抗人血小板单克隆抗体的制备及其临床应用_牟忠梅

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中国生物制品学杂志 2011 年 6 月第 24 卷第 6 期 Chin J Biologicals June 2011，Vol. 24 No. 6
试剂盒购自德国欧蒙公司。 1. 5 动物免疫及细胞融合
取人 O 型血小板，浓度为 108 个 ／ ml，与弗氏完 全佐剂混合，乳化，经足底及背部多点免疫 BALB ／ c 小鼠，0. 2 ml ／ 只；间隔 10 d 后进行第 2 次免疫，用不 完全弗氏佐剂配制，浓度为 108 个 ／ ml，经小鼠腹腔 免疫，0. 2 ml ／ 只。以后每隔 1 周免疫 1 次，共免疫 3 ～ 4 次，于融合前 3 d 经尾静脉加强免疫，0. 2 ml ／ 只。 取免疫小鼠脾细胞，与 NS-1 细胞参照文献［3］方法 进行细胞融合。 1. 6 杂交瘤细胞株的筛选及克隆化
中国生物制品学杂志 2011 年 6 月第 24 卷第 6 期 Chin J Biologicals June 2011，Vol. 24 No. 6
抗人血小板单克隆抗体的制备及其临床应用
牟忠梅 1 段生宝 2 刘颖 1 李春明 3 陈喜朋 1 李勇 1
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【 摘要 】 目的 制备抗人血小板单克隆抗体，并应用于临床血小板抗体的筛检及血小板交叉配型。方法 以人 O 型血小 板为免疫原，免疫 BALB ／ c 小鼠，将 NS-1 细胞与免疫小鼠脾细胞融合，间接 ELISA 法筛选阳性杂交瘤细胞，有限稀释法克隆，并 对阳性杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体进行鉴定；采用亲和层析法纯化单抗，用该单抗建立固相凝集法，检测临床患者血清 样本，并与德国欧蒙公司的同类试剂盒（MASPAT）检测结果进行比较。结果 获得 1 株抗人血小板杂交瘤细胞株 1C1，其分泌的 单抗性能稳定，可特异性针对人血小板糖蛋白 Ib ／ IX，细胞稳定传代 8 个月以上，培养上清效价大于为 1 ∶ 106，37℃的稳定性可 持续 35 d，纯化后的抗体效价可达 1 ∶ 108。建立的固相凝集法对 50 例临床血清样本的检测结果与同类试剂盒（MASPAT）一 致。结论 已制备了抗人血小板单克隆抗体，为其进一步临床应用奠定了基础。
【Key words】 Platelet；Antibody，monoclonal
血小板表面具有复杂的血型抗原，其能通过多种
途径刺激机体产生血小板抗体，并引起血小板输注 无效症、新生儿血小板减少症等多种免疫性疾病［1-2］。 目前，血小板抗体检测方法的局限性仍是困扰临床
诊断的一大难题，如固相凝集法通常采用甲醛将血
【关键词】 血小板；抗体，单克隆 【中国图书分类号】 R392-33 【文献标识码】 A 【文章编号】 1004-5503（2011）06-0699-03
Preparation and Clinical Application of Anti-Human Platelet Monoclonal Anti－ body
用 0. 05 mol ／ L 的碳酸盐缓冲液（pH 9. 6）将纯
化的单抗稀释至 15 μg ／ ml，包被 U 型微孔板，100 μl ／ 孔， 置 4℃过夜；次日，用 1％牛血清白蛋白（150 μl ／ 孔） 于 4℃封闭过夜；用该反应板检测临床患者血清样 本中是否含有血小板抗体：向反应孔中加入 50 μl 混 合血小板悬液，50 × g 离心 5 min，清洗 3 次，立即加 入 100 μl 低离子强度溶液，并分别向相应孔中加入 50 μl 患者血清样本，并设阳性对照及阴性对照，37℃ 水浴孵育 30 min；洗涤 5 次，加入 50 μl 抗人 IgG（自 制）及 50 μl 人 IgG 致敏红细胞（自制），200 × g 离心 5 min 后观察结果。用上述建立的固相凝集法对 50 例 临 床 患 者 血 清 样 本 进 行 检 测 ，并 以 同 类 试 剂 盒 （MASPAT）进行平行检测，分析二者检测结果的一 致性。
临床患者血清样本由吉林大学中日联谊医院血 液科提供。 1. 3 细胞
NS-1 细胞由长春生物制品研究所提供。 1. 4 主要试剂
人 O 型血小板由长春市中心血站提供；AP 标记 的羊抗鼠 IgG、PEG、氨基喋呤、次黄嘌呤及胸苷购自 Sigma 公司；RPMI1640 购自 GIBCO 公司 ；MASPAT
MU Zhong-mei△，DUAN Sheng-bao，LIU Ying，LI Chun-ming，CHEN Xi-peng，LI Yong （△Changchun Brother Biotech Co． Ltd，Changchun 130012，China）
【Abstract】 Objective To prepare anti-human platelet monoclonal antibody（McAb）used for clinical screening of platelet an－ tibody and cross matching of platelet． Methods BALB ／ c mice were immunized with platelet group O as immunogen，of which the splenocytes were fused with NS-1 cells． Positive hybridoma cells were screened by indirect ELISA and cloned by limiting dilution method． The positive hybridoma cells and the secreted McAb identified，and the McAb was purified by affinity chromatography and used for development of solid agglutination method． Clinical blood samples were determined by the developed method，and the result was compared with that by MASPAT kit． Results A hybridoma cell strain 1C1 stably secreting anti-human platelet McAb was ob－ tained，by which the secreted McAb was specific to human platelet glycoprotein Ib ／ IX． After the cells were subcultured for more than 8 months，the titer of McAb in culture supernatant was 104，which lasted for 35 d at 37℃． The titer of purified antibody reached 1 ∶ 108． The determination results of 50 blood samples by the developed solid agglutination method were consistent with that by MAS－ PAT kit． Conclusion Anti-human platelet McAb was successfully prepared，which laid a foundation of its further clinical application．
2. 结果 2. 1 杂交瘤细胞株的筛选及克隆化
经检测，细胞融合率为 95％；阳性孔有 5 孔，阳 性率为 1. 4％；在阳性杂交瘤细胞株中选择分泌抗 体效价高的 1C1 株进行克隆和扩大化培养，经连续 6 次克隆，单克隆 100％阳性。 2. 2 杂交瘤细胞株的鉴定 2. 2. 1 稳定性：1C1 细胞株连续传代 8 个月以上，增 殖良好，传代稳定，能连续分泌高效价抗体，上清效 价可达 1 ∶ 106。于来自百度文库氮中冻存第 2 周、1、2、3、6、12 个月，复苏后的细胞增殖稳定，细胞培养上清抗体效 价为 1 ∶ 106，与冻存前一致，说明细胞分泌抗体性能 稳定。 2. 2. 2 染色体分析：检测结果显示，1C1 株杂交瘤细 胞的染色体数为 86 ～ 94 条，为杂交瘤染色体核 型。 2. 3 单克隆抗体的鉴定 2. 3. 1 效价：间接 ELISA 结果显示，4 批 1C1 株杂交 瘤细胞培养上清的单克隆抗体效价均为 1 ∶ 106，见 表 1。 2. 3. 2 稳定性：检测结果显示，1C1 株杂交瘤细胞培 养上清于 37℃放置 35 d，抗体效价维持在 1 ∶ 106，之 后下降，见图 1。表明细胞培养上清中的抗体效价在 37℃可稳定 35 d。 2. 3. 3 抗原决定簇：所获得的 1C1 株单克隆抗体特 异性针对人血小板糖蛋白 Ib ／ IX。 2. 3. 4 纯化单抗的效价：纯化后的抗体效价可达 1∶108。 2. 4 单克隆抗体的应用
作者单位：1 长春博德生物技术有限责任公司（长春 130012）；2 长 春生物制品研究所（长春 130062）；3 长春百克生物技 术股份有限公司（长春 130012）．
通讯作者：牟忠梅，E-mail：mouzhongmei74＠126．com
测，现报道如下。
1. 材料与方法 1. 1 实验动物
清洁级 BALB ／ c 小鼠，6 周龄，雌性，体重 18 ～ 20 g，由吉林大学新民校区动物实验室提供。 1. 2 血清样本
小板固定于 U 型微孔板底部，检测血小板抗体，然 而多项研究表明，甲醛固定可引起抗原构型改变，
以致血小板抗原出现丢失，最终导致血小板抗体漏 检［3-4］。而通过抗人血小板单克隆抗体将血小板固 定则可解决这一问题，避免漏检。为此，本文制备了 抗人血小板单克隆抗体，并用于临床血小板抗体检
基金项目：吉 林 省 医 学 免 疫 诊 断 制 品 科 技 创 新 中 心 项 目 （20071124）．
采用间接 ELISA 法。将兔抗人血小板多抗（自 制）用 0. 05 mol ／ L 碳酸盐缓冲液（pH 9. 6）稀释至 15 μg ／ ml，包被酶标板，100 μl ／ 孔，置 4℃过夜；次 日，用 1％牛血清白蛋白（150 μl ／ 孔）4℃封闭过夜； 将杂交瘤细胞培养上清加入包被板，100 μl ／ 孔，同 时设阴、阳性对照，置 37℃孵育 2 h；用含 Tween-20 的 PBS 缓冲液洗涤 5 次，加 入 AP 标 记 的 羊 抗 鼠 IgG，置 37℃孵育 45 min；洗涤 5 次，加入底物 50 μl， 室温避光显色 30 min。选择阳性孔克隆培养，连续 多次克隆至单克隆 100％阳性，经传代培养后，将杂 交瘤细胞冻存。 1. 7 杂交瘤细胞株的鉴定 1. 7. 1 稳定性检测：将阳性杂交瘤细胞株连续传代 8 个月以上，观察其增殖情况，并检测细胞培养上清 效价。将液氮中冻存的细胞株分别于冻存第 2 周、1、 2、3、6、12 个月后复苏，观察其增殖情况，并于复苏 3 d 后测定细胞培养上清效价。 1. 7. 2 染色体分析：参考文献［5］方法进行。 1. 8 单克隆抗体的鉴定 1. 8. 1 效价测定：将收获的 4 批阳性杂交瘤细胞培 养上清分别稀释 1 000、5 000、10 000、50 000、100 000 和 1000 000 倍，检测抗体效价。 1. 8. 2 稳定性检测：取阳性杂交瘤细胞培养上清 20 ml，分别于 37℃放置 7、14、21、28、35、42、49、56、 63 和 70 d，检测抗体效价。 1. 8. 3 抗原决定簇的鉴定：将血小板相关糖蛋白包 被于酶标板中，采用间接 ELISA 法，经德国古森大学临 床免疫与输血医学研究所检测单抗所针对的血小板 糖蛋白。 1. 8. 4 腹水的制备、纯化及检测：将杂交瘤细胞接种 于小鼠腹腔内，采集腹水，利用活化 4B 进行亲和层析 纯化。 1. 9 单克隆抗体的应用