第七章_花药培养和花粉培养
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花药和花粉培养课件
数据分析
数据整理、统计、分析、解释
处理方法
数据清洗、数据挖掘、可视化呈现
06 相关法律法规与伦理问题
法律法规要求与遵守
法律法规要求
在进行花药和花粉培养实验时，必须遵 守国家和地方的相关法律法规，确保实 验活动的合法性。
VS
遵守要求
遵守实验室安全规定，确保实验操作符合 相关法规要求，避免任何违反法律法规的 行为。
气体控制 控制培养环境中的气体成分，如CO2浓度等，以 优化生长条件。
培养过程中的注意事项
防止污染
严格控制无菌条件，定期检查培 养基和培养环境是否有微生物污染。
观察与记录
定期观察花药和花粉的生长情况， 记录生长数据，以便及时调整培养 条件。
花药和花粉的保存
对于需要长期保存的花药和花粉， 应选择适宜的保存方法和条件。
应用领域拓展
花药和花粉培养技术的应用范围将进一步 拓展，不仅局限于育种领域，还可应用于
生物制药、生物能源等领域。
遗传稳定性研究
将深入研究遗传稳定性问题，寻求解决染 色体变异的有效方法，获得遗传一致的纯 种。
政策支持
随着科技的不断进步和社会对生物技术的 关注度提高，政府将出台更多政策支持花 药和花粉培养技术的发展和应用。
基因工程研究
花药和花粉培养产生的单倍体植株可用于基因工程研究，如 基因敲除、基因沉默等，以深入了解基因功能和植物生长发 育机制。
药物筛选
利用花药和花粉培养技术产生的单倍体细胞系可用于药物筛 选，如抗病、抗虫、抗除草剂等，为新药研发提供有力支持。
实际应用案例分析
水稻育种
通过花药和花粉培养技术，成功获得了大量单倍体植株，经过筛选得到了抗病、 抗虫、高产等优良性状的水稻新品种，为我国水稻生产提供了有力支持。
数据整理、统计、分析、解释
处理方法
数据清洗、数据挖掘、可视化呈现
06 相关法律法规与伦理问题
法律法规要求与遵守
法律法规要求
在进行花药和花粉培养实验时，必须遵 守国家和地方的相关法律法规，确保实 验活动的合法性。
VS
遵守要求
遵守实验室安全规定，确保实验操作符合 相关法规要求，避免任何违反法律法规的 行为。
气体控制 控制培养环境中的气体成分，如CO2浓度等，以 优化生长条件。
培养过程中的注意事项
防止污染
严格控制无菌条件，定期检查培 养基和培养环境是否有微生物污染。
观察与记录
定期观察花药和花粉的生长情况， 记录生长数据，以便及时调整培养 条件。
花药和花粉的保存
对于需要长期保存的花药和花粉， 应选择适宜的保存方法和条件。
应用领域拓展
花药和花粉培养技术的应用范围将进一步 拓展，不仅局限于育种领域，还可应用于
生物制药、生物能源等领域。
遗传稳定性研究
将深入研究遗传稳定性问题，寻求解决染 色体变异的有效方法，获得遗传一致的纯 种。
政策支持
随着科技的不断进步和社会对生物技术的 关注度提高，政府将出台更多政策支持花 药和花粉培养技术的发展和应用。
基因工程研究
花药和花粉培养产生的单倍体植株可用于基因工程研究，如 基因敲除、基因沉默等，以深入了解基因功能和植物生长发 育机制。
药物筛选
利用花药和花粉培养技术产生的单倍体细胞系可用于药物筛 选，如抗病、抗虫、抗除草剂等，为新药研发提供有力支持。
实际应用案例分析
水稻育种
通过花药和花粉培养技术，成功获得了大量单倍体植株，经过筛选得到了抗病、 抗虫、高产等优良性状的水稻新品种，为我国水稻生产提供了有力支持。
《花药和花粉培养》word版参考模板
第八章花药和花粉培养植物的花粉是花粉母细胞经减数分裂形成的，其染色体数目只有体细胞的一半，叫做单倍体细胞。
用离体培养花药的方法，使其中的花粉发育成一个完整的植株，叫做单倍体植株。
利用雄蕊的花药离体培养获得的再生植株，是由不同基因型的配子发育而来，具有十分丰富的变异类型，选择出有利的变异类型，利用茎尖培养扩大繁殖，经过经济性状鉴定后，选出优良者配制杂交组合，可获得优良杂交种子。
目前，花药培养这一细胞工程技术已经成为植物育种和种子生产的重要手段，我国在花药培养和单倍体育种工作上，一直处于国际先进水平。
利用单倍体植株进行育种好处表现在“快”，能比常规的杂交育种方法缩短育种周期。
以芦笋为例，利用雄性雌性株（Mm）培育纯系，需连续自交6代，而通过花药培养的方法，可以节省6代自交时间，大大缩短育种年限，一般杂交育种要8～10年才能得到稳定后代，而花药培养只需要2年时间。
另外，花药单倍体育种法的育种程序比常规杂交育种的程序要简化。
第一节花药与花粉培养的意义一、花培概况在60年代中期印度德里大学的两位植物学家古哈（Guha）和马赫施瓦里（Maheshwari）偶然发现，他们培养的毛叶曼陀罗花药中长出的胚状体是来源于花粉的单倍体植株。
从此以后，很快引起了各国遗传育种工作者的重视。
接着有人在烟草和水稻上相继进行了离体培养花药的试验，并得到了单倍体花粉植株。
据不完全统计，现在已有250多种植物获得了单倍体植株。
我国自“六五”首次育成花药培养小麦新品种京花1号在育种史上取得重大突破以来，已育出小麦品种10多个，水稻品种20多个，还有玉米、油菜、烟草、果树、蔬菜等作物新品种，总计种植面积已达数200多万公顷，已成为世界上花药和花粉培养品种应用最广的国家。
纵观10多年，与其它高新技术相比，花药和花粉培养育种育出的新品种（品系）最多，成果应用最广，取得的社会经济效益最大，而资金的投入最少。
事实证明，这是一条经济、有效、快速的育种途径。
(第七章)第八章植物花药(花粉)培养
第四节
花药培养
（2）材料生理状态 花药供体植株的生理状态，对花粉愈伤组织的诱导 率有直接影响。 对水稻、小麦和大麦等禾本科植物而言，大田植株 比温室植株、主茎穗比分蘖穗花粉愈伤组织的诱导率都 明显的要高。不同季节接种的花药愈伤组织诱导率也有 显著变化，例如：水稻，早造比晚造接种的愈伤组织诱 导率要高；烟草，开花早期比开花晚期的花药可产生更 多的花粉植株；小麦，早期接种比晚期接种的材料愈伤 组织诱导率可提高2～3倍。说明供体植株的生态环境， 特别是温度和光周期可能对花粉发育及其对离体培养的 反应有重要影响。
第二节
花药和小孢子的发育
（以烟草花粉发育过程为例，说明被子植物花粉发 育过程，P222） 第一期：小孢子母细胞经减数分裂形成孢子四 分体，随胼胝质分解，4个小孢子分离。 第二期：小孢子为球形细胞，核大，有液泡， 挤核靠边（单核靠边期），期末细胞明显增大，细 胞壁特化，小孢子进行第一次花粉细胞有丝分裂 （不对称），形成2个不均等的细胞。 第三期：小孢子细胞中有2个核。 在离体培养条件下，花粉发育偏离正常发育途 径，第一次花粉细胞有丝分裂是对称的，结果形成 两个形态和体积相等的细胞，把此作为B型。
第四节
花药培养
2、材料预处理 对所取用的穗子或花蕾，进行低温、激素（生长 素）或其他方法预处理，能有效提高愈伤组织诱导 率和苗分化率。 （1）低温预处理： 一般是将材料置于冰箱5～10℃下冷藏一定时 间再接种。处理时间视不同植物而定，水稻在5～ 10℃时为5～8天，烟草在7～9℃时为7～14天。 同种植物不同品种的要求也有差异，需作试验比较 才能确定。
第四节
花药培养
3、材料灭菌： 取回的材料，在接种前必须进行表面灭菌。一 般方法是先用70～75%酒精擦洗穗子和花蕾的外 部苞叶，然后用0.1%升汞浸泡7～10分钟（水稻、 玉米等需剥取穗子浸入消毒液）或用饱和漂白粉溶 液浸泡10～20分钟以灭菌，最后用无菌水冲洗3～ 5次，供接种用。 材料灭菌是花药培养成功与否的一个重要环节， 此关不过，谈不上什么培养。
教学目的：掌握花药培养和花粉培养技术，掌握花药和花粉培养在单倍
教学目的：掌握花药培养和花粉培养技术，掌握花药和花粉培养在单倍体育种中的重要应用，了解我国单倍体育种成就。
职业教学技能点：具有进行花药培养和花粉培养的基本能力，具有单倍体育种认知，初步具备查阅资料收集信息基础能力。
教学时间：4学时教学重点：花药培养方法，花粉培养方法，单倍体育种上应用教学难点：花药培养与花粉培养的取材时期，单倍体植物缩短育种年限教学内容：第一节花药培养和花粉培养技术一、概念1．概念花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。
花粉培养的精确定义是：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养。
有时花粉培养也称为小孢子培养(microspore culture)。
从培养方法和技术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。
二、花药培养首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者Guha、Maheshwari (1964, 1966)。
目前已有250多种植物花药培养成功。
目前，花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。
花药培养可诱导花粉发育形成单倍体，快速获得纯系；缩短育种周期，利于隐性突变体筛选、提高选择效率；与二倍体融合成体-配杂种。
花药培养的基本程序是：外植体选择－外植体(花蕾)预处理—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培养（一）花药培养方法1、材料的选取：大多数植物的花药培养，成功率最高的是单核期或单核中晚期。
花粉发育时期的检测一般将植物的花药置于载玻片上压碎，加醋酸洋红1～2滴染色，再进行镜检以确定花粉发育时期。
水稻等植物的花粉，处于单核期时尚未积累淀粉，在进入三核期后的花粉开始积累淀粉，因此可用碘—碘化钾染色鉴定。
花粉发育时期与花蕾或幼穗大小、颜色等特征之间有一定的对应关系。
花药培养的成功与供试材料的遗传背景、供试材料的生理状态、花粉的发育时期有关。
花粉发育时期图示如下：四分体—小孢子—单核花粉—双核花粉最适期2、材料与处理与灭菌3-5℃低温处理3-10天-（大花蕾将萼片剥掉）-酒精几秒-0.1%升汞10min-无菌水冲洗。
植物的花药与花粉培养
粉胚状体，最终分化为植株。 ② 液体培养: 悬浮培养，通气性差。 ③ 双层培养：上-液体+下-固体 ④ 看护培养：花粉-滤纸-固体培养基
医学ppt
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⑤ 条件培养基：在花药培养基中加入失活的花药提取物。
采用看护培养法： 无菌条件下，将花药接种在固体培 养基上→在每个花药上覆盖一小块圆片滤纸 →用移液管吸 取l滴 每毫升含10个花粉粒的悬浮液接种在滤纸中央→形成 胚状体→分化为单倍体植株。
医学ppt
13
2、花粉培养 从花药中游离出花粉粒，通过培养使花粉粒脱分化启动发 育为单倍体植株的技术。
特点: 它可以避免花药壁、药隔及花丝等体细胞愈伤组织 的干扰，可以获得大量的花粉植株。
1）花粉的分离与纯化： 分离法：自然散落法、挤压法、机械游离法（磁力搅拌） 纯化：用不同孔径的无菌筛子除杂。
2）花粉培养的方式： ① 平板培养：花粉在固体培养基中进行培养，使其形成花
培养花药之前，需要制片镜检，确定花粉发育时期。进 行细胞学花粉发育时期的镜检。
医学ppt
11
2 材料处理对花粉培养的影响
（1）低温度处理： Nitsch（1973）发现低温处理可以明显提高花 粉胚的诱导率，3℃下保存48h，然后花药接种，花粉胚的诱导率提高 了33.6%。低温处理对农作物花药培养同样有效。烟草花药7～9℃下 7～14d为宜；水稻处理10℃、48h；小麦和黑麦需在1～3℃下2～20d 得到良好效果。
4、分化：愈伤组织1-2毫米时，转入分化培养基中， N6+2NAA（0.5mg/L）+KT(0.5mg/L)+蔗糖3%，温度 25℃，光照10h/d.
5、移栽：2周后，出根、芽。当花粉植株长到2-3个真叶时， 可转入1/2MS培养基中。低温医弱学pp光t 下练苗后可移栽于大田或18
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⑤ 条件培养基：在花药培养基中加入失活的花药提取物。
采用看护培养法： 无菌条件下，将花药接种在固体培 养基上→在每个花药上覆盖一小块圆片滤纸 →用移液管吸 取l滴 每毫升含10个花粉粒的悬浮液接种在滤纸中央→形成 胚状体→分化为单倍体植株。
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2、花粉培养 从花药中游离出花粉粒，通过培养使花粉粒脱分化启动发 育为单倍体植株的技术。
特点: 它可以避免花药壁、药隔及花丝等体细胞愈伤组织 的干扰，可以获得大量的花粉植株。
1）花粉的分离与纯化： 分离法：自然散落法、挤压法、机械游离法（磁力搅拌） 纯化：用不同孔径的无菌筛子除杂。
2）花粉培养的方式： ① 平板培养：花粉在固体培养基中进行培养，使其形成花
培养花药之前，需要制片镜检，确定花粉发育时期。进 行细胞学花粉发育时期的镜检。
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2 材料处理对花粉培养的影响
（1）低温度处理： Nitsch（1973）发现低温处理可以明显提高花 粉胚的诱导率，3℃下保存48h，然后花药接种，花粉胚的诱导率提高 了33.6%。低温处理对农作物花药培养同样有效。烟草花药7～9℃下 7～14d为宜；水稻处理10℃、48h；小麦和黑麦需在1～3℃下2～20d 得到良好效果。
4、分化：愈伤组织1-2毫米时，转入分化培养基中， N6+2NAA（0.5mg/L）+KT(0.5mg/L)+蔗糖3%，温度 25℃，光照10h/d.
5、移栽：2周后，出根、芽。当花粉植株长到2-3个真叶时， 可转入1/2MS培养基中。低温医弱学pp光t 下练苗后可移栽于大田或18
花药和花粉培养课件
如何选择适宜的植物材料进行花药和花粉培养？
答：选择适宜的植物材料是进行花药和花粉培养的关键，通常选择处 于适宜发育阶段的花蕾，以保证花药和花粉的质量和活性。
如何对植物材料进行预处理？
答：预处理包括对植物材料的低温、干燥、激素处理等，以促进花药 和花粉的萌发。
应用问题及解答
花药和花粉培养在育种中的应用有哪 些？
。
04
实验结果与分析
根据观察和记录的数据，分析 花药和花粉在培养基上的生长
情况。
比较不同植物的花药和花粉在 相同培养基上的生长表现，分
析其适应性。
根据实验结果，评估花药和花 粉培养在植物繁殖和育种中的 应用价值。
结合实验结果，提出改进和完 善花药和花粉培养技术的建议 。
06
问题与解答
常见问题及解答
调整培养基的pH值和渗透压，以 维持花药和花粉的正常生理状态 。
花药和花粉的采集与处理
采集时间
选择适宜的采集时间，以保证花药和花粉的活 力。
采集部位
选择健康的花朵，并确保采集的花药和花粉无 病虫害。
花药和花粉的分离与处理
将花药和花粉从花朵上分离下来，并进行适当的消毒处理。
培养方法与条件
培养方法
根据具体情况选择合适的培养方法，如单倍体育 种、基因转移等。
环境因素影响
温度、湿度、光照等因素可能影响 培养效果。
04
未来的发展方向
优化培养条件
通过研究，不断优化花药和花粉培养的条件 ，提高成功率。
基因编辑技术的应用
利用基因编辑技术，定向改造花药和花粉的 遗传性状。
高通量分析方法
开发高通量分析方法，实现大规模的花药和 花粉培养。
拓展应用领域
第七章——花药和花粉组织培养
预处理方法：
• 1.高低温处理 • 低温预处理：指在接种之前将材料用0℃以上低温处理一段时
间后再接种。 • 应用较多。处理温度一般在1-14℃，时间从几小时至几十天不
等；不同作物所用的预处理温度及时间差异较大；不同的处理 温度需要不同的时间。
• 例子: • 小麦穗子培养前4℃预处理几天，花药培养效率显著提高。 • 十字花科未经低温预处理的花蕾，每花药产胚数为4.39个，6-
小孢子分裂数次形成愈伤组织，愈伤组织再分化形成花粉植株。此途 径产生的植株会出现变异且倍性复杂。
三、花粉植株形态发生方式
• 体细胞胚：植物组织培养过程中，某些体细胞在形态上转变为 与合子发育成的胚（具胚根、胚芽、胚轴等结构）非常相似的 结构，称作体细胞胚或胚状体。
• 花粉胚：植物组织培养过程中，某些单倍体性细胞在形态上转 变为与合子发育成的胚非常相似的结构，称作花粉胚或胚状体。
第七章 花药和花粉培养
植物花药和花粉培养的概念
• 花药：植物花的雄性器官，包括二倍性的组织和单倍性的雄性 性细胞。药壁和药隔组织 （2n）；花粉粒 （n）。
植物花药和花粉培养的概念
• 花粉：由花粉母细胞经过减数分裂形成的单倍体的生殖细胞。
花粉粒的形成
花药和花粉培养
• 花药和花粉培养指在合成培养基上，改变花粉的正常发育途径， 使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化、最终发育 成完整植株。
移栽驯化
• 同组培快繁。
白化苗现象
白化苗产生的原因及机理
1.白化苗产生的原因： 内因：供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时期。 外因：预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法、愈伤组 织转分化时间等。 2.白化苗产生的机理 核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生白苗。另外，无性系变异也 可能是原因之一。
花药和花粉的离体培养
植物所与山东烟草研 究所合 作 ， 成功 培育成 烟草新 品 种并大面积推广 ， 这是 世界上 第 一个 用单倍体 育种 方
株都是单倍 体。 花粉培养 比花 药培 养难 度 大 。在 诱 导 培养 过 程 中， 因激素等条件 的不同 ， 使花粉植株 的形成有 两条途 径： 一是 由小孢 子的异 常发 育形 成 花粉 胚 （ 胚状 体 ） ， 再 由花粉胚循着与合 子胚相 似 的发 育顺 序发育 ， 长成
性性细胞 。
伤组织进一步器官 分化 ， 成芽、 ， 后形 成完 整植 形 根 最
株。
花药和花粉 离体培 养的特点见表 １ 。 花药 内 的花粉 母细胞 （ ｎ 经减数 分裂产 ２）
表 １ 比较 花药和花粉 的离体培 养 花药培养 培养对象 花药 操作水平 器 官培养 难 易程度 较 困难 花粉培养 花粉 细胞培养 较花药培养难度更大
育种的必要措施。培养过程 中不 同发育 阶段 的单倍体
细胞可 以 自发加倍 ， 自然加倍率很低 ， 但 多数情况需 人
工加倍 。人工加倍 多用化 学诱变 法 ， 常用 的诱 变剂 有
秋水仙素 、 对二氯苯 、 氟乐灵等。加倍处 理时需注意的
植体选 择（ 以其 中的花粉 处于单 核中 、 晚期为 宜） 一预
是， 秋水仙 素 同 时也 是一 种诱 变 剂 ， 易使 细胞 多倍 容
化 。因此 ， 对处理 的植 株要 经过一 到几 个生 活 周期 的 营养价值 高的雄株 ， 可通过 花药 或花粉 的离体 培养方
选择 ， 能得到正常纯 合加倍 植株。 才 ４ ２ 单倍 性的意义 单倍体植株 高度不育 ， ． 从植物 体 生产繁 殖角度看 ， 意义不 大 ， 但在 遗传 研究 ， 速育 种 加
花药培养
二、花粉和花药培应用
迅速获得纯合型材料，缩短育种年限 迅速获得纯合型材料，缩短育种年限GO 获得育种中间材料 与诱变育种相结合可以提高诱变频率 与细胞融合相结合， 与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有 实际应用意义 作为遗传工程受体更为有效 用作基础遗传研究的各个领域
大大缩短育种周期。 大大缩短育种周期。
2.花药供体植株的生长条件 花药供体植株的生长条件
水稻、小麦、大麦等禾本科植物， 水稻、小麦、大麦等禾本科植物，主茎穗 比分蘖穗花药愈伤组织的诱导率明显地提 高。 同步化程度高。 同步化程度高。
3.培养基 培养基
① 我国科学工作者对水稻、小麦的花药培养基做了改 进，研制出N6培养基。在N6培养基上，水稻花粉的 出愈率大幅度提高。N6培养基的特点是铵离子浓度 较低 ② 随后，进一步降低铵盐和硝酸盐浓度，同时附加生 物素，研制出C17和W14培养基，它们可以大幅度提 高小麦的花药出愈率。 ③ 多采用液体培养基
7.单倍体植株的二倍化 7.单倍体植株的二倍化
花粉植株染色体可自发加倍 人工措施染色体加倍。 人工措施染色体加倍。 传统方法是用秋水仙素处理。 传统方法是用秋水仙素处理。较大浓度的秋水 仙素溶液处理单倍体植株，时间为24 24仙素溶液处理单倍体植株，时间为24-96 h。 方法：浸泡试管苗方法、处理芽方法、 方法：浸泡试管苗方法、处理芽方法、浸根 方法
4.糖的种类 糖的种类
朱至清等(1990)报道在过滤灭菌的条 报道在过滤灭菌的条 朱至清等 件下，若以 件下，若以0.21 mg/L葡萄糖取代液体培 葡萄糖取代液体培 养基中同等浓度的蔗糖， 养基中同等浓度的蔗糖，小麦花粉胚的诱 导频率可增加2-10倍。 倍 导频率可增加
5.低温预处理 低温预处理
花粉与花药的培养
湿度调节
保持培养环境适宜的湿度，防 止培养基干燥或过于潮湿影响
花粉的生长。
培养方法
将处理好的花粉均匀撒在培养 基表面，然后进行密封培养， 定期观察并记录生长情况。
生长过程观察与记录
生长情况观察
定期观察花粉的萌发、生 长情况，包括萌发率、生 长速度、生长形态等指标。
数据记录与分析
详细记录观察结果，对数 据进行统计分析，了解花 粉生长的规律及影响因素。
湿度对培养的影响及优化策略
湿度对花粉萌发的影响
01
适宜的湿度可以促进花粉萌发，过高或过低的湿度则会抑制花
粉萌发。
湿度对花药开裂的影响
02
适宜的湿度可以促进花药开裂，释放花粉，但过高的湿度也会
导致花粉失活。
优化策略
03
根据植物种类和生长环境，调整培养湿度，使其处于适宜花粉
萌发和花药开裂的范围内。
其他因素对培养的影响及优化策略
生长异常处理
如发现花粉生长异常或污 染等情况，及时进行处理 并调整培养条件，以保证 实验的顺利进行。
03
花药培养
花药来源与选择
适宜的花药来源
选择健康、无病虫害的植物作为 花药来源，确保花药的遗传品质 和生理活性。
花药的选择时期
在植物生长的适宜时期采集花药 ，通常是花朵刚开放或即将开放 时，此时花药内的花粉发育成熟 ，易于培养。
培养基的配制
按照一定比例将各种成分混合均 匀，调节pH值至适宜范围，然后 进行灭菌处理。
培养条件与方法
01
02
03
04
温度控制
保持适宜的培养温度，一般为 25℃左右，避免过高或过低的 温度对花粉生长产生不良影响。
光照条件
花药和花粉培养
（一）供试材料
1.材料的基因型 材料的基因型
材料的遗传背景不同， 材料的遗传背景不同，诱导难易程度不同
茄科番茄、蔓陀罗、烟草易成功 茄科番茄、蔓陀罗、 禾本科 水稻优于小麦
亚种 水稻粳亚种(40-80%)优于籼米亚种 优于籼米亚种(2%) 水稻粳亚种 优于籼米亚种
花药培养力是可以遗传的， 花药培养力是可以遗传的，且为显性或超 显性
花粉悬浮在液体培养基中进行培养 置于摇床上震荡，使其处于良好的通气 置于摇床上震荡， 状态
4.花药培养 花药培养
（1）培养方法 ）
琼脂固体培养法
培养基中加入0.5-0.7%琼脂，呈半固体状 琼脂， 培养基中加入 琼脂 花药1/3浸入培养基中而不沉没为宜 态，花药 浸入培养基中而不沉没为宜
液体培养法
2.植株的生理状态和年龄 植株的生理状态和年龄
年幼植株花培成功率高 开花始期成功率高
烟草开花始期时花药比开花后期的更易产生花 粉植株 烟草开花期第6天，诱导率最高
与植株的营养和生长条件有关
N饥饿>高N 水稻高温，高N下，诱导率下降，白化苗提高
3.花粉发育时期 花粉发育时期
是影响花培成败的最关键因素之一
我国花培发展概况
国际公认， 国际公认，我国的花培工作处于国际领先水 我国有30多种植物进行花培试验 多种植物进行花培试验， 平。我国有 多种植物进行花培试验，20 多种获得了花粉植株， 多种获得了花粉植株，有一大部分是我国首 同时在花培方法， 创，同时在花培方法，机理等方面作了深入 研究 德著名学者Melchers：“花药培养起始于 德著名学者 ： 印度，而首先却在中国广泛应用， 印度，而首先却在中国广泛应用，就花药培 养的单倍体育种的应用而言， 养的单倍体育种的应用而言，中国在世界上 处于领先地位” 处于领先地位”
第7章 植物单倍体培养
27
四、花药培养 （一）概述
花药培养属于器官培养范畴，一定发育时期的花药在 适当条件下可通过两种途径发育成单倍体植株。 1. 胚发生途径 花粉---原胚---胚状体---单倍体植株 例如：甜椒、茄子、大白菜、油菜 2. 不定器官发生途径 花粉---单倍体愈伤组织---诱导器官分化---单倍体植株 花药培养存在的问题：培养过程中可能受到药壁组织干 扰，可能存在二倍体再生植株，需要进行倍性鉴定。
3 小孢子的培养 （1）液体培养 花粉悬浮液（104/ml）在培养皿中形成约 1mm后的薄层，用封口膜密封后进行培养。 （2）固体平板培养 用液体培养基溶解低熔点琼脂或琼脂糖保 温在40℃条件下使其保持液体状态，将含有花 粉粒的液体培养基与琼脂（糖）培养基混合， 使花粉粒均匀分布在培养基中，在培养皿中铺 一个薄层，凝固后用封口膜密封进行培养。
四、花药培养
（二）花药培养基本程序 2. 灭菌及预处理
未开放的花蕾，常规灭菌后直接取出花药在4~5℃条件 下冷处理2~4d，易产生胚状体。
适宜培养的花药，花蕾尚未开放花药处在严密包被之中， 本身处于无菌状态。通常只要用70％的酒精喷洒获擦拭花 器即可。
适当的预处理可显著提高花药的愈伤组织的诱导率。
25
（二）花粉培养技术
3 小孢子的培养
（3）夹层培养
固体培养基+花粉悬浮液+未凝固培养液
（4）看护培养
Sharp（1972），将番茄完整的花药置于固体培养基上，
在花药上覆盖一张滤纸圆片，用吸管吸取一滴花粉悬浮液滴
在滤纸上进行培养，利用了花药中游离成分，提高雄核发育
诱导率。
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本章内容
一、单倍体的概念及发生 二、离体小孢子发育 三、小孢子培养 四、花药培养 五、未受精子房及胚珠培养 六、单倍体植株鉴定及染色体加倍 七、单倍体培养的应用
四、花药培养 （一）概述
花药培养属于器官培养范畴，一定发育时期的花药在 适当条件下可通过两种途径发育成单倍体植株。 1. 胚发生途径 花粉---原胚---胚状体---单倍体植株 例如：甜椒、茄子、大白菜、油菜 2. 不定器官发生途径 花粉---单倍体愈伤组织---诱导器官分化---单倍体植株 花药培养存在的问题：培养过程中可能受到药壁组织干 扰，可能存在二倍体再生植株，需要进行倍性鉴定。
3 小孢子的培养 （1）液体培养 花粉悬浮液（104/ml）在培养皿中形成约 1mm后的薄层，用封口膜密封后进行培养。 （2）固体平板培养 用液体培养基溶解低熔点琼脂或琼脂糖保 温在40℃条件下使其保持液体状态，将含有花 粉粒的液体培养基与琼脂（糖）培养基混合， 使花粉粒均匀分布在培养基中，在培养皿中铺 一个薄层，凝固后用封口膜密封进行培养。
四、花药培养
（二）花药培养基本程序 2. 灭菌及预处理
未开放的花蕾，常规灭菌后直接取出花药在4~5℃条件 下冷处理2~4d，易产生胚状体。
适宜培养的花药，花蕾尚未开放花药处在严密包被之中， 本身处于无菌状态。通常只要用70％的酒精喷洒获擦拭花 器即可。
适当的预处理可显著提高花药的愈伤组织的诱导率。
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（二）花粉培养技术
3 小孢子的培养
（3）夹层培养
固体培养基+花粉悬浮液+未凝固培养液
（4）看护培养
Sharp（1972），将番茄完整的花药置于固体培养基上，
在花药上覆盖一张滤纸圆片，用吸管吸取一滴花粉悬浮液滴
在滤纸上进行培养，利用了花药中游离成分，提高雄核发育
诱导率。
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本章内容
一、单倍体的概念及发生 二、离体小孢子发育 三、小孢子培养 四、花药培养 五、未受精子房及胚珠培养 六、单倍体植株鉴定及染色体加倍 七、单倍体培养的应用
植物生物技术
3、甘露醇预处理：可提高成功率
。
三、花药培养
（一）培养基
碳源：高浓度蔗糖不利于体细胞的生长，但不妨碍花药
的生长
氮源：有机氮源对细胞初级培养的早期生长有利
植物生长调节剂：生长素和细胞分裂素比例适
当，能促进孢子体的小孢子发育
（二）培养条件 （三）培养过程
。
四、影响花药培养效率的因素
（一）供试材料的基因型 （二）供试材料的生理状态 （三）花粉的发育时期
花粉悬浮液
500~800r/min离心3min
弃上清
三次
花粉密度调整至1*104~5*104个/mL
离心
机械分离对花粉造成损伤较大
（二）散落花粉法：花药
液体培养基悬浮
花粉自然释放
取走花药
。
四、花粉培养的方法
花粉培养的方法主要有液体培养、双层培养பைடு நூலகம்看护培养、微室培养。
（一）液体培养
液体浅层培养法：悬浮花粉在培养皿中形成一浅薄膜 优点：易于添加新鲜培养基，可以镜检
液体悬浮培养法：花粉分散接种于液体培养基中 优点：营养吸收和环境条件好，大规模培养
（二）双层培养法：在琼脂培养基上部加入薄层液体花粉培养液进行培养。可以保持良
好湿度，利于花粉生长。
（三）看护培养：将单个花粉接种于滤纸上，再置于愈伤组织之上培养。优点是操作简
便，成功率高；缺点是不能再显微镜下直接观察。
。
五、花药单倍体植株的再生与鉴定
花药发育成小植株有愈伤组织和胚状体两种发育途径。再生 植株并非完全由小孢子发育而来。
鉴定再生植株的来源： ➢遗传学，一般是通过染色体数量来确定植物的倍性 ➢形态学层次，观察不同倍体植株生长发育时的形态特征差异，间接确定植物倍 性 ➢分子生物学层次，流式细胞仪测定基因组DNA含量，直接确定再生植株倍性 ➢细胞学层次，染色体计数直接鉴定法和叶片保卫细胞叶绿体计数间接鉴定法
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花药培养的条件
光照(12~18h，5,000~10,000 lx，28℃) 黑暗(12-16h，22℃)周期交替进行。
1、影响花药诱导频率的因素
①花粉发育时期是影响培养效果的重要因素 在诱导花粉进行雄性发育(指小孢子沿孢子体途径发育成花 粉植株)过程中，不同物种花粉最适的发育时期不同，对多 数植物来说，单核中期或晚期的花粉最容易形成花粉胚或花 粉愈伤组织。 如南洋金花、烟草和芍药中的最适时期是第一次有丝分裂时 期或稍前后，禾本科植物在单核早期(大麦)或单核中期(玉米、 小麦)反应最好，番茄在减数分裂中期时更适宜。
水稻花药培养
旗叶鞘用70％酒精擦洗一遍
剥去旗叶鞘，取出稻穗
左手持穗，右手用镊子取出花药，无菌培养皿中
70％酒精，洗2遍 用接种环接种到培养基上 培养5天后，花药变黑褐色，20天花药裂开，长出淡黄色 的花粉愈伤组织，先形成芽，后长出根，形成幼苗。
注意事项
选取主穗（一级侧枝）的 花蕾，因为一级侧枝的花 蕾发育良好，数量大，发 育同步。 操作过程中不应使花药受 到损伤，若受损伤，则应 淘汰，因为损伤常常会刺 激花粉壁形成二倍体的愈 伤组织。
培养温度是影响花药反应的一个重要因素
小麦要求先高温培养64天之后，再转入28～30℃下培养。一 直高温培养效果并不好。 较高的温度虽能诱导较高频率的花粉愈伤组织，但愈伤组织 分化白化苗的频率也高。控制培养温度仍是减少白化苗的一 个有效措施。
3、花药培养过程
花药材料的选取 关键选取处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉 发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的花药，均有可能 诱导离体孤雄发育。 大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单核期， 或单核中晚期。
毛曼陀罗花药培养，并诱发再生植株
三、花粉培养
花粉培养成苗途径与花药培养比较: 相同点： 胚状体成苗途径、愈伤组织再分化成苗途径 不同点： 花粉培养： 需进行花粉的分离 特殊的花粉诱导培养
一、花粉培养的操作过程
低
温 预 处
消 毒
理
选幼年玉兰树花蕾
取下花蕾（镜检）
取花药
预培养数天
分离 花粉
药壁向花粉提供营养物质
花药培养简史
1964年：印度学者古哈(Guha)和马斯瓦瑞 （Maheswari ） 将南洋金花花药培养发育成胚 1967年：包金(Bourgin)和尼奇(Nitsch)花药培养获得烟草植 株 1973年：我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株 目前：许多农作物及经济植物通过花粉培养都能诱导成植 株
花药培养与单倍体育种
花药培养的主要目的，是培育花粉粒的单倍体植株，并使单倍体加倍， 作为育种材料的来源。 利用杂种花药离体培养获得的再生植株，由不同基因型的配子发育而来， 具有丰富的变异类型，选择出有利的变异类型，经过经济性状鉴定后， 选出优良者直接用于生产或配制杂交组合，获得优良杂交种子。 构建永久性分离群体－双单倍体系（Doubled haploid)，用于基因定位。 双单倍体：是指单倍体细胞（花粉或卵细胞）经过人工或自发加倍后得 到双单倍体细胞，细胞经诱导分化可发育为单双倍体植株。
单倍体植株的二倍化
花粉植株染色体可自发加倍 人工措施染色体加倍 传统方法是用秋水仙素处理。较大浓度的秋水仙素溶液处理 单倍体植株，时间为24～96 h。
浸泡试管苗方法 处理芽方法 浸根方法
花药培养脱毒
1974年日本：花药培养可以脱除草莓病毒； 花药采取时期 单核期：花蕾4-6mm，花药1mm 花药诱导愈伤组织培养基 MS + IAA4mg/L + BA2mg/L + KT2mg/L +蔗糖30g+琼脂7g/L 增殖培养基 MS + GA1mg/L+ IBA0.2mg/L + BA1mg/L+ 蔗糖 30g + 琼脂7g/L 生根培养基 1/2MS + IBA0.2mg/L + 活性炭3g/L + 蔗糖20g + 琼脂7g/L
黄心乌花药培养
甜椒花药培养
草莓
花药愈伤组织
再生植株 花药植株
杜兰小麦的花药培养
A 花药在BAD-3诱导下，3周 后形成胚状体和愈伤组织 B 另一个花药在BAC-1培养基 中已愈伤组织中长出叶片 C 更多的花药在BAD-3培养基 上诱导出愈伤组织与子叶 D 从BAC-1转移到BAD-1分化 培养基中形成的愈伤组织 E 在MS培养基中培养5-6周， 愈伤组织开始分化根和绿色的 新芽 F 在MS培养基中培养7-8周， 可形成大量的根和幼茎 G 在MS再生培养基中培养8周 后，可由最初的花药形成小植 株 H 由花药形成的健壮小植株 I 花药形成的植株在同样的MS 再生培养基中生长，可因培养 条件改变而形成不正常的植株
第七章
花药培养和花粉培养
安徽大学《细胞工程》精品课程 陈勤
主要内容
花粉和花药培养技术 花粉和花药培养应用
安徽大学《细胞工程》精品课程 陈勤
教学目的与要求
(1) 掌握花药培养和花粉培养的区别 (2) 了解花药最佳接种时期 (3) 掌握花药培养的大致过程 (4) 掌握花粉发育的四种途径 (5) 掌握花粉培养的大致过程
② 花药供体植株的生长条件对花药培养反应的影响 很大 例如：水稻、小麦、大麦等禾本科植物，主茎穗比 分蘖穗花药愈伤组织的诱导率明显地提高，同步化 程度高。
③ 培养基是花药培养中影响花粉启动和再分化的重要条件 我国科学工作者对水稻、小麦的花药培养基做了改进，研制 出N6培养基。在N6培养基上，水稻花粉的出愈率大幅度提 高。 N6培养基的特点是铵离子浓度较低。 随后，进一步降低铵盐和硝酸盐浓度，同时附加生物素，研 制出C17和W14培养基，它们可以大幅度提高小麦的花药出 愈率。 以马铃薯提取液为基本成分的马铃薯培养液，现在被广泛地 应用于小麦花药培养，效果良好。
胚珠
花的结构
一、概 述
花药是花的雄性器官，花药培养属器官培养； 花粉是单倍体细胞，花粉培养与单细胞培养相似 花药和花粉都可以在培养过程中诱导单倍体细胞系和单倍 体植株。 单倍体植株经过染色体加倍就成为纯合二倍体植株，这样 可缩短育种周期，获得纯系。花培已成为植物育种的一种 重要手段。
一、概 述
思考题
花药培养的研究意义 花药培养方法
谢谢观看!
培养基中的植物生长物质的种类会影响花粉发育的途径
一般在禾本科植物中，常用1～ 5mg/L 2,4-D或NAA诱导花粉愈伤 组织形成，再将愈伤组织转移至 降低或去除生长素或补加细胞分 裂素类物质的分化培养基上，以 诱导器官分化和再生植株形成。
培养基中糖的种类对花粉胚的诱导和分化有显著影响
朱至清等(1990)报道在过滤灭菌的条件下，若以0.21 mg/L葡 萄糖取代液体培养基中同等浓度的蔗糖，小麦花粉胚的诱导 频率可增加2～10倍。 一般说来，高蔗糖浓度可以抑制体细胞的生长而对花粉的生 长无妨碍。 最适蔗糖浓度： ✓ 烟草的为3％ ✓ 水稻为3％～6％ ✓ 玉米则为12％～15％
安徽大学《细胞工程》精品课程 陈勤
花药培养 是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基 上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成 植株的技术。
花粉和花药培养的研究意义
单倍体植株育种
诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期 有利于筛选隐性突变体，提高选择效率 获得无病毒个体 有利于隐性基因控制性状的选择 快速获得自交系的超雄株
3、蔗糖浓度
较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织 较低浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗
三、单倍体植株染色体加倍的方法
单倍体植物天然发生的途径：
孤雌生殖
也称单性生殖，即卵不经过受精也能发育成正常的新个体，如黄瓜
无配子生殖
是指配子体可以不经过配子的结合而直接产生配子直接进行胚胎发育成新个体。通常由杂交或实验处理 后获得的，自然界中很少发生
植物的花粉是花粉母细胞经减数分裂形成的，其染色体数 目只有体细胞的一半，叫做单倍体细胞(haploid cell)。 花粉和花药的培养(pollen and anther culture)是指花粉在培 养基上改变其正常发育和机能，不经受精而发生细胞分裂， 由单个花粉粒发育成完整植株的技术。 用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株，叫 做单倍体植物(haplobiont)。
单倍体植株染色体加倍的方法
1、自然加倍 2、人工加倍：用秋水仙素溶液浸苗、处理愈伤组 织和用含0.4%秋水仙素的羊毛脂涂抹单倍体植株 的顶芽、腋芽，可得到能结实的二倍体植株。 3、愈伤组织反复继代培养，可得到二倍体植株。
小结
①花药培养是器官培养，花粉培养属细胞培养。 ②花药培养一般选择花粉的单核期进行接种。 ③花药培养包括：选择材料、消毒、接种培养、愈合组 织生成、分化出单倍体植株。 ④花粉的发育途径包括：营养细胞发育、生殖细胞发育、 营养和生殖细胞同时发育及花粉均等分裂发育。 ⑤花粉培养包括花粉的分离、预处理、培养过程。
过滤离心
通过药壁吸收、贮存和转化培养基中的外源物质
接种 再生
二、培养基
1. 基本培养基 2. 激素种类和浓度 3. 蔗糖浓度
1、基本培养基
MS和H培养基：适合双子叶植物花药培养 B5培养基：适合豆科和十字花科花药培养 N6培养基：适合禾谷类作物的花药培养
2、激素种类和浓度
细胞分裂素可促进胚状体形成 生长素可诱导愈伤组织形成 细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分 化苗
在培养基中加入活性炭能促进花药培养
水 稻 的 柱 头 花 药
-
2、 低温预处理可以提高花粉胚的诱导频率
以1～5℃预低温处理小麦幼穗，能提高花粉愈伤组织的 产量。 例如，在4℃下冷冻石刁柏花蕾，预处理4天、8天和12 天，愈伤组织诱导率比室温对照分别提高2.4倍、1.9和 1.5倍。 各种植物要求预处理的温度和时间不同。