甲壳素酶学研究现状

《生物工程进展》2000,Vol.20,No.5

甲壳素酶学研究现状

夏文水　吴焱楠

(无锡轻工大学食品学院,无锡　214036)

摘要　本文介绍了甲壳素在生物合成和分解代谢过程中所涉及的相关酶,如甲壳素合成酶、甲壳素水解酶和其它相关酶,讨论了它们在分离纯化、结构鉴定、作用机制与模型、酶的固定化、基因工程以及应用等方面的研究现状和进展,对甲壳素的研究开发以及相关领域具有理论和实际意义。

关键词　甲壳素酶学　甲壳素合成酶　甲壳素水解酶　甲壳素脱乙酰化酶

前言

甲壳素(chitin)的生物合成和分解代谢是在甲壳素相关酶的催化下进行的。这些酶存在于动物、植物和微生物中,在生物体内控制着各种生理功能,如机体保护和支持、防御机制、致病性、消化作用和生态平衡。近几年来,对这些酶的研究日益增多并十分活跃,1993年5月在意大利召开了首届甲壳素酶学(chitin enzymology)国际学术讨论会,第二届会议也已于1996年5月在意大利召开。这表明甲壳素酶学研究正在受到科学家们的普遍关注和重视。今天甲壳素酶学研究比起甲壳素研究中其它专题进展更快,已成为甲壳素学(chitinology)中的一个重要分支[1]。

甲壳素酶学涉及生态学、动物学、生物学、医学、生物技术、农业、化学等学科领域。甲壳素相关酶主要包括甲壳素合成酶、甲壳素水解酶和其它相关酶。本文将介绍这些酶在分离纯化、结构鉴定、作用机制与模型、酶的固定化、基因工程以及应用等方面的研究现状和进展。

1　甲壳素合成酶

甲壳素的生物合成主要由甲壳素合成酶(chitin synthesase,ES2.4.1.16)控制,将分散在细胞质中的N2乙酰葡糖胺(N2acetylglucosamine,G LcNAc)聚合成长链甲壳素。此酶存在于细胞质或细胞膜附近的液泡中,本身为一种酶原,需经位于细胞膜附近的特殊蛋白酶活化,才具有催化活力[2]。甲壳素合成酶是一种糖蛋白,在活性状态时非常不稳定,在其活化过程中二价金属离子(如Mg++和Mn++)是至关重要的,且受反应物尿苷二磷酸N2乙酰葡糖胺(uri2 dine2diphospho2G LcNAc UDP2G LcNAc)、G LcNAc 和N2乙酰甲壳二糖(N2diacetylchitobiose)所活化,缺乏底物该酶将发生不可逆失活,产物尿苷二磷酸UDP对其具有很强抑制作用[3]。

甲壳素合成酶因与脂肪和蛋白质结合力强,难以被分离和纯化。目前,已从酿酒酵母、担子菌、灰盖鬼伞(Copri nus ci nereus)和鲁氏毛霉(M ucor rouxii)的细胞壁组成中分离出部分纯化的甲壳素合成酶[4]。最近一个重要的进展就是Machida和Saito从灰绿犁头霉(A bsi dia glauca)中纯化得到30K Da的甲壳素合成酶的酶原,当被胰蛋白酶(trypsin)部分降解后转变为一种28.5K Da的活性多肽[5]。这个结果的意义在于首次清楚地证实了甲壳素合成酶与激活蛋白酶之间的相互作用,向阐明甲壳素合成酶的作用机制迈进了一步。

甲壳素合成酶除合成甲壳素外,也与甲壳素脱乙酰酶(chitin deacetylase)共同催化合成壳聚糖(chitosan)。首先UDP2G LcNAc受甲壳素合成酶催化进行聚合反应以生成甲壳素,然后脱乙酰酶再与甲壳素结合发生脱乙酰反应而生成壳聚糖[6]。在细胞表面究竟是合成甲壳素还是壳聚糖,主要取决于甲壳素合成酶在细胞膜上排列的紧密程度。在鲁氏毛霉细胞表面合成甲壳素过程中,若甲壳素合成酶紧密排列在细胞膜上时,形成的甲壳素会结晶化成纤维状,对脱乙酰酶的抵抗性较高;反之,分散式的甲壳素合成酶合成较松散的甲壳素链或为过渡态的链状聚合物,对脱乙酰酶具有较高的亲和性,结果生成壳聚糖[7]。

此外,与许多糖酶一样,甲壳素合成酶具有形成新的糖苷键的转糖苷作用也已得到证实,该酶可使四聚体或五聚体聚合成六聚体和七聚体[8]。

2　甲壳素水解酶

甲壳素被水解成G LcNAc是由甲壳素水解酶

21

体系来完成的。该酶系一般被诱导为多酶复合体。传统上被分为两大类:1)内切甲壳素酶(endo2chiti2 nase,EC3.2.1.14),随机地将甲壳素降解,最终产物为G LcNAc2和少量G LcNAc3;2)N2乙酰葡糖胺酶(N2acetylgluosaminidase,EC3.2.1.30),有时也称为甲壳二糖酶(chitobiase),将甲壳二糖降解为游离G LcNAc,其中也有一些酶能从甲壳素链的非还原末端水解生成G LcNAc[9]。但也有人提出存在第三类酶即外切甲壳素酶(exo2chitinase),该酶从甲壳素链的非还原末端水解连续释放出甲壳二糖或低聚糖[10]。这些酶存在于微生物、植物和动物中。Per2 rakis A.等人对所收集的56种甲壳素酶和相应的基因进行研究,发现可将它们分为两类:一类具有相同的大小,平均为300个氨基酸残基,一级结构相似,都来源于植物。另一类氨基酸残基为290～820,大小差异很大,但都有一个包含几个高度保留区域的中心部位,它们存在于细菌、真菌和动物中。这两类酶相对应于糖基水解酶的18和19族。而第一类酶又可分为两组:A组具有一个富半胱氨酸的40个氨基酸的N末端,通过富甘氨酸的铰链区与主结构相连;B组既没有富半胱氨酸区也没有铰链区,但完全与A组结盟。从而,首次提出了这类酶的亲缘关系。

最近,在海洋弧菌(vibrio f urnissii)中发现一种未知酶,它只能水解聚合度为4～6的甲壳低聚糖,却不能水解甲壳素和G LcNAc2或G LcNAc3。这种酶被称为甲壳糊精酶(chitodextrinase)[11]。显然,能够水解G LcNAc糖苷键的酶种类比国际生化协会酶委员会已命名种类的数量要多得多,这就需要更加仔细地研究酶的纯化,探讨各种底物类似物及抑制剂与酶相互作用的方式。Hara等人用各种部分O2甲基化甲壳二糖与一种来源于链霉菌(st repto2 myces erythraeus)的甲壳素酶作用,发现该酶与鸡蛋白溶菌酶对N,N′2二乙酰甲壳二糖(N,N′diacetyl2 chitobiose)具有相似的结合方式:还原末端糖中C6和非还原末端糖中的C3和C4上的羟基对酶作用是不重要的,而还原末端糖中的C2上的乙酰氨基和C3上的羟基以及非还原末端糖中C6上的羟基与酶分子发生定向效应[12]。最近,5种分子量分别为20、30、47、70、90K Da的甲壳素酶从橄榄绿链霉菌(S t rep.olivaceovi ri dis)中被分离纯化[13]。对各种来源的甲壳素酶纯化、鉴定等大量研究工作仍在进行。

壳聚糖酶(chitosanase,EC3.2.1.99)催化水解壳聚糖中的氨基葡萄糖糖苷键,生成聚合度为2～8的低聚糖混合物。已经从各种微生物中分离出几种壳聚糖酶,植物在应激状态或受到壳聚糖诱导时也产生壳聚糖酶[14]。该酶被认为是具有抗真菌作用的一类新型酶,与甲壳素酶在植物中共同起着生物防治的功能。各种来源的酶分子量差异较大,对其底物专一性了解不多。Ando等人发现从放线菌和环状芽孢杆菌(B acill us ci rculans)中得到的壳聚糖酶,在一级结构上只有N末端和内部某一肽链氨基酸顺序相类似。而与溶菌酶相比,只有很少部分有较大的相同性。Hutadilok等人报道,短小芽孢杆菌(B acill us pum il us)中的壳聚糖酶活性,在酶解反应中,随着壳聚糖N取代度、N取代基因大小和取代位置及均相和非均相反应体系而变化[15]。

甲壳素和壳聚糖被溶菌酶降解的研究从早期就开始。溶菌酶的结构借助于甲壳低聚糖几年前就已被阐明,溶菌酶与N2乙酰氨基相互作用也广为人知,但各个N2乙酰氨基与酶的相互作用机制还不清楚。β型比α型甲壳素易被降解,均相脱乙酰反应得到的壳聚糖降解比非均相反应的壳聚糖要快得多,部分N2乙酰化甲壳低聚糖和乙酰化程度在4%～60%的壳聚糖都能被降解,但完全脱乙酰壳聚糖则对其有抑制作用[16]。目前,溶菌酶对甲壳素衍生物的降解研究仍在进行中,这将有助于阐明壳聚糖作敷料治愈伤口和溃疡的原理。

此外,还报道有37种不属于甲壳素酶类的其它水解酶对商业壳聚糖具有不同程度的非专一性降解作用,其中以纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、木瓜蛋白酶的降解活性最为显著[17]。这些酶降解壳聚糖时,最终产物分子量较大。以脂肪酶为例,底物为分子量70K Da的壳聚糖,其水解产物的分子量为13K Da[18]。目前,这些酶的作用机制还不清楚。

3　其它酶

在壳聚糖的合成过程中,需要甲壳素脱乙酰酶催化。最近,利用疏水色谱和阴阳离子交换色谱或免疫亲和色谱,已将鲁氏毛霉的甲壳素脱乙酰酶提纯。经碳水化合物分析,该酶为一种酸性甘露糖蛋白,糖含量为30%,用SDS电泳测定其分子量约为75K Da,用凝胶层析测定为80K Da。该酶的等电点较低(p I=3),其底物必需是聚合度在4以上的甲壳低聚糖及其衍生物,受酸特别是醋酸抑制[1]。

在甲壳素的生物合成中,葡糖胺262磷酸合成酶(G lucosamine262phosphate synthase,G LcN262Psyn2

31