western blot操作技巧及常见问题分析

Western Blot 操作技巧及常见问题分析
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你的Western Blot结果是否出现过非特异性条带？条带变窄变宽了？条带哭了条带笑了？信号太弱了？等情况，所以现在需要提升一下你的Western Blot结果的颜值了！
如何使电泳条带漂亮些？
电泳注意事项
●为减少小蛋白条带的扩散，上样后应尽快开始电泳
●如用预染Marker，当要分辨的蛋白到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，结束电泳
●电泳用恒压模式能保持蛋白质恒定的电泳迁移率，而电压先低后高可使样品更好的进入凝胶。

实际电压可根据时间安排调节，电压高时电泳发热大，电压低于50V时小蛋白容易弥散，凝胶分辨率会下降。

影响跑胶的质量，有以下因素：
●胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。

倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，水或饱和正丁醇隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释下层的分离胶，使胶不均匀。

●聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。

建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。

●电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。

电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。

●样品，在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素，可以克服由于样品溶解不佳引起的
纹理和拖尾现象。

●减少上样量可以避免由于加样量太多引起蛋白带过宽或与邻近泳道的蛋白带相连。

WB常见问题分析
高背景
原因解决办法
蛋白浓度过高降低抗体浓度
膜的污染
使用干净镊子；戴手套操作；换一张新膜用足够的液体，膜始终保持湿
润；孵育时使用脱色摇床；避免膜重叠，互相覆盖；小心操作，勿毁损
膜
漂洗不完全增加漂洗时间和缓冲液体积
封闭液不适合比较尝试不同封闭液
封闭不完全延长封闭时间（可4℃过夜）
抗体浓度过高优化降低一抗、二抗浓度
曝光时间过长缩短曝光时间
缓冲液污染使用新配制缓冲液
信号弱或无信号
原因解决办法
抗原量不足增加上样量，使用阳性对照；减少漂洗，可将TBST改为TBS
蛋白质在储存过程中
降解
重新制备样品
转膜不完全
转膜后确定转膜效率、保证胶与膜充分结合、保证电极正确装配、
控制转膜温度（冰袋降温）、优化转膜电流及时间。

膜的错误选择选择合适膜的孔径：
>22kD 蛋白选用 0.45μm孔径<22kD 蛋白选用0.22μm孔径
抗原被封闭液遮蔽优化封闭液、缩短封闭时间、减小封闭液中蛋白浓度。

抗体增加抗体浓度、注意抗体储存条件（避免反复冻融）。

曝光时间过短延长曝光时间
底物延长底物孵育时间
非特异性条带
原因解决办法
底物太灵敏选择合适的底物
交叉反应选择单克隆抗体
抗原浓度太高降低抗原浓度
抗体浓度太高降低抗体浓度
曝光时间太长减少曝光时间
其他
现象原因解决办法
二抗浓度太高降低二抗浓度
荧光萃灭快
膜干燥保证膜的湿润度
条带内出现不显影圆点转膜过程中有气泡转膜时赶尽气泡
条带不完整底物孵育不均匀用保鲜膜均与孵育底物
反影（白色条带、黑色
HRP浓度过高降低二抗浓度
背景）
散在小圆斑封闭液有杂质颗粒静置牛奶使大颗粒沉淀
● 条带出现微笑的上扬形状，表示胶没有混匀或者电泳时散热不均匀，电压过高，缓冲液浓度过高。

● 垂直条纹，表示上样量过多或者样品有沉淀。

● 条带变窄，说明盐浓度过高，需脱盐; 凝胶不均匀，梳子没拔好。

● 条带变宽，说明电泳前样品扩散，故加样操作要快。

● 两个条带，说明蛋白没有完全还原，或又重新氧化，需配置新鲜缓冲液。