医学微生物学：病毒感染的检查方法与防治原则

病毒在细胞内增殖的指征
细胞病变（CPE)
血细胞吸附
特异性抗体鉴定
病毒干扰
培养液代谢改变等
病毒在细胞内增殖的指征
（1）细胞的变化—CPE
① 细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等。 ② 多核巨细胞(融合细胞) ③ 有些病毒 (如狂犬病病毒、麻疹病毒等) 可在培养
细胞中形成胞浆和/或核内的包涵体。
（1）CPE
❖ 一种病毒感染细胞后可以干扰其后感染的另 一病毒在该细胞的增殖，这种现象叫干扰现 象。
❖ 如：风疹病毒感染Vero细胞时CPE不明显，但 它能干扰随后感染的埃可病毒 (ECHOV) 的增 殖，从而阻抑后者所特有的CPE。
❖ 少用
（4）细胞代谢的改变
❖ 培养液的pH值改变
（二）病毒的鉴定
1.病毒形态学鉴定：电镜 2.病毒血清学鉴定：用已知病毒抗体检测 3.病毒分子生物学鉴定：检测病毒基因或成分
（三）病毒数量和感染性测定
1、TCID50(50% tissue culture infectious dose）
系列稀释的病毒液感染细胞后，引起 50% （半数）组织细胞发生死亡或病变的最高病毒 稀释度。
以CPE作为观察指标，判断病毒的感染力与毒力。
流感病毒血凝试验操作方法
病毒液最终 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 稀释度
病毒增殖的表现
原代细胞培养(primary cell culture)
❖ 概念：来源于人胚胎、动物、鸡胚等组织细胞称为原代 细胞株。
❖ 制备：用胰蛋白酶将人胚（或动物胚、鸡胚）组织分散 成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1--2天后逐渐在培 养瓶壁长成单层细胞。接种病毒后进行培养即原代细胞 培养。
病毒在细胞内增殖的指征
正常细胞
病变细胞
CPE：①细胞变圆、聚集、皱缩、溶解或脱落
CPE:②麻疹病毒感染形成多核巨细胞
CPE:③形成包涵体（Negri body—细胞质内）
CPE:③巨细胞病毒包涵体(细胞核、质中均存在）
病毒在细胞内增殖的指征 (2)红细胞吸附
（3)干扰现象(interference)
二倍体细胞培养(diploid cell culture )
❖ 概念：原代细胞只能传2--3代细胞就退化，在多数原代细 胞衰老退化时，少数细胞能继续活下来，且保持染色体数 为二倍体，称为二倍体细胞株。
❖ 特点：二倍体细胞生长迅速，并可传50代保持二倍体特征 ，通常是胚胎组织的成纤维细胞（如WI-38细胞系）。
❖ 选择敏感动物及适宜接种部位,如： 狂犬病毒可接种于小鼠脑内 痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。
2.鸡胚培养
❖ 一般采用孵化9--14天的鸡胚
❖ 最常用的鸡胚接种部位有
尿囊腔接种
可用鸡胚培养的病毒种类：
绒毛尿囊膜接种:痘类V（含天花 V） 、疱疹V
尿囊腔接种：流感V、腮腺炎V 羊膜腔接种：流感V初次分离 卵黄囊接种: 嗜神经V
血凝效价：出现血凝反应的病毒液最高稀释度
3、蚀（空）斑试验
病毒感染单层细胞后，产生的局限性病灶， 称蚀斑（plaque)，蚀斑是由一个感染性病毒体 复制形成的，或称为蚀斑形成单位(plaque forming unit, PFU)，病毒悬液中的感染性病毒 量以PFU/ml来表示。
病毒1:10稀释
❖ 保存：二倍体细胞一经建立，应尽早将细胞悬浮于10%二 甲基亚砜中，大量分装安瓿贮存于液氮（-196℃）内，作 为“种子”，供以后传代用。
❖ 作用：目前多用二倍体细胞系制备病毒疫苗，也用于病毒 的实验室诊断工作。
传代细胞培养 (continous cell culture)
❖ 概念：由癌细胞或二倍体细胞突变而来，染色体数为非 整倍体，细胞生长迅速，可无限传代的细胞称传代细胞 株，在液氮中能长期保存。
流感病毒 尿 囊 腔 接 种
流感病毒 羊 膜 腔 接 种
鸡胚接种
尿液 鸡胚尿液+红细胞 血凝
羊水
血凝及血凝抑制试验 鉴定病毒
鸡胚羊水+特异抗体+RBC 血凝被抑制
3.细胞培养（最常用） •单层细胞培养
•悬浮细胞培养
标本
原代细胞 二倍体细胞株
传代细胞系
细胞病变（CPE) 血细胞吸附 特异性抗体鉴定 pH值改变等
❖ 种类：常用的传代细胞有HeLa（宫颈癌）细胞、KB（口 腔癌）细胞、HEp-2（喉癌）细胞、Vero（非洲绿猴肾） 细胞等。
❖ 特点及作用：由于传代细胞系能有规律地持续传代，容
易保存（-70℃~-196℃）且对某些病毒易感，因此，在
诊断、科研等非疫苗生产的项目中常被采用。目前广泛 用于病毒的实验室诊断工作，根据病毒对细胞的亲嗜性 ，选择敏感的细胞系使用传代细胞系
❖ 标本类型？ 与细菌标本类似 ❖ 好的标本？ 正常无菌性体液 ❖ 标本内容物一般需要含有宿主细胞
二、病毒的分离培养与鉴定
病毒的实验室诊断方法
动物接种
病 毒
鸡胚培养
分离培养方法（金标准）
检 细胞培 养 测 病毒成分检测
活细胞
血清学诊断
（一）病毒的分离培养
1.动物接种
❖ 最原始的病毒培养方法 多用于没有敏感细胞进行细胞培养的病毒 （乙肝、丙肝、丁肝、戊肝病毒等）
病毒感染的检查方法与 防治原则
第一节 病毒感染的检查方法
一、标本采集与送检
原则：与细菌类似 •用于分离培养的标本： 采取采取急性期标本、使用抗生素处 理防细菌污染
无菌操作、低温保存、尽快送检
•血清学诊断的标本： 双份血清？
早期采集
标本的采ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ和送检六原则
无菌采集 采集合适的标本
采集双份血清
尽快送检 正确标记
❖ 特点及作用：原代细胞均为正常二倍体细胞，但不能持 续传代培养，对病毒的敏感性高，可用于生产病毒疫苗 。如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫 苗，猴肾细胞生产脊髓灰质炎疫苗。因原代细胞不能持 续传代培养，故不便用于诊断工作。
贴壁生长的单层细胞 细胞培养瓶
❖ 二倍体：
凡是由受精卵发育而来，且体细胞中含有 父本和母本两个染色体组的生物个体。其体 细胞即二倍体细胞。
病毒1:100稀释
病毒1:1000稀释
中性红染色：活细胞呈红色，受病毒感染破坏的细胞不着色
三、病毒感染的诊断
1.病毒形态学检查 2.病毒成分（病毒蛋白和核酸）检查 3.病毒感染的血清学（病毒抗体）检查