不可忽视的细节—血液基因组提取

基因组提取方法
溶液盐析法：无需酚氯仿，样本量灵活可变，得率高 硅胶膜吸附法：利用硅胶膜特异吸附核酸的原理来纯化核酸 磁珠法：独特包埋的磁珠，在一定条件下对核酸具有很强的亲和力，而 当条件改变时，磁珠释放吸附的核酸，能够达到快速分离纯化核酸的目 的。 传统酚氯仿法：传统方法，抽提时间长，成本低。但酚氯仿有毒，危害 身体健康。
核细胞裂解来自百度文库
如果有裂红的步骤，请尽量将上清去除再加入裂解液。 加入裂解液（如：TIANGEN试剂盒中的GB或FG）和蛋白酶K需要彻底混匀。 将沉淀打散混匀后再进行水浴。 水浴时看到溶液变清，没有粘稠物或沉淀时即可进行下步操作，通常水 浴时间10-30min.
若采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，动作要轻柔。离心分离两相
内容
DNA提取的原则 基因组提取方法
样本保存和前处理
基因组提取流程 DNA保存及检测方法 试剂选择原则
样本保存和前处理－抗凝血液
保存 柠檬酸、EDTA、肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶反应有可能起阻害 作用,采血时如没有特殊要求,请使用柠檬酸或EDTA处理血样。 加入抗凝剂混匀后2-8℃保存一周；－20℃保存一个月；－70℃长期保存。 尽可能保证样本不经过反复冻融。
样本前处理
1. 冻存的抗凝血液使用前溶解应在37℃水浴迅速溶解。 2. 抗凝血提取前需要彻底混匀后再吸取实验所需的体积。
样本保存和前处理－非抗凝血
保存 非抗凝血即血凝块。-20℃保存一个月；-70℃长期保存。尽可能保证样本 不经过反复冻融。 样本前处理 1. 冻存的血凝块使用前应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。 2. 血凝块取出后先采取机械破碎的方法（例如：放入无粉橡胶手套中捏 碎或匀浆）将血凝块破碎，然后再根据自己的实验取适量样本。
DNA提取的原则 基因组提取方法
样本保存和前处理
基因组提取流程 DNA保存及检测方法 试剂选择原则
基因组提取流程
溶液法（盐析法）
吸附柱法
样本裂解 纯化去蛋白 沉淀核酸
样本裂解
加入吸附柱
缓冲液漂洗 洗涤去盐 DNA洗脱收集
溶解DNA沉淀
红细胞裂解
哺乳动物血液的红细胞中没有细胞核且核酸酶含量丰富，所以裂解红细胞 对核酸提取非常重要。红细胞裂解有两种方式： 采用红细胞裂解液进行裂解（通常红细胞裂解液按照3倍全血体积加 入进行裂解).
不可忽视的细节
—血液基因组提取
天根生化科技（北京）有限公司
内容
DNA提取的原则 基因组提取方法
样本保存和前处理
基因组提取流程 DNA保存及检测方法 试剂选择原则
DNA提取原则1：DNA片段长度
DNA Length
严格要求片段长度: 构建文库 PFGE(脉冲场凝胶电泳) 没有严格要求: PCR Southern Blots RFLP
血凝块前期破碎程度越高，提取基因组就越容易！
样本保存和前处理－白膜层
保存 全血分离得到的白膜层放置-20℃或-70℃长期保存。尽可能保证样本不经 过反复冻融。 样本前处理
1. 白膜层是将全血离心取中间层所得。白细胞则是用红细胞裂解液裂解
红细胞后得到的沉淀。 2. 冻存的白膜层使用前应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。
DNA提取原则2：DNA产物纯度
• 严格要求产物纯度
存档、产物长期保存 Southern杂交 荧光定量PCR SNP Microarray CGH (比较基因组杂交)
• 没有严格要求
常规PCR
内容
DNA提取的原则 基因组提取方法
样本保存和前处理
基因组提取流程 DNA保存及检测方法 试剂选择原则
时，应保证一定的转速和时间，且吸取上清时注意不要吸取到中间层及 有机相。
核酸吸附或沉淀
硅胶膜吸附法 1. 加入乙醇颠倒混匀后可能会出现絮状沉淀，动作要轻柔。 2. 将裂解的溶液和絮状沉淀全部加入到吸附柱里，此时的溶液应是高盐 低pH值的。通过硅胶膜特异吸附核酸的特性将裂解溶液中的核酸吸附到 硅胶膜上。 溶液法 1. 当沉淀时间有限时，用预冷的异丙醇沉淀，沉淀会更充分。 2. 加入异丙醇颠倒混匀后应出现丝状沉淀，动作要轻柔，避免基因组因 过于猛烈的外力而降解。 3. 分离沉淀的方法：a.用枪头小心地将丝状沉淀挑出；b.离心分离，应 保证一定的转速和时间。
采用细胞裂解液进行裂解（TIANGEN的细胞裂解液CL是按照2.5倍全血
体积），细胞裂解液将红细胞裂解的同时可以裂解白细胞，得到的为 细胞核沉淀，更方便基因组DNA的提取。
红细胞裂解充分的现象： 得到的沉淀应为白色沉淀或淡粉色沉淀。有时血液需要进 行两次裂解，注意第二次加入裂解液后需要将沉淀votex 彻底混匀。
分离得到的血清/血浆放置-70℃保存。尽量避免样本反复冻融。
样本前处理 1. 冻存的血清/血浆使用前溶解应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。 2. 血清/血浆核酸提取时无需红细胞裂解。 3. 只需100-200ul样本，基本能满足下游常规PCR或荧光定量PCR检测。
样本保存和前处理－微量血液/干血点/羊水/胸水
保存 口拭子：干燥后室温保存 漱口水：4℃保存或离心得到沉淀-20℃或-70℃保存 样本前处理 1. 拭子将拭子棉头剪入到离心管里，加入缓冲液直接进行提取。
2. 有些拭子的棉头剪不下来，可以将拭子在生理盐水里漂洗几次，离心
得到沉淀再进行核酸提取。 3. 漱口水先进行离心得到沉淀再进行核酸提取。
内容
保存 微量血液：抗凝血液-20或-70℃保存；
干血点：干燥后室温或4℃保存；
羊水： -20或-70℃保存。 样本前处理 1. 微量血液处理同抗凝血液，不同之处是无需进行红细胞裂解步骤。 2. 干血点加入缓冲液直接进行提取。 3. 羊水/胸水提取时先离心得到沉淀，再进行裂解提取核酸。
样本保存和前处理－口拭子/漱口水
3. 虽然得到的是白膜层，但是会有少量红细胞存在，所以红细胞裂解液
还是必要的，但用量减半。 4. 采用白膜层提取核酸时，所用到的提取溶液体积需按照全血体积进行 操作。即：1ml全血得到的白膜层提取时需要加入提取1ml全血的试剂量。
样本保存和前处理－血清/血浆
保存 现在很多科研者使用血清/血浆提取游离核酸进行研究，例如：肿瘤研究。