第七章_花药培养和花粉培养

培养温度是影响花药反应的一个重要因素
小麦要求先高温培养64天之后，再转入28～30℃下培养。一 直高温培养效果并不好。 较高的温度虽能诱导较高频率的花粉愈伤组织，但愈伤组织 分化白化苗的频率也高。控制培养温度仍是减少白化苗的一 个有效措施。
3、花药培养过程
花药材料的选取 关键选取处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉 发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的花药，均有可能 诱导离体孤雄发育。 大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单核期， 或单核中晚期。
安徽大学《细胞工程》精品课程 陈勤
花药培养 是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基 上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成 植株的技术。
花粉和花药培养的研究意义
单倍体植株育种
诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期 有利于筛选隐性突变体，提高选择效率 获得无病毒个体 有利于隐性基因控制性状的选择 快速获得自交系的超雄株
单倍体植株的二倍化
花粉植株染色体可自发加倍 人工措施染色体加倍 传统方法是用秋水仙素处理。较大浓度的秋水仙素溶液处理 单倍体植株，时间为24～96 h。
浸泡试管苗方法 处理芽方法 浸根方法
花药培养脱毒
1974年日本：花药培养可以脱除草莓病毒； 花药采取时期 单核期：花蕾4-6mm，花药1mm 花药诱导愈伤组织培养基 MS + IAA4mg/L + BA2mg/L + KT2mg/L +蔗糖30g+琼脂7g/L 增殖培养基 MS + GA1mg/L+ IBA0.2mg/L + BA1mg/L+ 蔗糖 30g + 琼脂7g/L 生根培养基 1/2MS + IBA0.2mg/L + 活性炭3g/L + 蔗糖20g + 琼脂7g/L
花药培养简史
1964年：印度学者古哈(Guha)和马斯瓦瑞 （Maheswari ） 将南洋金花花药培养发育成胚 1967年：包金(Bourgin)和尼奇(Nitsch)花药培养获得烟草植 株 1973年：我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株 目前：许多农作物及经济植物通过花粉培养都能诱导成植 株
3、蔗糖浓度
较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织 较低浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗
三、单倍体植株染色体加倍的方法
单倍体植物天然发生的途径：
孤雌生殖
也称单性生殖，即卵不经过受精也能发育成正常的新个体，如黄瓜
无配子生殖
是指配子体可以不经过配子的结合而直接产生孢子体的，如蕨类植物
孤雄生殖
是指由雄性配子直接进行胚胎发育成新个体。通常由杂交或实验处理 后获得的，自然界中很少发生
第七章
花药培养和花粉培养
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主要内容
花粉和花药培养技术 花粉和花药培养应用
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教学目的与要求
(1) 掌握花药培养和花粉培养的区别 (2) 了解花药最佳接种时期 (3) 掌握花药培养的大致过程 (4) 掌握花粉发育的四种途径 (5) 掌握花粉培养的大致过程
花药培养与单倍体育种
花药培养的主要目的，是培育花粉粒的单倍体植株，并使单倍体加倍， 作为育种材料的来源。 利用杂种花药离体培养获得的再生植株，由不同基因型的配子发育而来， 具有丰富的变异类型，选择出有利的变异类型，经过经济性状鉴定后， 选出优良者直接用于生产或配制杂交组合，获得优良杂交种子。 构建永久性分离群体－双单倍体系（Doubled haploid)，用于基因定位。 双单倍体：是指单倍体细胞（花粉或卵细胞）经过人工或自发加倍后得 到双单倍体细胞，细胞经诱导分化可发育为单双倍体植株。
大大缩短育种周期
通
单
过 多 次 自 交 或 近 交 获 得 的 几 乎 是 同 质 结 合 的 品
水 仙 素 处 理 ） 从 而 使 植 物 恢 复 正 常 染 色 体 数
倍 体 植 株 再 通 过 某 种 手 段 使 染 色 体 组 加 倍 （ 如
系
秋
二、花药培养技术
确定取材时间 选择大致处于所需要时期的花蕾。由于花粉发育时期和植株 的某些外部形态特征之间的大致相关性，因此利用这些外部 标志，选择符合条件的花蕾，经镜检确定花粉发育的准确时 期。 在水稻中，以单核靠边期的花粉对诱导单倍体植株较为适宜， 在外部形态上可根据叶枕距为5～15cm，颖片（禾本科植物 小穗基部，由苞片转变而成）淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片 长度的1/2这些条件来判断。
培养基中的植物生长物质的种类会影响花粉发育的途径
一般在禾本科植物中，常用1～ 5mg/L 2,4-D或NAA诱导花粉愈伤 组织形成，再将愈伤组织转移至 降低或去除生长素或补加细胞分 裂素类物质的分化培养基上，以 诱导器官分化和再生植株形成。
培养基中糖的种类对花粉胚的诱导和分化有显著影响
朱至清等(1990)报道在过滤灭菌的条件下，若以0.21 mg/L葡 萄糖取代液体培养基中同等浓度的蔗糖，小麦花粉胚的诱导 频率可增加2～10倍。 一般说来，高蔗糖浓度可以抑制体细胞的生长而对花粉的生 长无妨碍。 最适蔗糖浓度： ✓ 烟草的为3％ ✓ 水稻为3％～6％ ✓ 玉米则为12％～15％
胚珠
花的结构
一、概 述
花药是花的雄性器官，花药培养属器官培养； 花粉是单倍体细胞，花粉培养与单细胞培养相似 花药和花粉都可以在培养过程中诱导单倍体细胞系和单倍 体植株。 单倍体植株经过染色体加倍就成为纯合二倍体植株，这样 可缩短育种周期，获得纯系。花培已成为植物育种的一种 重要手段。
一、概 述
植物的花粉是花粉母细胞经减数分裂形成的，其染色体数 目只有体细胞的一半，叫做单倍体细胞(haploid cell)。 花粉和花药的培养(pollen and anther culture)是指花粉在培 养基上改变其正常发育和机能，不经受精而发生细胞分裂， 由单个花粉粒发育成完整植株的技术。 用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株，叫 做单倍体植物(haplobiont)。
花药培养的条件
光照(12~18h，5,000~10,000 lx，28℃) 黑暗(12-16h，22℃)周期交替进行。
1、影响花药诱导频率的因素
①花粉发育时期是影响培养效果的重要因素 在诱导花粉进行雄性发育(指小孢子沿孢子体途径发育成花 粉植株)过程中，不同物种花粉最适的发育时期不同，对多 数植物来说，单核中期或晚期的花粉最容易形成花粉胚或花 粉愈伤组织。 如南洋金花、烟草和芍药中的最适时期是第一次有丝分裂时 期或稍前后，禾本科植物在单核早期(大麦)或单核中期(玉米、 小麦)反应最好，番茄在减数分裂中期时更适宜。
黄心乌花药培养
甜椒花药培养
草莓
花药愈伤组织
再生植株 花药植株
杜兰小麦的花药培养
A 花药在BAD-3诱导下，3周 后形成胚状体和愈伤组织 B 另一个花药在BAC-1培养基 中已愈伤组织中长出叶片 C 更多的花药在BAD-3培养基 上诱导出愈伤组织与子叶 D 从BAC-1转移到BAD-1分化 培养基中形成的愈伤组织 E 在MS培养基中培养5-6周， 愈伤组织开始分化根和绿色的 新芽 F 在MS培养基中培养7-8周， 可形成大量的根和幼茎 G 在MS再生培养基中培养8周 后，可由最初的花药形成小植 株 H 由花药形成的健壮小植株 I 花药形成的植株在同样的MS 再生培养基中生长，可因培养 条件改变而形成不正常的植株
水稻花药培养
旗叶鞘用70％酒精擦洗一遍Baidu Nhomakorabea
剥去旗叶鞘，取出稻穗
左手持穗，右手用镊子取出花药，无菌培养皿中
70％酒精，洗2遍 用接种环接种到培养基上 培养5天后，花药变黑褐色，20天花药裂开，长出淡黄色 的花粉愈伤组织，先形成芽，后长出根，形成幼苗。
注意事项
选取主穗（一级侧枝）的 花蕾，因为一级侧枝的花 蕾发育良好，数量大，发 育同步。 操作过程中不应使花药受 到损伤，若受损伤，则应 淘汰，因为损伤常常会刺 激花粉壁形成二倍体的愈 伤组织。
在培养基中加入活性炭能促进花药培养
水 稻 的 柱 头 花 药
-
2、 低温预处理可以提高花粉胚的诱导频率
以1～5℃预低温处理小麦幼穗，能提高花粉愈伤组织的 产量。 例如，在4℃下冷冻石刁柏花蕾，预处理4天、8天和12 天，愈伤组织诱导率比室温对照分别提高2.4倍、1.9和 1.5倍。 各种植物要求预处理的温度和时间不同。
② 花药供体植株的生长条件对花药培养反应的影响 很大 例如：水稻、小麦、大麦等禾本科植物，主茎穗比 分蘖穗花药愈伤组织的诱导率明显地提高，同步化 程度高。
③ 培养基是花药培养中影响花粉启动和再分化的重要条件 我国科学工作者对水稻、小麦的花药培养基做了改进，研制 出N6培养基。在N6培养基上，水稻花粉的出愈率大幅度提 高。 N6培养基的特点是铵离子浓度较低。 随后，进一步降低铵盐和硝酸盐浓度，同时附加生物素，研 制出C17和W14培养基，它们可以大幅度提高小麦的花药出 愈率。 以马铃薯提取液为基本成分的马铃薯培养液，现在被广泛地 应用于小麦花药培养，效果良好。
毛曼陀罗花药培养，并诱发再生植株
三、花粉培养
花粉培养成苗途径与花药培养比较: 相同点： 胚状体成苗途径、愈伤组织再分化成苗途径 不同点： 花粉培养： 需进行花粉的分离 特殊的花粉诱导培养
一、花粉培养的操作过程
低
温 预 处
消 毒
理
选幼年玉兰树花蕾
取下花蕾（镜检）
取花药
预培养数天
分离 花粉
药壁向花粉提供营养物质
单倍体植株染色体加倍的方法
1、自然加倍 2、人工加倍：用秋水仙素溶液浸苗、处理愈伤组 织和用含0.4%秋水仙素的羊毛脂涂抹单倍体植株 的顶芽、腋芽，可得到能结实的二倍体植株。 3、愈伤组织反复继代培养，可得到二倍体植株。
小结
①花药培养是器官培养，花粉培养属细胞培养。 ②花药培养一般选择花粉的单核期进行接种。 ③花药培养包括：选择材料、消毒、接种培养、愈合组 织生成、分化出单倍体植株。 ④花粉的发育途径包括：营养细胞发育、生殖细胞发育、 营养和生殖细胞同时发育及花粉均等分裂发育。 ⑤花粉培养包括花粉的分离、预处理、培养过程。
思考题
花药培养的研究意义 花药培养方法
谢谢观看!
过滤离心
通过药壁吸收、贮存和转化培养基中的外源物质
接种 再生
二、培养基
1. 基本培养基 2. 激素种类和浓度 3. 蔗糖浓度
1、基本培养基
MS和H培养基：适合双子叶植物花药培养 B5培养基：适合豆科和十字花科花药培养 N6培养基：适合禾谷类作物的花药培养
2、激素种类和浓度
细胞分裂素可促进胚状体形成 生长素可诱导愈伤组织形成 细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分 化苗