生物分离工程(三版)(孙彦)03章

初级分离概念
初级分离是指从发酵液、细胞培养液、胞 内抽提液（细胞破碎液）及其他各种生物 原料初步提取目标产物，使目标产物得到 浓缩和初步分离的下游加工过程。
初级分离特点
分离对象：体积大、杂质含量高； 分离技术：低操作成本、适于大规模生产
沉淀分离－学习要点
识记：盐析和盐溶概念 理解：蛋白质凝集沉淀的屏障，各种沉
淀方法的原理和影响因素 应用：采用不同的试剂方法实现蛋白质
的沉淀
沉淀的定义
由于物理环境的变化而引起 溶质溶解度的降低、生成固体凝 聚物的现象，称为沉淀。
沉淀与结晶的区别
沉淀生成的固体颗粒是不定形的 结晶产品为单一组分，而沉淀凝聚物则
成分非常复杂（除了目标产物外，还夹 杂着多种共存的杂质、盐和溶剂等） 沉淀的纯度远低于结晶 多步沉淀操作也可获得高纯度的目标产 品
相同离子强度下，不同种类的盐对蛋白质的盐析效果不同 盐的种类将影响到Cohn方程中的盐析常数 盐的种类对蛋白质溶解度的影响与离子的感胶离子序列相符
温度和pH值
在低离子强度溶液中，蛋白质的溶解度在一定的温度范围内 随着温度升高而增大 在高离子强度溶液中，温度的升高利于蛋白质脱水，破坏水 化层并导致蛋白质溶解度的降低
分子间的静电排斥作用
根据扩散双电层理论，胶粒是带电的，其表面吸附相反 电荷的反离子，这些位于胶粒周围过量的反离子好像胶粒四 周为离子氛所包围。当两个胶粒（蛋白质）趋近而使离子氛 发生重叠时，处于重叠区内的反离子浓度较大，从而破坏了 原有电荷的对称性，引起离子氛中电荷重新分布，即离子从 浓度较大的重叠区向未重叠区扩散。这种扩散的结果就是胶 粒受到斥力而相互脱离。
生物分离工程
初级分离技术
总体学习目的和要求
了解蛋白质表面特性，掌握各种 沉淀和泡沫分离的原理、特点以
及应用范围。
目录
引言 沉淀分离
蛋白质表面特性 盐析沉淀 等电点沉淀 有机溶剂沉淀 热沉淀 其他沉淀法 沉淀生成动力学
泡沫分离
引言－学习要点
识记：初级分离概念 理解：初级分离特点
蛋白质折叠趋势
疏水性氨基酸：向内部折叠的趋势 亲水性氨基酸：分布于蛋白质外表面的趋势
结果
在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残基
暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区
胶体的定义
胶体是一种尺寸在1～100 nm以 至1000 nm的分散体。它既非大 块固体，又不是分子分散的液 体，而是具有两相的微不均匀 分散体系。
-《被遗忘了尺寸的世界》
Wilhelm Friedrich Ostwald (1853 – 1932)
胶体的性质
比表面增大，界面现象重要
强烈的尺寸效应
蛋白质表面特性－蛋白质性质
蛋白质的胶体性质
蛋白质的分子量约6～1000 kDa，分子直径约为1~30 nm。 在此粒径范围内，蛋白质可视为胶体，并表现出胶体溶液的 部分性质
的各种因素 应用：掌握盐析操作过程
盐析沉淀-盐析的定义
定义
蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发 生沉淀的现象称为盐析（Salting-out）
溶解度与I的关系－Cohn方程
log S K S I
盐析沉淀-盐析原理
低离子强度下的盐溶
向蛋白质的纯水溶液中加入电介质后，蛋白质将吸附盐离子， 而形成扩散双电层（产生分子间相互排斥作用）导致蛋白质 的溶解度增大，发生盐溶
沉淀技术适用范围
沉淀分离在生物分离过程中应用相当广泛。 一般情况下，沉淀分离方法在生物下游加工过 程中通常作为初级分离技术加以使用，但在实 际过程中也有仅通过沉淀分离得到目标产品的 工业实例。
蛋白质表面特性－蛋白质组成
蛋白质组成
20种氨基酸构成的两性高分子电解质，包括疏水性 氨基酸和亲水性氨基酸
高离子强度下的盐析
溶液主体中那些与扩散层反离子电荷符号相同的电解质离子 将把反离子压入（排斥）到双电层中
由于盐的水化作用，其将争夺蛋白质水化层中的水分子，使 蛋白质表面疏水区脱水而暴露，增大它们之间的疏水性作用
盐析沉淀-盐析原理图示
盐析沉淀-影响盐析因素
蛋白质的分子量和结构
无机盐种类和浓度
蛋白质的两性电离和等电点
蛋白质两端及侧链中有一些解离基 ，解离程度受pH影响。
蛋白质的变性
物理因素：加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、 超声波的作用等；
化学因素：有强酸、强碱、尿素、重金属盐、SDS等。
蛋白质表面特性－沉淀屏障
蛋白质分子周围的水化层
水溶液中蛋白质可视为胶粒，其周围存在着稳定的水化层 胶粒外的这部分水客观上起排斥作用，称为“水化层斥力”
蛋白质表面特性
－沉淀策略及方法
策略
破坏蛋白质四周水化层 降低双电层厚度
沉淀方法
改变溶液pH值 加入无机盐或改变无机盐种类 加入水溶性有机溶剂 添加脱水剂
蛋白质表面特性
－常用的沉淀技术
盐析沉淀 等电点沉淀 有机溶剂沉淀 聚合物沉淀 热沉淀
盐析沉淀-学习要点
识记：盐析和盐溶概念 理解：盐析沉淀的原理，影响盐析
饱和密度为1.235 kg/L； 0℃下，饱和浓度为3.825 mol/L（相当于505 g/L）
源自文库
盐析操作-溶解度曲线确定
离心分离 沉淀物并 重新溶解 测定其中 总蛋白和 目标蛋白 的浓度
以饱和度 为横坐标， 上清液中 总蛋白和 目标蛋白 浓度为纵 坐标，得 到蛋白质 溶解度曲 线
1
protein relative content in supernatant )
盐析沉淀-无机盐的选择
溶解度大 可配制成具有较高离子强度的 无机盐溶液
溶解度受温度的影响较小 盐溶液密度不高，以便蛋白质沉淀的沉
降或离心分离。
盐析操作-沉淀剂性质
对于用于沉淀剂的无机盐试剂，了解其性 质，特别是无机盐的溶解性质（溶液密度、饱 和浓度等），是必需的。
以硫酸铵为例： 20℃下，饱和浓度为4.05 mol/L（相当于534 g/L）
0.8
0.6
0.4
0.2
0 0
20
40
60
80
100
％ of saturation of ammonium sulphate
Typical ammonium sulphate precipitation ranges for proteins from a crude extract in supernatant. (●) EGFP relative content in supernatant, (■)total protein relative content in supernatant