马铃薯病毒检测试剂盒说明书 (1)
马铃薯病毒检测流程
马铃薯病毒检测流程English Answer:Potato Virus Detection Protocol.Introduction:Potato viruses are a significant threat to potato production, causing substantial yield losses and economic damage. Accurate and timely detection of potato viruses is crucial for effective disease management and prevention. This protocol outlines a comprehensive workflow for the detection of potato viruses.Materials:Potato leaf samples.Virus-specific antibodies or probes.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits orreal-time PCR kits.Microplate reader or thermocycler.Wash buffer (PBS or TBS)。
Blocking buffer.Diluent buffer.Conjugate buffer.Methods:1. Sample Preparation:Collect potato leaf samples showing virus symptoms (e.g., mosaic, mottling, leaf curl).Excise a small portion of the symptomatic leaf tissue (approximately 1 cm2).Grind the leaf tissue in a mortar and pestle with extraction buffer (e.g., PBS with Tween 20).Centrifuge the extract to remove debris.2. ELISA Method:Coat a microplate with virus-specific antibodies.Add the prepared potato leaf extract to the wells.Incubate the plate at the optimal temperature for antigen-antibody binding.Wash the wells to remove unbound extract.Add enzyme-conjugated secondary antibodies specific to the primary antibodies.Incubate the plate again.Wash the wells to remove unbound antibodies.Add substrate solution and incubate the plate.Measure the absorbance using a microplate reader at the appropriate wavelength.Interpret the results based on the established cut-off values.3. Real-Time PCR Method:Extract DNA or RNA from the potato leaf extract using a commercial kit.Prepare the qPCR reaction mix according to the manufacturer's instructions.Use virus-specific primers to amplify the target viral sequences.Perform qPCR on a thermocycler, monitoring thefluorescence signal in real-time.Analyze the results using appropriate software to determine the presence and quantity of the virus.Interpretation of Results:ELISA: A positive result (virus detected) is indicated by a colorimetric reaction or absorbance value above the cut-off.Real-Time PCR: A positive result is indicated by a detectable amplification signal (Ct value) below a predefined threshold.Quality Control:Include positive and negative controls in all assays.Use appropriate extraction and detection methods validated for the specific potato viruses being tested.Follow the manufacturer's instructions for the ELISA kits or qPCR reagents carefully.Limitations:The detection limit of the assay may vary depending on the virus, sample quality, and method used.Cross-reactivity with closely related viruses or other plant pathogens may occur.Applications:Monitoring potato crops for virus infection.Certification of virus-free potato seed stocks.Research on potato virus epidemiology and management.中文回答：马铃薯病毒检测流程。
马铃薯检测
马铃薯检测【导语】马铃薯检测是什么？马铃薯检测对于我们有什么作用？目前人们越来越关注马铃薯检测方面的知识和信息，因为马铃薯检测关系到我们生活的方方面面，那么今天小编就针对马铃薯检测这个话题，给大家针对性的介绍一些马铃薯检测相关的知识：马铃薯在我国广泛种植，已成为仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物。
然而在当前的马铃薯生产中，病毒病发生普遍而严重，成为制约马铃薯产业发展的主要障碍，是生产上亟待解决的突出问题。
对于马铃薯产业的参与者而言，细菌、真菌及病毒的检测和识别十分重要。
本文从病毒种类及相应检测方法进行简要介绍。
1 马铃薯主要病毒种类及致病症状222.png2 马铃薯病毒主要检测方法2.1 酶联免疫吸附检测法酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbentassay, ELISA）是把抗原-抗体的免疫反应与酶的催化反应相互结合而发展起来的一种综合性技术。
该技术是在不影响酶活性和免疫球蛋白分子的反应条件下, 使酶分子和免疫球蛋白分子共价结合成酶标记抗体。
酶标记抗体可直接或通过免疫桥与包袱在固相支持物上待测定的抗原或抗体特异性结合,来检测病毒的存在。
ELISA具有特异强、灵敏度高、操作简便、易于观察等优点, 非常适合于大规模检测, 适于脱毒苗的检测。
方法经济简便，快速直观，但其也存在一定的缺点:（1）抗体的制备所需时间长，费时费力；（2）一次只能检测一种病毒，检测多种病毒时灵敏度降低；（3）对于蚜虫传播的病；有一些在植物上第一年不表现症状,病毒繁殖量少,无法用ELISA方法检测；（4）检测病毒时还经常存在假阳性反应，给脱毒种薯(苗)的检测带来困难。
2.2 PCR检测法近来，由于PCR检测的特异性和灵敏性，被广泛运用于许多细菌、真菌、病毒和类病毒的检测。
但是，运用普通的PCR分析仪检测多种病原菌时，不仅十分耗时，而且对实验室条件要求严格且需要很长的反应设置时间，易造成人为误差。
马铃薯病毒种类及主要病毒检测方法
马铃薯病毒种类及主要病毒检测方法作者：罗燕娜，刘江娜，王航来源：《新疆农垦科技》 2015年第3期罗燕娜，刘江娜，王航（兵团第六师农业科学研究所，新疆五家渠831300）收稿日期：２０15—01—20摘要：本文对北疆地区马铃薯主要病毒的特性和致病症状进行了描述，并简要介绍了马铃薯主要病毒的检测技术。
关键词：马铃薯；病毒；检测方法马铃薯在我国广泛种植，已成为仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物。
由于光照强、昼夜温差大、气候冷凉等优势，新疆北疆沿天山一带的昌吉州、乌鲁木齐、昭苏、新源等地都非常适宜种植马铃薯，现种植面积已达2310hm2[1]。
然而在当前的马铃薯生产中，病毒病发生普遍而严重，成为制约马铃薯产业发展的主要障碍，是生产上亟待解决的突出问题[2]。
目前，已报道的马铃薯病毒种类超过25种、类病毒1种，其中，侵染乌鲁木齐地区马铃薯的主要病原病毒有PVX、PVY、PVA、PLRV,类病毒为PSTVd。
主要检测的马铃薯病毒有马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）及马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）[1]。
1马铃薯主要病毒种类及致病症状1.1马铃薯X病毒（PVX）X病毒又称普通花叶病毒，病毒粒子为长杆状，大小为515nm×13nm，基因组全长6.4kb[3]。
该病毒可通过叶片汁液摩擦传播，也可通过蚜虫以非持久性方式传播，还可通过种薯传播[1]。
感病植株症状多种多样，因栽培品种的敏感性不同和病毒株系的不同而存在差异，多数表现为轻花叶或潜隐症状，症状严重的则表现为严重的花叶或皱缩，产量损失可达50%。
1.2马铃薯Y病毒（PVY）Y病毒又称为重花叶病毒，病毒粒子形状为弯曲的线形，大小为750nm×11nm，多数通过桃蚜和大戟长管蚜传播。
PVY包括3个株系组：马铃薯Y病毒普通株系组（PVYO）、马铃薯点条斑株系（PVYC）和马铃薯Y病毒褐脉株系（PVYN）。
病毒检测试剂盒说明书
加上额外的损失量。可以用网状带，搅拌器，研钵或者其他的研磨装置研磨样品，如果使用 研钵和研杵在研磨不同的样品时要彻底的清洗干净。
试验步骤 1、加入样品：根据下载的表格，在每个样品孔内加入 100 微升样品液，在阳性对照样品孔 和提取液样品孔个加入 100 微升阳性对照和缓冲液。如果有阴性对照在阴性样品孔加入 100 微升阴性对照。 2、孵化酶标板：加完样品后，用小塑料袋将酶标板装好，放入室温孵化 2 小时或者 2-8 度 过夜。 3、准备酶标抗体溶液：注意：使用前 10 分钟准备酶标抗体溶液。 酶标抗体溶液时浓缩液，因此必须用酶标缓冲液稀释，建议的稀释比例在标签上，在专用的 容器内加入适量的酶标缓冲液。为了确保需要，1 毫升溶液用于 8 个样品孔，一个酶标板需 要 10 毫升缓冲液。然后根据标签比例加入酶标抗体。 举例:如果标签上写着 1:100，并且你准备 10ml 酶标抗体溶液，首先需要准备 10ml 酶标缓冲 液然后加入 100 微升抗体到缓冲液内。 加入抗体后，充分混匀，此步非常重要。 4、洗板：样品孵育完成后洗板，快速倾倒溶液到没有其他液体的水池或者废容器内。 每孔加入 200 微升的 1 倍 PBST，快速倒空酶联板，重复 7 次。 洗板结束后，在吸水纸上吸干残余液体。 检查酶联板，所有的样品孔没有样品残渣，如果还有样品残渣再重复洗板并吸干。 5、加酶标抗体溶液:向每个样品孔加 100 微升酶标抗体溶液。 6 孵育酶标板：室温条件下在湿润的箱子中孵育 2 小时。 7、准备底物溶液：每份底物基片能配置 5 毫升底物溶液，浓度为 1 毫克每毫升，大约够 5 排 8 个样品孔。 大约孵育完成前的 15 分钟，为每个基片量取 5 毫升室温下的 1 倍缓冲液，不能直接用手接 触基片，加基片到缓冲液里。 注意：不能接触基片或者底物溶液暴露在强光下，光及污染会使阴性对照的背景颜色加深。 8、洗板：如前面，用 1 倍洗液洗板 8 次。 检查样品孔存在的气泡，用吸水纸巾吸干残存的液体及气泡，如果还有气泡存在可以用干净 的吸头扎破。 9、加底物溶液：每个样品孔加 100 微升底物溶液。（此步要快，保证显色时间一致） 10、孵育酶联板：闭光孵育酶联板 60 分钟。 11、结果判读：肉眼判断或用酶标仪在 405 纳米读数。在光线下存在气泡会改变测试结果， 因此建议在读数前消除气泡。 样品孔的颜色可以判定测试结果。样品孔的颜色不明显判定为阴性，判定结果只有在阳性对 照颜色明显，缓冲液无色的条件下才有效。 结果可能在孵育 60 项 禁止皮肤或者眼睛直接接触，或吞咽其有效成分。为误食该试剂应了解注意事项，用过该试 剂之后要彻底的冲洗双手。
DAS-ELISA与RT-PCR法检测马铃薯S病毒的比较
黑 龙 江 哈 尔滨 １ ５ ０ ０ ８ ６ ）
摘要 ： 在 马铃 薯种 薯 生 产 中 ， 马 铃 薯 Ｓ病 毒是 田 间 发 病 率较 高 的 病毒 之 一 ， 同 时也 是 最 不 易脱 掉 的 病 毒 。为 了 更 准 确 地 筛查 马 铃 薯 病 毒 病 ， 减 少病毒 病在 田间的侵 染 ， 保 证种 薯质 量 ， 提 高种 薯 产 量 ， 用Ｄ ＡＳ － Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 和 Ｒ Ｔ － Ｐ Ｃ Ｒ 两种 方 法 对 马 铃 薯 ｓ病 毒 筛查 的效 果 进 行 了 比较 。 结 果 表 明 ： 两种方 法间有较 高的吻合度 ， 但 也 存
关键词 ： 马Βιβλιοθήκη 薯 ； Ｐ ＶＳ； 检 测； 方 法
中图分 类 号 ： Ｑ ７ ８ ９ ； ￥ ５ ３ ２ 文献 标识 码 ： Ａ 文章 编 号 ： １ ０ ０ ２ — ２ ７ ６ ７ （ ２ ０ １ ６ ） １ ０ — ０ ０ ５ ８ － ０ ３ Ｄ ［ ） Ｉ ： １ ０ ． １ １ ９ ４ ２ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ｌ ０ ０ ２ — ２ ７ ６ ７ ． ２ ０ １ ６ ． １ ０ ． ０ ０ ５ ８
测 是 防治措 施 中最 为 重 要 的环 节 ， 也 是 种 薯 质 量 认 证 的关键 指标 ＿ ３ ］ 。
１ 材料与方法
１ ． １ 材料
检测样 品来 自于黑龙 江省农 业科 学 院植物 脱 毒 苗木研 究所 ， 样 品 为 马铃 薯种 苗 ， 苗期 ２ ５ ｄ ， 苗
高７ ～１ ２ ｃ ｍ， 茎 叶状 态 良好 ， 符 合 检 测 要 求 。对
检测 ， 使 用酶 标仪 读取 ＯＤ ０ ５ ／ 。 。 值。
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ６ － ０ ８ － ０ ６
马铃薯脱毒苗的主要病毒检测
抗体免疫球蛋 白和酶标抗 体、 包被缓冲液、 样 品缓冲液 、 磷酸缓冲液、洗液、底物缓冲液、终止液、实验用检测马铃薯 病毒的 ６种病毒抗体和酶标均是本实验室制备的。 实验用阳性
对照是本实验室通过验 方 法 （ １ ） 包被 抗体
２ ． １马铃薯 Ｘ病毒的检 测
对９ ６ 份材料进行 了Ｐ Ｖ Ｘ的检测， 通过酶联免疫检测仪测 定 ＯＤ 值， 根据与 阴性对照对 比来判断每份材料是否带有病 毒 。在 ９ ６份材料 的检测结果 中，９ ６份材料 的检测结果均是 阴性的，也就是 ９ ６份材料均不含有马铃薯的 ｘ病毒。 ２ ． ２马铃薯 Ｙ病毒 的检 测 对９ ６ 份材料进行 了Ｐ Ｖ Ｘ的检测， 通过酶联免疫检测仪测 定 ＯＤ 值， 根据与阴性对照对 比来判断每份材料是否带有病 毒 。在 ９ ６份材料 的检测结果 中，８ １ 份材料为 阴性 ，也就是 ８ １ 份材料不含有 Ｐ ｖ Ｙ， １ ５ 份材 料含 有Ｐ ｖＹ， 带毒率为 １ ６ ． ２ ％。 ２ ． ３马铃 薯卷叶病毒 的检测 对９ ６份材料进行 了卷 叶病毒的检测， 通过酶联免疫检测 仪测定 Ｏ Ｄ 值， 根据与阴性对照对 比来判断每份材料是否带 有病 毒。在 ９ ６份材料 的检测结果中 ，２ ９份材料为阴性 ，６ ７ 份材 料含 有 Ｐ Ｌ Ｒ Ｖ，病毒带有率为 ７ ０ ． ２ ％。 ２ ． ４ 马铃 薯 Ｓ 病毒 的检测 对９ ６ 份 材料进行 了 Ｐ ＶＳ的检测， 通过酶联免疫检测仪测 定 Ｏ Ｄ 值， 根据与阴性对照对 比来判断每份材料是否带有病 毒。在 ９ ６份材料 的检测结果中 ，２ ２份材料为阴性 ，也就是 ２ ２ 份材料不含有 Ｐ ＶＳ ， ７ ４ 份材料含有 Ｐ ＶＳ ， 带病 毒率 为 ７ ８ ％。 ２ ． ５ 马铃薯 Ｍ病毒 的检测 对９ ６份材料进行 了 Ｐ Ｖ Ｍ 的检测， 通过酶联免疫检测仪测 定 Ｏ Ｄ 值，根据与阴性对照对 比来判 断每份材料是否带有病
乌鲁木齐马铃薯病毒病种类及防治措施
薯 脱 毒试 管 苗 、 原原种 、 各级 良种共 ８ ６个 样 品 ，
ｊ 酶联 免疫 吸 附试 验 （ Ｄ Ａ Ｓ — Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ） 方 法 对 ６种 病
｝ 行检 测 ，分 析乌 鲁木 齐 地 区脱 毒 马铃 薯各 级 种 ｉ 毒携 带情 况 ，以便更 好 地 了解 本地 脱 毒 马铃 薯 ｆ 质量 。为有 针对 性地 防治 马铃 薯病 毒 病提 供 理
据。
一
④取 １ 克样 品，加 １ Ｏ 毫升常规提取缓冲液 ， 在
研 钵 中碾碎 提 取 ； 使 用 高速 离心 机沉 淀 使用 上 清液 ； 样 品和 提取 液 的 比例 是 １ 克／ １ ０毫升 。
⑤在包被检测孔中注入 阳性和阴性对照物 ， 每
种样品 １ ０ ０毫 升 ， 所 有 样 品和对 照都 要 做 重复 孔 ； 阳 性 和 阴性 对 照的制 备 是通 过添 加 ２毫 升蒸 馏水 或 去
（ 收 稿 日期 ： ２ ０ １ ３ — ０ ８ — ２ ３ ）
选用 １ ． ８ ％阿 维 菌 素 ３ ０ ０ ０倍 液 ＋ ２ ０ ％ 啶 虫 脒
） ０倍 液 ， 可 有效 防治 盲 蝽 、 蚜 虫 及 叶螨 等 多 种 棉
虫。
６ ． 喷药 务 必要 求 细 致 ， 药 液 浓度 不 一 定 大 ， 但 用
药 液量必 须 大些 ， 要 求全 株着 药 。 由于成 虫 善飞 ， 每 次 喷药后 都 有残 虫 ，应 连续 多次 喷 药 。特别 是 生长 快、 长势 旺 的棉 田和 雨水 多 的年 份更 要注 意 管理 ， 加 强 防治 ， 每５ ～ ７天用 药 １ 次， 连续 防治 ３ — ４次 。
⑥用封口膜 ， 包裹酶标板 ， ４ ℃隔夜培养 （ 至少 １ ６
马铃薯种薯病毒检测方法2016-6-27
马铃薯种薯病毒检测现已发现，造成马铃薯退化的病毒有30余种，严重为害马铃薯的病毒有七种：马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯A病毒（PV A）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯S病毒（PVS）及马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）。
在马铃薯栽培过程中，出现叶片皱缩卷曲，叶色浓淡不均，茎秆矮小细弱，块茎变形龟裂，产量逐年下降等现象，就表明马铃薯已经发生“退化”。
种薯“退化”是病毒的侵染及其在薯块内积累造成的，也是引起产量降低和商品性状变差的主要原因。
采用现代生物技术将种薯内的病毒去掉，恢复马铃薯品种本身的生理功能和生产特性，才能防止马铃薯的“退化”，使之达到育种家培育品种本身的商品性状和产量。
这就是种薯需要脱毒和采用脱毒种薯能够大幅度提高产量的重要原因。
1.种薯分类复合国家标准（GB18133-2012 表1）规定的相应质量要求的种薯为原原种、原种、一级种薯和二级种薯。
表1 各级别种薯田间检查植株质量要求1.1原原种（G1）用脱毒组培苗或试管薯在防虫网、温室等隔离条件下生产，经过质量检测达到国家标准（表1）要求的，用于原种生产的种薯。
1.2原种（G2）用原原种作种薯，在良好隔离环境条件下生产的，经过质量检测达到国家标准（表1）要求的，用于生产一级种的种薯。
1.3一级种薯（G3）在良好隔离环境中，用原种作种薯生产的，经过质量检测达到国家标准（表1）要求的，用于生产二级种的种薯。
1.4二级种薯（G4）在相对隔离环境中，用一级种作种薯生产，经过质量检测后达到国家标准（表1）要求的，用于生产商品薯的种薯。
1.5种薯批来源相同、同一块地、同一品种、同一级别以及同一时期收获、质量基本一致的马铃薯植株或块茎作为一批。
2.主要检测病毒2.1马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）2.2马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）2.3马铃薯A病毒（Potato virus A,PV A）2.4马铃薯M病毒（Potato virus M,PVM）2.5马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus,PLRV）2.6马铃薯S病毒（Potato virus S,PVS）2.7马铃薯纺锤块茎类病毒（Potato spindle tuber viroid,PSTVd）3.检测方法3.1病毒检测采用酶联免疫（ELISA）或反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法。
马铃薯病毒检测流程
马铃薯病毒检测流程英文回答：Potato virus detection is an essential process in ensuring the quality and health of potato crops. There are several steps involved in the potato virus detection process.Firstly, sample collection is crucial. Plant tissue samples are collected from various parts of the potato plants, including leaves, stems, and tubers. These samples are carefully chosen to represent different areas of the field and different stages of plant growth.After sample collection, the next step is sample preparation. The collected plant tissue samples need to be processed to extract the viral particles. This can be done through various methods, such as grinding the plant tissue and extracting the viral RNA or DNA using specialized kits or reagents.Once the viral particles are extracted, the next stepis virus detection. There are different techniquesavailable for virus detection, including serological methods, molecular methods, and bioassays. Serological methods involve the use of antibodies to detect specific viral proteins, while molecular methods use nucleic acid amplification techniques, such as polymerase chain reaction (PCR), to detect viral RNA or DNA. Bioassays involve inoculating test plants with the extracted viral particles and observing for symptoms of infection.After virus detection, the results need to be analyzed and interpreted. This involves comparing the test results with known virus strains and determining the presence or absence of specific viruses. It is important to consider the sensitivity and specificity of the detection method used to ensure accurate results.Finally, the results need to be reported and communicated to the relevant stakeholders, such as farmers, agronomists, and plant health authorities. This informationis crucial for making informed decisions regarding disease management and control strategies.In conclusion, the potato virus detection process involves sample collection, sample preparation, virus detection, result analysis, and result reporting. It is a critical step in ensuring the health and quality of potato crops.中文回答：马铃薯病毒检测流程是确保马铃薯作物质量和健康的关键步骤。
马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)的RT—PCR检测
究使用韩 国 Ｉ Ｎ Ｔ Ｒ Ｏ Ｎ生物化 学制药 公司生 产的 Ｐ Ｓ Ｔ Ｖ ｄ检测 试剂盒 ， 旨在通过试验说明使用该试 剂盒提取植物 ｍＲ Ｎ Ａ具
有方法简便 、 省 时、 灵敏度高等优点 ， 而且 可 以对 不 同 的 马 铃
影响其生长。 试 验 结果 表 明 ， 完 全黑 暗 条 件不 利 于 愈 伤 组 织 的形 成 ， 适 宜 的光 照 条件 能刺 激 叶 片 细胞 脱 分 化 ， 加 快 愈 伤 组织 的形 成 ，
２ ０ ％～ ３ ５ ％， 常常因此造成较 大的经济损失 。马铃薯类病 毒是马铃薯种薯检疫规程 中的主要检疫对象 ， 具有广泛 的传 播途径 ， 是唯一不能通过茎尖剥离 、 组 织培养而汰除的病毒 ， 必须通过严格的检测而将其汰除。据报道 ， 控制 Ｐ Ｓ Ｔ Ｖ ｄ传染 的有效方法仅有依赖 于 Ｐ Ｓ Ｔ Ｖ ｄ的早期 鉴定 。 目前主要 采 用指示植物 、 聚丙烯酰胺凝胶 电泳技术 、 核酸斑点杂交技术等 方法进行检测。随着 Ｐ Ｃ Ｒ技 术 的产 生 ， Ｒ Ｔ—Ｐ Ｃ Ｒ技 术 已经 被越来越广泛地应用 在 Ｒ Ｎ Ａ病 原的鉴定上 ， 应用 Ｒ Ｔ—Ｐ Ｃ Ｒ 技术检测植物病原具有快速 、 灵敏 、 简便 、 特异性强等优点 ， 而 且可 以检 测 出 植 物 组 织 中含 量 极 低 的 病 毒 Ｒ Ｎ Ａ － ４ ］ 。 本 研
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 试 验 材 料
感染 Ｐ Ｓ Ｔ Ｖ ｄ的马铃薯试管苗 、 块茎 由俄罗斯 哈巴农业科 学研究院马铃薯研究所提供 ； 健康 的马铃薯试管苗 、 块茎 由延
边 农 业科 学研 究 院 提 供 。
马铃薯病毒PVY,PVS和PLRV多重RT-PCR检测
马铃薯病毒PVY,PVS和PLRV多重RT-PCR检测黄丹;余琨;陈建斌;蔡红;朱有勇【摘要】病毒是马铃薯生产过程中危害较大的一类病原,为快速检测出云南省马铃薯主要病毒种类,依据病毒外壳蛋白基因序列设计合成了马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)的特异性引物,从退火温度、最低检测浓度、热反应循环条件、病毒间的模板及引物间的最佳组合浓度进行优化,建立了三重RT-PCR反应体系.结果表明:该优化体系可同步扩增出上述3种病毒,分别得到480 bp (PVY)、187 bp (PVS)、336 bp (PLRV)大小的扩增片段.优化的三重RT-PCR反应体系可快速、灵敏、简便的检测到单一或复合侵染的马铃薯病毒,有利于马铃薯病毒病的早期检测和防治,将为云南省马铃薯种苗脱毒、继代、田间植株的高产栽培等有重要实践作用.【期刊名称】《云南农业大学学报》【年(卷),期】2015(030)004【总页数】6页(P535-540)【关键词】马铃薯;病毒;多重RT-PCR检测【作者】黄丹;余琨;陈建斌;蔡红;朱有勇【作者单位】云南农业大学植物病理重点实验室,云南昆明650201;云南省建水县农业技术推广所,云南建水654399;云南农业大学植物病理重点实验室,云南昆明650201;云南农业大学植物病理重点实验室,云南昆明650201;云南农业大学植物病理重点实验室,云南昆明650201【正文语种】中文【中图分类】S435.32马铃薯病毒病是马铃薯非常重要的一类病害，病毒的侵染可引起马铃薯种质退化，导致产量急剧下降[1]。
我国各马铃薯主产区均有马铃薯病毒病发生[2]。
主要的马铃薯病毒种类有马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus，PLRV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、马铃薯A病毒(Potato virus A，PVA)和马铃薯S病毒(Potato virus S，PVS)[3-4]。
马铃薯种薯生产中的病毒检测
１１ 采 ． 样
免疫吸附测定法 的要求配 制，包被缓冲液在 ４ ℃下保存 １ ８ 周 ， 品提取 液在 ４ ℃下可保存 ２ 样 个月 ， Ｂ Ｔ洗涤缓冲液 ＰＳ
在 ４ ℃下可保存 ６个月 ，底物缓冲液在 ４℃下可保存 １ 个 ８
月 ，底 物 现 用 现 配 。
２ 种薯生产中病毒 检测 的种类
薯
主要检测种类为 Ｐ ＶＸ、 ＶＹ、Ｐ Ｓ Ｌ Ｐ Ｖ 和Ｐ ＲＶ四种病毒 。
３ 马铃薯病毒病分布调查
１０ｍ ０ 为单位， 分划 ５ 每片随机取 ４ 片， 个样 ， 共取 ２ 份样品。 ０ 凡用于继代繁殖 的组培 苗 ， 瓶必检。将组培苗分成单 每
株 ，剪下带生 长点的 １ １ ，扦插 在 ＭＳ培养基上继繁一 叶 心 代 ，编号记录 ；植株的其余部分送去 检测。
引 起 品种 退 化 。 目前 通 过微 茎尖 组 织 培 养 技 术 能从 马 铃 薯体
每个酶联 孔使 用的包被血清、 品提取液 、 血清 、 样 酶标 洗
涤 缓 冲 液 用 量 统 一 ， 用 ＭＫ一 全 自动 洗 板 机 （ 兰 产 ） 采 ２ 芬 洗
板 ，每次洗板 ４ ，每遍 ５ ｍｉ。设有阳性 、阴性和 空白对 遍 ｎ 照各 ２ ， 个 每板可测 ９ 个样 品， 温箱 ３ ℃下温育 ２ ０ 在 ７ ～４ ｈ， 或在 冰箱 内４ ～６ ℃下过 夜。
上海农业科技
２ １— ０２ ２
马铃 薯种薯生产中的病毒检测
王清福 居 玉玲 （ 农友种苗 （ 中国 ） 有限公 司上海分公 司，上海青浦 ２１０ ） ０７ ８
摘 要 ：病毒 检测 是马 铃薯 种 薯生 产 中不可 或缺 的一环 ，双 抗体酶 联免 疫 吸附测 定法 （ ＤＡＳ Ｌ Ｓ ）是一 —Ｅ Ｉ Ａ 种简 单 、灵敏 度 高 、特 异性 强 ，安 全 、快速 、结 果容 易观 察 、适于 商业 化大 量 样 品的检 测 方法 。 介绍 了此 方法 的 操作 程序及 其相 配 套的 采样 方法 ，并对多 年实 践 中马铃 薯组培 苗和 种瞽 生产 中的 检测 数据 进行 了简 要的统 计分析 。 关键 词 ：马 铃 薯 ，种 薯 ；病 毒 ；双 抗 体 酶联 免 疫 吸 附 测 定 法 检 测程 序 ；检 测分 析
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
马铃薯病毒检测试剂盒说明书
(DAS-ELISA)
一、实验原理
马铃薯病毒检测试剂盒是应用血清学检测技术检测马铃薯病毒，利用抗原(病毒颗粒)与其特异性抗体在离体条件下产生专一性反应的原理。
双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)是最为灵敏的血清学技术之一。
二、进行DAS-ELISA实验所需的材料
1. ELISA试剂盒中包括的材料(附录1)
2. 1000 ml烧杯和瓶子各2个(配制洗液PBST、样品提取缓冲液)
3. 10-15ml小烧杯6个(配制酶标溶液)
4. 100ml 烧杯1个(配制底物溶液)
5. 记号笔(标记样品、酶联板)
6. 移液器(最好同时有1道和8道移液器)，吸头
7. 冰箱(4℃和-20℃)
8. 37℃温箱
9. 蒸馏水
10. 吸水纸或高级卫生纸
11. 一个厚壁试管或平底小瓶子(用来研样)
12. 小塑料袋(孵育时用来装酶标板)
三、注意事项
1. 底物有剧毒，如果您的手接触了药片或溶液，用大量的流动水彻底冲洗。
2. 在实验过程中，不能将酶联板裸露在空气中。
3. 各种试剂都添加了NaN3，实验过程中，一定要带手套操作，不能用手直接接触。
4. IgG-AP保存于4℃。
四、试验步骤
1.配制溶液
1.1洗液：取出1包PBS缓冲液，溶于1000mL蒸馏水中，然后加入0.5mL Tween20，混合均匀，即为洗液(PBST)。
1.2 样品提取缓冲液：定溶至1000ml，加入0. 5ml Tween20，即为样品提取缓冲液。
1.3阳性对照：将冻干叶片放入取样袋中，加入1ml提取缓冲液，充分研磨，然后4000rpm，离心3min，将上清液分装成105ul/支,保存在-20℃。
1.4阴性对照：将冻干叶片放入取样袋中，加入1ml提取缓冲液，充分研磨，然后4000rpm，离心3min，将上清液分装成105ul/支,保存在-20℃。
2.制样
2.1 将样品(0.1～0.15g)放于塑料袋中，用记号笔标记好。
检测叶片时，应选择有症状的，或从植株的顶部、中部和底部各取一片叶子合在一起。
2.2向样品袋中加入1.0～1.5mL提取缓冲液(样品重量：样品提取缓冲液=1：10)，将样品充分研磨。
2.3 将样品袋中的溶液挤到1.5ml的离心管中，4000rpm离心3min，取上清液备用。
2.4将已经包被好酶标板取出，用记号笔在酶标板上标记病毒名称。
2.5向每孔中加入100 uL样品上清液。
注意：每个样品用一个Tip头(不能重复使用)。
2.6设置阴性对照孔，加入100 uL阴性对照溶液。
2.7 设置阳性对照孔，加入100 uL阳性对照溶液。
2.8 加完样品后，用小塑料袋将酶标板装好，放入4℃的冰箱内过夜或37℃孵育3小时。
3.加酶标抗体溶液
3.1准备酶标缓冲液。
酶标缓冲液为5×母液，临用前用蒸馏水5倍稀释即可，现用现配。
3.2向酶标缓冲液中加入酶标抗体(IgG-AP)，IgG-AP使用浓度为1:1000，如：0.1uL IgG-AP溶于1mL酶标缓冲液中。
轻轻地混匀，避免产生气泡，此混合液称作酶标抗体溶液。
(注：取用酶标抗体时应首先将离心管短暂离心一下，使粘在离心管壁上的抗体液沉于管底，易于吸取。
)
3.3 洗板：每孔加入200ul PBST，浸泡1min，倒空酶联板，立即在吸水纸上吸干残余液体。
洗板3～4次。
3.4 向每个样品孔中加入100 uL酶标抗体溶液。
3.5 37℃下孵育2小时或4℃过夜。
4.加底物溶液
4.1 准备底物缓冲液：底物缓冲液为5×缓冲液，临用前用蒸馏水5倍稀释即可，现配现用。
4.2如2.5所示，洗板3～4次。
4.3底物溶液配制：每片底物重50mg，其中含pNPP 5 mg。
1片底物(50mg)溶于5mL底物缓冲液中。
4.4向每个样品孔中加底物溶液100uL，此步试验应快速完成，最好用8道移液器加，以保证显色时间一致。
然后将酶标板在室温(20~25℃)避光孵育，加入底物后5分钟开始观察结果，当阳性对照明显显色后读数值，20~60分钟结果有效。
60分钟后结果不做参考。
4.5结果判读：
1.酶标仪读数：在OD405/490读数，一般情况下，OD405/490≥2×阴性对照的样品判断为感染病毒。
2.肉眼判断：根据阳性对照和阴性对照的反应来判定样品是否感染病毒。
阳性对照和感病的样品表现为黄色，颜色的深浅与样品中病毒的含量成正比。
2小时后，将出现非特异性反应。
因而，应在此之前记录结果。
附录1：与酶联板对应样品记录
附录2：检测结果登记表
检测结果。