发酵产物分离纯化

发酵生产流程可以分为三个阶段
上游:运用多种技术筛选出优良的生产 上游: 菌种; 菌种; 中游:人工或计算机控制的发酵设备中 中游: 进行微生物的大量培养, 进行微生物的大量培养,并分泌有用的 代谢物; 代谢物; 下游:将细胞或产物从发酵液中分离纯 下游: 化出来,从而获得所需的最终产品. 化出来,从而获得所需的最终产品.
生物产品分离纯化的主要特点
(1) 目的产物在初始原料中的含量较低 目的产物在初始原料中的含量较低; 在初始原料中的含量较低
(2)含目的产物的初始物料组成复杂 除了目的产物外, 还 含目的产物的初始物料组成复杂 除了目的产物外, 含目的产物的初始物料组成复杂,除了目的产物外 有大量的细胞, 代谢, 残留培养基, 无机等, 有大量的细胞 , 代谢 , 残留培养基 , 无机等 , 特别 是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大; 是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大;
目 的——除去部分可溶性杂质和改变滤 ——除去部分可溶性杂质和改变滤 液性质,以利于提取和精制的顺利进行. 液性质,以利于提取和精制的顺利进行.
1 ,发酵液的预处理
细菌及某些放线菌菌体细小, 细菌及某些放线菌菌体细小,发酵液粘度 不能直接过滤; 大,不能直接过滤; 由于菌体自溶, 核酸, 由于菌体自溶 , 核酸 , 蛋白质及其它有 机粘性物质的存在会造成滤液浑浊, 机粘性物质的存在会造成滤液浑浊,滤速 极慢; 极慢;
产品质量标准和用途对产品纯度, 产品质量标准和用途对产品纯度,生物 活性,比活的要求. 活性,比活的要求.包括允许的杂质种 类和最大允许含量, 类和最大允许含量,特殊杂质的种类和 最大允许量,以及杂质对使用的影响, 最大允许量,以及杂质对使用的影响, 产品剂型,贮存稳定性等. 产品剂型,贮存稳定性等.
(3) 目的产物的稳定性差,具有生物活性的物质对 pH, 目的产物的稳定性差, 稳定性差 , 温度,金属离子, 有机溶剂,剪切力, 温度 , 金属离子 , 有机溶剂 , 剪切力 , 表面张力 等十分敏感,容易是其失活,变性; 等十分敏感,容易是其失活,变性; 种类繁多,包括大, 小分子, 种类繁多 , 包括大 , 中 , 小分子 , 结构简单或复 杂的有机化合物,以及结构复杂又性质各异的生物 杂的有机化合物, 活性物质; 活性物质; 应用面广,对其质量,纯度要求高, 应用面广 , 对其质量 , 纯度要求高 , 甚至要求无 菌,无热源. 无热源.
Fermentation engineering
上游工程
UPSTREAM PROCESSES - genetics, cell … - inoculum development - media formulation - sterilization - inoculation
FERMENTATION Process Control
的菌体细胞和不溶性固体杂质. 的菌体细胞和不溶性固体杂质.
初步分离 :目的是除去与产物性质差异较
大的杂质,为精制工序创造有利条件. 大的杂质,为精制工序创造有利条件.
高度纯化 :去除与产物的物理化学性质比
较接近的杂质. 较接近的杂质.
成品制作 :成品形式由产品的最终用途决
定.
下 游 加 工 过 程 的 一 般 流 程
下游加工过程在生物技术中的地位
组成:下游加工过程是生物技术的重要组成部分, ①组成:下游加工过程是生物技术的重要组成部分,发酵液或反应 下游技术(工程) ):对于由 下游技术(工程) (downstream ): 液需要经过下游加工过程才能成为成品; 液需要经过下游加工过程才能成为成品; processing):对于由
Fermentation engineering
下游工程
DOWNSTREAM PROCESSES - product extraction, purification & assay - waste treatment -by product recovery
FERMENTATION Process Control
会召开了专门讨论下游加工过程的国际会议;我国也于1989 1989年 会召开了专门讨论下游加工过程的国际会议;我国也于1989年 在济南召开了一次专门会议; 在济南召开了一次专门会议;近十年来国内外有关生物分离或蛋白 下游加工过程的重要性.(组成, 下游加工过程的重要性 质纯化的专著陆续出版. .(组成 费用和关注程度) 质纯化的专著陆续出版. .(组成,费用和关注程度)
分离纯化的一般流程
一般分离纯化过程可分为4个阶段: 一般分离纯化过程可分为4个阶段:
1) 2) 3) 4) 培养液(发酵液)的预处理和固液分离; 培养液(发酵液)的预处理和固液分离; 初步纯化(提取); 初步纯化(提取); 高度纯化(精制); 高度纯化(精制); 成品加工. 成品加工.
预处理和固液分离 :目的是分离发酵液中
生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的, 生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的,动植物细胞组 费用:传统发酵工业中下游部分的费用占整个工厂投资费用的6 ②费用:传统发酵工业中下游部分的费用占整个工厂投资费用的6 而对重组DNA生产蛋白质等基因工程产品, 0%,而对重组DNA生产蛋白质等基因工程产品 织培养的, DNA生产蛋白质等基因工程产品,下游加工的费 织培养的,酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原 用可占整个生产费用的80 80% 90% 用可占整个生产费用的80%-90%; 经提取分离,加工并精制目的成分, 料,经提取分离,加工并精制目的成分,最终使其成为产 关注程度:英国政府工业部于1983年发起生物分离计划( 1983年发起生物分离计划 ③关注程度:英国政府工业部于1983年发起生物分离计划(B 品的技术. ,专门研究下游加工过程;1987年英国化学工业 品的技术. 专门研究下游加工过程;1987年英国化学工业 IOSEP) IOSEP)
物料中杂质的含量,性质,结构, 物料中杂质的含量,性质,结构,相对 分子质量,电荷性质及数量, 分子质量,电荷性质及数量,生物学特 性,稳定性,溶解度,分配系数,挥发 稳定性,溶解度,分配系数, 性,吸附性能等. 吸附性能等.
产物的化学,物理和生物学特性, 产物的化学,物理和生物学特性,包括 化学组成,相对分子质量,等电点, 化学组成,相对分子质量,等电点,电 荷分布及密度,溶解度,稳定性, 荷分布及密度,溶解度,稳定性,疏水 扩散性,扩散系数,分配系数, 性,扩散性,扩散系数,分配系数,吸 附性能,生物学活性,亲和性, 附性能,生物学活性,亲和性,配基种 表面活性等. 类,表面活性等.
(沉淀,吸附,萃取,超滤,结晶) 沉淀,吸附,萃取,超滤,结晶)
重结晶,离子交换,色谱分离,膜分离) 高度纯化 (重结晶,离子交换,色谱分离,膜分离) 浓缩,无菌过滤,干燥,成型) 成品加工 (浓缩,无菌过滤,干燥,成型)
二,发酵液预处理与固液分离
1 ,发酵液的预处理 2 ,发酵液的固液分离
1 ,发酵液的预处理
真菌的菌丝比较粗大, 发酵液容易过滤, 真菌的菌丝比较粗大 , 发酵液容易过滤 , 常 不需特殊处理. 其滤渣呈紧密饼状物, 不需特殊处理 . 其滤渣呈紧密饼状物 , 很容 易从滤布上刮下来, 易从滤布上刮下来 , 故可采用鼓式真空过滤 机过滤. 机过滤. 放线菌发酵液菌丝细而分枝, 交织成网络状. 放线菌发酵液菌丝细而分枝 , 交织成网络状 . 还含有很多多糖类物质, 粘性强, 还含有很多多糖类物质 , 粘性强 , 过滤较困 难 , 一般需经预处理 , 以凝固蛋白质等胶体 . 一般需经预处理, 以凝固蛋白质等胶体. 细菌发酵液的菌体更细小, 因此, 细菌发酵液的菌体更细小 , 因此 , 过滤十分 困难, 如不用絮凝等方法预处理发酵液, 困难 , 如不用絮凝等方法预处理发酵液 , 往 往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作. 往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作 .
预处理的方法
采用絮凝或凝聚的方法, 采用絮凝或凝聚的方法,设法增大悬浮液中 絮凝或凝聚的方法 固体粒子的大小,提高其沉降速度; 固体粒子的大小,提高其沉降速度; 采用稀释,加热等方法降低粘度, 采用稀释,加热等方法降低粘度,以利于过 滤;
凝聚和絮凝技术
凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞, 凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞, 菌体 和蛋白质等胶体粒子的分散状态, 和蛋白质等胶体粒子的分散状态 ,使它们 聚集起来,增大体积,以便于过滤, 聚集起来 , 增大体积, 以便于过滤, 常用 于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理 中.
第六节 发酵产物分离过程
Fermentation engineering
发 酵 工 程 组 成
上游工程 UPSTREAM PROCESSES 从广义上讲,由三部分组成: 上游工程,发酵工程, 上游工程,发酵工程,下游工程
下游工程
FERMENTATION Process Control
DOWNSTREAM PROCESSES
(4)
(5)
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一,建立分离纯化工艺的根据
1,含目的产物的起始物料的特点 , 2,物料中杂质的种类和性质 , 3,目的产物特性 , 4,产品质量的要求 ,
(1)菌种类型及其代谢特性:包括菌种的生物学性质,产物和副 )菌种类型及其代谢特性:包括菌种的生物学性质, 产物种类,产物在细胞内所处的位置,表达方式(胞内,胞外, 产物种类,产物在细胞内所处的位置,表达方式(胞内,胞外, 包含体) 代谢物种类,产物类似物, 包含体),代谢物种类,产物类似物,毒素和能降解产物的酶类 等; (2)原材料和培养基的来源及其质量; )原材料和培养基的来源及其质量; (3)生产工艺和条件:包括灭菌方式和条件,生产方式(连续, )生产工艺和条件:包括灭菌方式和条件,生产方式(连续, 批式,半连续) 生产周期,生产能力, 批式,半连续),生产周期,生产能力,工艺控制条件因素几方 式等; 式等; (4)初始物料的物理,化学和生物学特性:包括产物浓度,主要 )初始物料的物理,化学和生物学特性:包括产物浓度, 杂质种类和浓度, 盐的种类和浓度, 溶解度, , 黏度, 杂质种类和浓度 , 盐的种类和浓度 , 溶解度 , pH,黏度 , 流体 力学性质和热力学性质. 力学性质和热力学性质.
凝聚和絮凝机理 凝聚和絮凝机理
凝聚: 凝聚 : 电解质将胶体粒子表面上的电荷中 减少存在于胶体粒子间的静电斥力, 和 , 减少存在于胶体粒子间的静电斥力 , 范德华吸引力占优势, 范德华吸引力占优势 , 这样胶体就会凝 聚成较大, 聚成较大,较密实的粒子 絮凝: 在某些高分子絮凝剂存在下, 絮凝 : 在某些高分子絮凝剂存在下 , 使胶 粒形成粗大的絮凝团使之更容易过滤. 粒形成粗大的絮凝团使之更容易过滤.
凝聚是在中性盐作用下, 凝聚是在中性盐作用下,而使胶体体系不稳 定的现象. 定的现象. 常 用 的 凝 聚 剂 电 解 质 有 : Al2(SO4)318H2O( 明 矾 ) ; AlC136H2O ; FeC13;ZnSO4;MgCO3等.
絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下, 絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下 , 使胶 粒形成粗大的絮凝团的过程, 粒形成粗大的絮凝团的过程 , 是一种以物理 的集合为主的过程. 的集合为主的过程.
精制 提取
发酵液 预处理 —— 的
(加热,调pH,絮凝) 加热, ,絮凝) 胞 内 产 化学,研磨,酶解) 细胞破碎 (化学,研磨,酶解) 物 胞 外 产 物
细胞分离 (过滤,离心分离,膜分离 过滤,离心分离,膜分离)
细胞碎片分离 初步纯化
(离心分离,双水相萃取,膜分离) 离心分离,双水相萃取,膜分离)
目前最常见的高分子聚合物絮凝剂是有机合 成的聚丙烯酰胺类衍生物. 成的聚丙烯酰胺类衍生物.
2,发酵液的固液分离
常用的操作方法有过滤和离心. 常用的操作方法有过滤和离心.
产胞内产物的菌体收集菌体后需要使 细胞破碎. 细胞破碎.
细胞的破碎方法
按所用方法属性分为物理法( 按所用方法属性分为物理法 ( 匀浆 珠磨法,超声法) 化学法( 法 , 珠磨法 , 超声法 ) , 化学法 ( 渗透 冲击,增溶法,脂溶法) 生物法( 冲击 , 增溶法 , 脂溶法 ) ,生物法 ( 酶 溶法). 溶法)