进行原液检定、半成品检定和 成品检定。 检定项目可分为理化检定、安全检定和效力检定三个方面。
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紫外光谱仪
氨基酸序列分析仪
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2、安全检定 ①无菌试验：A项细菌及真菌检查法。结果判断：无杂菌生长判 为合格；发现杂菌生长可复试，复试样品应加倍。复试无杂菌 生长判为合格，若仍有杂菌生长判为不合格。 ②细菌内毒素检定：鲎（hò u）试剂与细菌内毒素产生凝结反应 的原理。 鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌 冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝 固酶原，凝固蛋白原，能够准确、快速地定性或定量检测样品 中是否含有细菌内毒素和（1,3）-β-葡聚糖激。目前，鲎试 剂广泛用于制药、临床以及科研等领域，用于细菌内毒素和真 菌葡聚糖检测。 将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转180°时，管内凝胶 不变形，不从管壁脱落者为阳性，凝胶不能保持完整并从管壁 滑落者为阴性。
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③异常毒性检测：小鼠试验项进行。 ④热原质检测：将一定剂量的供试品静脉注射家兔，在规 定期间内观察家兔体内体温升高情况。
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3、效力检测
①效价检测： 效价：指某一物质引起生物反应的功效单位,可用理化方法检测,也可 用生物检测方法测定。 生物制品活性（数量）高低的标志，通常采用生物学方法测定。 用国家标准品校准确定校价，除个别品种外，一般校价应为标示量 的80%—150%。 ②比活性测定：按规程要求测定，应不低于各品种规定标准。 比活性：每个质量单位所含活性单位的数目。如每毫克蛋白质所含酶 单位数。 标记分子中标记放射性的相对强度或非放射性标记物(如酶标记物)相 对活性的表示方法。一般以单位质量所含放射性核素量(如所测得的放 射性记数率)或酶的活性单位(如 U)等表示。
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3、基因工程药物的优点 ①可以克服利用天然生物材料生产药物的潜在危险 ②可以大规模生产满足临床需要 ③利用基因工程技术可以改造内源生理活性物质，进一步提 高其生物活性。 ④可以降低药物成本，让更多的病人受益。 ⑤可以生产体内不存在的生物大分子，扩大药物来源。
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⑤等电点测定：等点聚焦电泳法
蛋白质分子是典型的两性电解质分子。它在大于其等电点的pH 环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电 点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。这种 泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零 时才能停止。如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的 蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的 原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH 梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等 电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置 。这种按等电点的大小， 生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电 聚焦”。等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的 物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质 性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的 。
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人胰岛素的生产方法:
A. 化学合成法制人胰岛素 根据人胰岛素A链和B链的序列，由单个氨基酸从头合成。 技术可行，但其生产成本奇高。 B. 化学转型法制人胰岛素 猪胰岛素与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸的差异， 猪的为Ala，人的为Thr，可将猪胰岛素在体外酶促转化为人 胰岛素。但工艺复杂，产品的价格不菲。 C. 基因工程法制人胰岛素 1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产 人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。由基 因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、 降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没 有任何区别。
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（三）、检定注意事项： ①所用试剂均需分析纯 ②卡尔费休水分测定法：Fischer试剂很不稳定，配置后应放 置一周后再使用，所有操作在干燥环境中进行 ③纯度测定：用SDS-PAGE法加样量应不低于5μ g（银染法） 或10μ g（考马斯亮蓝R-250染色）。 ④分子量测定：除品种另有规定外，加样量应不低于1μ g。 ⑤肽图分析：至少每半年检查一次。 ⑥N末端氨基酸序列测定：至少每年检查一次。 ⑦无菌试验：无菌试验用的培养基应先检查其本身的灵敏度， 否者可能造成假阴性。 ⑧细菌内毒素含量测定 ⑨热原质试验
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（二）常见基因工程药物介绍 1、重组人干扰素（IFN）系列：干扰素是一类具有抗病毒、抑制细 胞增值和免疫调节等生物学活性的细胞因子。 2、重组白细胞介素(IL)系列：白细胞介素是一类免疫调节因子。 3、重组集落刺激因子（CSF）系列：集落刺激因子是一类刺激造血 细胞集落形成的生长因子。 4、重组促红细胞生成素（EPO）：促红细胞生成素是促进红细胞系 列的增殖、分化和成熟的主要激素。 5、重组碱性成纤维细胞因子（bFGF）：成纤维细胞因子是广谱的 有丝分裂原，是形态发生和分化的诱导因子。 6、重组生长激素（hGH）：生长激素是由垂体前叶分泌的刺激机体 线性生长的激素。 7、基因工程胰岛素（insulin）：胰岛素具有非常广泛的调节细胞 代谢的生物学功能，是维持人体代谢正常和生存所必须的激素。
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⑦外源性DNA残留量测定：固相斑点杂交法或其他敏感 方法测定 ⑧宿主菌蛋白残留量测定：酶联免疫法 ⑨残余抗生素活性：氨苄青霉素残留量测定法 ⑩紫外光谱扫描：基因工程药物一般在277-280nm呈特征 性最大吸收 ⑾肽图分析：重组制品肽图分析法分为酶切肽图分析法 和化学裂解肽图分析法。 ⑿N末端氨基酸序列测定：氨基酸序列分析仪测定。 ⒀鉴别试验：分斑点免疫法和免疫印迹法。鉴别试验应 为阳性。