马铃薯病毒检测试剂盒说明书 (1)

马铃薯病毒检测试剂盒说明书
(DAS-ELISA)
一、实验原理
马铃薯病毒检测试剂盒是应用血清学检测技术检测马铃薯病毒，利用抗原(病毒颗粒)与其特异性抗体在离体条件下产生专一性反应的原理。

双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)是最为灵敏的血清学技术之一。

二、进行DAS-ELISA实验所需的材料
1. ELISA试剂盒中包括的材料(附录1)
2. 1000 ml烧杯和瓶子各2个(配制洗液PBST、样品提取缓冲液)
3. 10-15ml小烧杯6个(配制酶标溶液)
4. 100ml 烧杯1个(配制底物溶液)
5. 记号笔(标记样品、酶联板)
6. 移液器(最好同时有1道和8道移液器)，吸头
7. 冰箱(4℃和-20℃)
8. 37℃温箱
9. 蒸馏水
10. 吸水纸或高级卫生纸
11. 一个厚壁试管或平底小瓶子(用来研样)
12. 小塑料袋(孵育时用来装酶标板)
三、注意事项
1. 底物有剧毒，如果您的手接触了药片或溶液，用大量的流动水彻底冲洗。

2. 在实验过程中，不能将酶联板裸露在空气中。

3. 各种试剂都添加了NaN3，实验过程中，一定要带手套操作，不能用手直接接触。

4. IgG-AP保存于4℃。

四、试验步骤
1.配制溶液
1.1洗液：取出1包PBS缓冲液，溶于1000mL蒸馏水中，然后加入0.5mL Tween20，混合均匀，即为洗液(PBST)。

1.2 样品提取缓冲液：定溶至1000ml，加入0. 5ml Tween20，即为样品提取缓冲液。

1.3阳性对照：将冻干叶片放入取样袋中，加入1ml提取缓冲液，充分研磨，然后4000rpm，离心3min，将上清液分装成105ul/支,保存在-20℃。

1.4阴性对照：将冻干叶片放入取样袋中，加入1ml提取缓冲液，充分研磨，然后4000rpm，离心3min，将上清液分装成105ul/支,保存在-20℃。

2.制样
2.1 将样品(0.1～0.15g)放于塑料袋中，用记号笔标记好。

检测叶片时，应选择有症状的，或从植株的顶部、中部和底部各取一片叶子合在一起。

2.2向样品袋中加入1.0～1.5mL提取缓冲液(样品重量：样品提取缓冲液=1：10)，将样品充分研磨。

2.3 将样品袋中的溶液挤到1.5ml的离心管中，4000rpm离心3min，取上清液备用。

2.4将已经包被好酶标板取出，用记号笔在酶标板上标记病毒名称。

2.5向每孔中加入100 uL样品上清液。

注意：每个样品用一个Tip头(不能重复使用)。

2.6设置阴性对照孔，加入100 uL阴性对照溶液。

2.7 设置阳性对照孔，加入100 uL阳性对照溶液。

2.8 加完样品后，用小塑料袋将酶标板装好，放入4℃的冰箱内过夜或37℃孵育3小时。

3.加酶标抗体溶液
3.1准备酶标缓冲液。

酶标缓冲液为5×母液，临用前用蒸馏水5倍稀释即可，现用现配。

3.2向酶标缓冲液中加入酶标抗体(IgG-AP)，IgG-AP使用浓度为1:1000，如：0.1uL IgG-AP溶于1mL酶标缓冲液中。

轻轻地混匀，避免产生气泡，此混合液称作酶标抗体溶液。

(注：取用酶标抗体时应首先将离心管短暂离心一下，使粘在离心管壁上的抗体液沉于管底，易于吸取。

)
3.3 洗板：每孔加入200ul PBST，浸泡1min，倒空酶联板，立即在吸水纸上吸干残余液体。

洗板3～4次。

3.4 向每个样品孔中加入100 uL酶标抗体溶液。

3.5 37℃下孵育2小时或4℃过夜。

4.加底物溶液
4.1 准备底物缓冲液：底物缓冲液为5×缓冲液，临用前用蒸馏水5倍稀释即可，现配现用。

4.2如2.5所示，洗板3～4次。

4.3底物溶液配制：每片底物重50mg，其中含pNPP 5 mg。

1片底物(50mg)溶于5mL底物缓冲液中。

4.4向每个样品孔中加底物溶液100uL，此步试验应快速完成，最好用8道移液器加，以保证显色时间一致。

然后将酶标板在室温(20~25℃)避光孵育，加入底物后5分钟开始观察结果，当阳性对照明显显色后读数值，20~60分钟结果有效。

60分钟后结果不做参考。

4.5结果判读：
1.酶标仪读数：在OD405/490读数，一般情况下，OD405/490≥2×阴性对照的样品判断为感染病毒。

2.肉眼判断：根据阳性对照和阴性对照的反应来判定样品是否感染病毒。

阳性对照和感病的样品表现为黄色，颜色的深浅与样品中病毒的含量成正比。

2小时后，将出现非特异性反应。

因而，应在此之前记录结果。

附录1：与酶联板对应样品记录
附录2：检测结果登记表
检测结果。