内质网应激在高糖诱导心肌细胞凋亡中的作用_刘畅
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内质网应激凋亡通路可能参与高糖诱导的心肌细胞凋亡。 【关键词】 内质网应激； 高糖； 心肌细胞； 凋亡
糖尿 病 心 肌 病 （ diabetes cardiomyopathy，DCM） 是 一种完全不同于冠心病、高血压性心脏病及其他原因 心脏疾病的、独立的、特异性心肌疾病［1］。目前研究认 为 DCM 的发病机制可能与代谢紊乱、心肌细胞肥大、 细胞凋亡、心肌 纤 维 化、微 血 管 病 变 等 有 关，其 中 细 胞 凋亡在 DCM 发病中起到重要作用［2］。研究发现，糖尿 病患者心肌细胞内的内质网肿胀，体积增大，内质网可 能也出现功能紊乱，提示内质网应激有可能参与糖尿 病心肌病的发生发展［3］。2009 年 10 月至 2010 年 6 月 本实验 通 过 观 察 对 高 糖 干 预 后 的 大 鼠 心 肌 细 胞 中 GRP78、CHOP 和 Caspase － 12 的表达和心肌细胞凋亡 的检测，探讨内质网应激与高糖诱导心肌细胞凋亡中 的作用，为糖尿病心肌病的病因机制研究提供依据，寻 求新的治疗靶点。
（ 收稿日期： 2011 － 06 － 28 编辑： 王冰）
内质网应激在高糖诱导心肌细胞凋亡中的作用*
刘畅，王筠，姜丁文
辽宁医学院第一附属医院内分泌科（ 辽宁锦州 121001）
【摘要】 目的 探讨内质网应激在高糖诱导大鼠心肌细胞凋亡中的作用。方法 采用混合酶一步消化法分 离 SD 大鼠乳鼠心肌细胞，以高糖诱导的心肌细胞为模型，将培养的心肌细胞分为 3 组，甘露醇对照组（ 对照组） 、 高糖（ 25 mmol / L） 组和高糖加抗氧化剂组（ NAC 组） ，分别检测各组心肌细胞中活性氧（ ROS） 的含量，利用 RT － PCR 法检测心肌细胞中内质网应激标志分子 GRP78、CHOP 和 Caspase － 12 的表达情况。结果 与对照组比较，高 糖组心肌细胞中 ROS 含量明显增多，细胞凋亡率升高（ P ＜ 0. 01） ，与高糖组比较，NAC 组 ROS 含量减少（ P ＜ 0. 01） ，细胞凋亡率降低（ P ＜ 0. 01） ； 与 NAC 组比较，高糖组内质网应激标志分子的 mRNA 表达显著上调 （ P ＜ 0. 01） ，抗氧化剂能阻断高糖心肌细胞中内质网应激标志分子 mRNA 的表达，使其表达明显下调（ P ＜ 0. 01） 。结论
［4］ CELENZA F，HOGHMAN M N． Absolute anchorage in orthodontics： direct and indirect implant － assistod modalities［J］． J Clin Orthod，2000，344（ 7） ： 397 － 402．
［5］ LEE J S，PARK H S，KYUNG H M． Micro － implant anchorage
for lingual treatment of a skeletal class Ⅱ malocclusion［J］． J Clin Orthod，2001，35（ 10） ： 643 － 647． ［6］ LUM L B． A biomechanical rational for the use of short implants ［J］． J Oral Implantol，1991，17（ 2） ： 126 － 130． ［7］ 龙红月，林珠，兰泽栋，等． 支抗种植体外形对骨界面应力分 布的影响［J］． 中国口腔种植学杂志，2003，8（ 2） ： 61 － 63． ［8］ 兰泽栋，林珠，龙红月，等． 支抗种植体直径对骨界面应力分 布的影响［J］． 实用口腔医学杂志，2004，20（ 1） ： 43 － 46． ［9］ 兰泽栋，林珠，龙红月，等． 支抗种植体长度对骨界面应力分 布的影响［J］． 中国口腔种植学杂志，2003，8（ 3） ： 112 － 115． ［10］ MIYAWAKI S，KOYAMA I，INOUE M，et al． Factors associated with the stability of titanium screws placed in the posterior region for orthodontic anchorage［J］． Am J Orthod Dentofaeial Orthop， 2003，124（ 4） ： 373 － 378．
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广东医学 2012 年 1 月 第 33 卷第 1 期 Guangdong Medical Journal Jan． 2012，Vol． 33，No． 1
37℃ 、5% CO2 培 养 箱 中，48 h 后 更 换 含 15% FBS 的 DMEM 完全培养基，待细胞融合出现整体搏动后即可 进行实验。 1． 2． 2 细胞免疫荧光染色法鉴定心肌细胞 将心肌 细胞以 4 × 105 ·mL －1 的密度接种于置有盖玻片的 6 孔 板中，培养 48 h 后，将爬片后的心肌细胞取出，PBS 洗 3 次，2 min / 次，4% 的多聚甲醛固定细胞 30 min，室温， PBS 洗 3 次，2 min / 次，30% 过氧化氢和纯甲醇（ 1 ∶ 50） 混合，室温浸泡 15 min，以灭活内源性过氧化物酶，PBS 洗 3 次，2 min / 次。3% BSA 封闭，室温 20 min，甩去多 余液体，不洗； 加入一抗 α － 平滑肌肌动蛋白（ 1∶ 400稀 释） ，4℃ 过夜； 第 2 天复温 37℃ ，60 min 湿敷。PBS 洗 3 次，2 min / 次，加 入 荧 光 标 记 的 二 抗 山 羊 抗 兔 IgG / FITC（ 1∶ 200 稀释） ，37℃ ，30 min 湿敷。PBS 洗 3 次，2 min / 次，甘油封片，在荧光显微镜下观察并拍照。 1． 2． 3 实验分组及干预方法 取培养好的原代心肌 细胞，干预培养 24 h，按照随机原则分组如下： （ 1） 对照 组： 甘露醇终浓度为 25 mmol / L； （ 2） 高糖组： 葡萄糖终 浓度为 25 mmol / L； （ 3 ） NAC 组： 葡 萄 糖 终 浓 度 为 25 mmol / L，抗氧化剂 NAC 终浓度为 10 mmol / L。 1． 2． 4 流式细胞仪术检测心肌细胞凋亡 应用 Annexin － V － P 双染法，通过流式细胞术检测心肌细胞 凋亡： 将不同培养条件下的心肌细胞用 0. 1% 的胰蛋 白酶消化后制成单细胞悬液 105 ·mL －1 ，以 PBS 清洗， 离心半径 11 cm、500 r / min 离心 60 s 沉淀心肌细胞， 弃去上清液，细胞以 106 ·mL －1 浓度于 PBS 悬浮心肌 细胞，加入 10 μL 的 Annexin V － FITC 和 5 μL 的 PI，混 匀后 4℃ 避光放置 30 min，混匀后上机，行流式细胞术 检测。 1． 2． 5 检测心肌细胞中活性氧（ ROS） 含量 将心肌 细胞以 4 × 105 ·mL －1 的密度接种于 6 孔板，不同条件 干预 24 h 后，去除培养基，装入稀释好的 DCFH － DA 探针 1 mL，37℃ 培养箱孵育 20 min，用无血清培养液洗 涤细胞 3 次，收集细胞后用荧光分光光度计检测刺激 前后荧光强度变化情况（ 激发波长 488 nm，发射波长 530 nm） 。 1． 2． 6 RT － PCR 检 测 心 肌 细 胞 中 高 糖 不 同 时 点 GRP78、CHOP 和 Caspase － 12 的 mRNA 表达 分别于 各时点（ 0、3、6、12 和 24 h） 作用心肌细胞后，加入 Trizol，提取总 RNA。用 TaKaRa 公司的 RT － PCR 试剂盒 反转录系统合成 cDNA。引物序列 GRP78 上游为 5' － ACAAAGGGACAGGAAACA － 3'，下 游 为 5' － AAAGCAGTAAACAGCCAC － 3'，扩增片长 578 bp； CHOP 上游 为 5' － TCTGCCTTTCGCCTTTGA － 3'，下游为 5' － CCTGCTCCTTCTCCTTCAT － 3'，扩增片长 359 bp； Caspase － 12 上游为 5' － AGTCCTCCGACAGCACAT － 3'，下游为 5' － GAGCCACTCTTGCCTACC － 3'，扩增片 长 373 bp； β － actin 上游为 5' － GTGGGGCGCCCCAGGCACCA － 3'
1 材料与方法
1． 1 材料 Ⅱ型分散酶、Ⅱ 型胶原酶 （ Sigma 公司） ； 0. 1% 胰蛋 白 酶 （ Hyclone 公 司 ） ； 低 糖 DMEM 培 养 基
* 辽宁医学院博士科研启动基金资助项目（ 编号： 20091050）
（ Gibco 公司） ； 胎牛血清 （ 四季青公司） ； AnnexinV － FITC 凋亡试剂盒（ 北京宝赛试剂生物技术有限公司） ； 大鼠横纹肌辅肌动蛋白 － α、二 抗 试 剂 盒 （ 博 奥 森） ； N － 乙酰半胱氨酸（ NAC，碧云天公司） ； 活性氧检测试 剂盒（ 普利莱公司） ； RNA PCR 试剂盒（ 大连宝生物工 程有限公司） 。 1． 2 方法 1． 2． 1 乳鼠心肌细胞原代培养 取 1 ～ 3 d 清洁级 SD 大鼠，雌雄不限，辽宁医学院实验动物中心提供［动物 许可证号： SCXK （ 辽） 2003 － 2007］。参考文献［4］在 无菌条件下取出乳鼠心脏，剪成 0. 5 mm3 大小的碎块， 移入培养皿中，加入混合酶 （ Ⅱ分散酶 + Ⅱ胶原酶） ， 置于 37℃ 、5% CO2 培养箱中 10 min，取出吹打 5 min， 直至组织块基本消化完为止，加入 FBS 2 滴以终止消 化，用 200 目孔径的不锈钢网滤过，以 1 000 r / min 离心 10 min 共 2 次。含 15% FBS 的 DMEM 培养液重悬，接 种到细胞培养瓶中，在 37℃ 、5% CO2 培养箱中1 h差速 贴壁，以去除成纤维细胞。再小心吸出细胞悬 液，计 数。按 5 × 105 · mL －1 密 度 再 次 接 种 6 孔 板，置 入
［2］ BAE S M，PARK H S，KYUNG H M，et al． Clinical application of micro implant anchorage［J］． J Clin Orthod，2002，36（ 5） ： 298 － 302．
［3］ LINDER ARONSON S，NORDENRAM A，ANNEROTH G． Titanium implant anchorage in orthodontic treatment： an experimental investigation in monkeys［J］． Eur J orthod，1990，12（ 4） ： 414 － 419．
下游为 5' － CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC － 3' 扩 增片长 170 bp。PCR 条件为： 95℃ 5 min，95℃ 变性 30 s，按 59℃ 、61℃ 、58℃ 、56℃ 退火 30 s，73℃ 延伸 30 s，30 个循环，73℃ 延伸 10 min。用 2% 琼脂糖凝胶电泳检测 扩增结果。紫外分光图像分析仪检测反应产物 DNA， 计算待测基因与内参灰度值的比值，比较各组间基因 / 内参比值的大小。
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患者颌骨的大小、骨质情况及种植位置，在与颌骨匹配 的前提下尽最大可能选择粗直径的种植体。
参考文献
［1］ 朱胜吉，周彦恒，傅民魁，等． 应用种植体支抗正畸治疗的初 步临床研究［J］． 口腔正畸学，2004，11（ 4） ： 169 － 173．
糖尿 病 心 肌 病 （ diabetes cardiomyopathy，DCM） 是 一种完全不同于冠心病、高血压性心脏病及其他原因 心脏疾病的、独立的、特异性心肌疾病［1］。目前研究认 为 DCM 的发病机制可能与代谢紊乱、心肌细胞肥大、 细胞凋亡、心肌 纤 维 化、微 血 管 病 变 等 有 关，其 中 细 胞 凋亡在 DCM 发病中起到重要作用［2］。研究发现，糖尿 病患者心肌细胞内的内质网肿胀，体积增大，内质网可 能也出现功能紊乱，提示内质网应激有可能参与糖尿 病心肌病的发生发展［3］。2009 年 10 月至 2010 年 6 月 本实验 通 过 观 察 对 高 糖 干 预 后 的 大 鼠 心 肌 细 胞 中 GRP78、CHOP 和 Caspase － 12 的表达和心肌细胞凋亡 的检测，探讨内质网应激与高糖诱导心肌细胞凋亡中 的作用，为糖尿病心肌病的病因机制研究提供依据，寻 求新的治疗靶点。
（ 收稿日期： 2011 － 06 － 28 编辑： 王冰）
内质网应激在高糖诱导心肌细胞凋亡中的作用*
刘畅，王筠，姜丁文
辽宁医学院第一附属医院内分泌科（ 辽宁锦州 121001）
【摘要】 目的 探讨内质网应激在高糖诱导大鼠心肌细胞凋亡中的作用。方法 采用混合酶一步消化法分 离 SD 大鼠乳鼠心肌细胞，以高糖诱导的心肌细胞为模型，将培养的心肌细胞分为 3 组，甘露醇对照组（ 对照组） 、 高糖（ 25 mmol / L） 组和高糖加抗氧化剂组（ NAC 组） ，分别检测各组心肌细胞中活性氧（ ROS） 的含量，利用 RT － PCR 法检测心肌细胞中内质网应激标志分子 GRP78、CHOP 和 Caspase － 12 的表达情况。结果 与对照组比较，高 糖组心肌细胞中 ROS 含量明显增多，细胞凋亡率升高（ P ＜ 0. 01） ，与高糖组比较，NAC 组 ROS 含量减少（ P ＜ 0. 01） ，细胞凋亡率降低（ P ＜ 0. 01） ； 与 NAC 组比较，高糖组内质网应激标志分子的 mRNA 表达显著上调 （ P ＜ 0. 01） ，抗氧化剂能阻断高糖心肌细胞中内质网应激标志分子 mRNA 的表达，使其表达明显下调（ P ＜ 0. 01） 。结论
［4］ CELENZA F，HOGHMAN M N． Absolute anchorage in orthodontics： direct and indirect implant － assistod modalities［J］． J Clin Orthod，2000，344（ 7） ： 397 － 402．
［5］ LEE J S，PARK H S，KYUNG H M． Micro － implant anchorage
for lingual treatment of a skeletal class Ⅱ malocclusion［J］． J Clin Orthod，2001，35（ 10） ： 643 － 647． ［6］ LUM L B． A biomechanical rational for the use of short implants ［J］． J Oral Implantol，1991，17（ 2） ： 126 － 130． ［7］ 龙红月，林珠，兰泽栋，等． 支抗种植体外形对骨界面应力分 布的影响［J］． 中国口腔种植学杂志，2003，8（ 2） ： 61 － 63． ［8］ 兰泽栋，林珠，龙红月，等． 支抗种植体直径对骨界面应力分 布的影响［J］． 实用口腔医学杂志，2004，20（ 1） ： 43 － 46． ［9］ 兰泽栋，林珠，龙红月，等． 支抗种植体长度对骨界面应力分 布的影响［J］． 中国口腔种植学杂志，2003，8（ 3） ： 112 － 115． ［10］ MIYAWAKI S，KOYAMA I，INOUE M，et al． Factors associated with the stability of titanium screws placed in the posterior region for orthodontic anchorage［J］． Am J Orthod Dentofaeial Orthop， 2003，124（ 4） ： 373 － 378．
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广东医学 2012 年 1 月 第 33 卷第 1 期 Guangdong Medical Journal Jan． 2012，Vol． 33，No． 1
37℃ 、5% CO2 培 养 箱 中，48 h 后 更 换 含 15% FBS 的 DMEM 完全培养基，待细胞融合出现整体搏动后即可 进行实验。 1． 2． 2 细胞免疫荧光染色法鉴定心肌细胞 将心肌 细胞以 4 × 105 ·mL －1 的密度接种于置有盖玻片的 6 孔 板中，培养 48 h 后，将爬片后的心肌细胞取出，PBS 洗 3 次，2 min / 次，4% 的多聚甲醛固定细胞 30 min，室温， PBS 洗 3 次，2 min / 次，30% 过氧化氢和纯甲醇（ 1 ∶ 50） 混合，室温浸泡 15 min，以灭活内源性过氧化物酶，PBS 洗 3 次，2 min / 次。3% BSA 封闭，室温 20 min，甩去多 余液体，不洗； 加入一抗 α － 平滑肌肌动蛋白（ 1∶ 400稀 释） ，4℃ 过夜； 第 2 天复温 37℃ ，60 min 湿敷。PBS 洗 3 次，2 min / 次，加 入 荧 光 标 记 的 二 抗 山 羊 抗 兔 IgG / FITC（ 1∶ 200 稀释） ，37℃ ，30 min 湿敷。PBS 洗 3 次，2 min / 次，甘油封片，在荧光显微镜下观察并拍照。 1． 2． 3 实验分组及干预方法 取培养好的原代心肌 细胞，干预培养 24 h，按照随机原则分组如下： （ 1） 对照 组： 甘露醇终浓度为 25 mmol / L； （ 2） 高糖组： 葡萄糖终 浓度为 25 mmol / L； （ 3 ） NAC 组： 葡 萄 糖 终 浓 度 为 25 mmol / L，抗氧化剂 NAC 终浓度为 10 mmol / L。 1． 2． 4 流式细胞仪术检测心肌细胞凋亡 应用 Annexin － V － P 双染法，通过流式细胞术检测心肌细胞 凋亡： 将不同培养条件下的心肌细胞用 0. 1% 的胰蛋 白酶消化后制成单细胞悬液 105 ·mL －1 ，以 PBS 清洗， 离心半径 11 cm、500 r / min 离心 60 s 沉淀心肌细胞， 弃去上清液，细胞以 106 ·mL －1 浓度于 PBS 悬浮心肌 细胞，加入 10 μL 的 Annexin V － FITC 和 5 μL 的 PI，混 匀后 4℃ 避光放置 30 min，混匀后上机，行流式细胞术 检测。 1． 2． 5 检测心肌细胞中活性氧（ ROS） 含量 将心肌 细胞以 4 × 105 ·mL －1 的密度接种于 6 孔板，不同条件 干预 24 h 后，去除培养基，装入稀释好的 DCFH － DA 探针 1 mL，37℃ 培养箱孵育 20 min，用无血清培养液洗 涤细胞 3 次，收集细胞后用荧光分光光度计检测刺激 前后荧光强度变化情况（ 激发波长 488 nm，发射波长 530 nm） 。 1． 2． 6 RT － PCR 检 测 心 肌 细 胞 中 高 糖 不 同 时 点 GRP78、CHOP 和 Caspase － 12 的 mRNA 表达 分别于 各时点（ 0、3、6、12 和 24 h） 作用心肌细胞后，加入 Trizol，提取总 RNA。用 TaKaRa 公司的 RT － PCR 试剂盒 反转录系统合成 cDNA。引物序列 GRP78 上游为 5' － ACAAAGGGACAGGAAACA － 3'，下 游 为 5' － AAAGCAGTAAACAGCCAC － 3'，扩增片长 578 bp； CHOP 上游 为 5' － TCTGCCTTTCGCCTTTGA － 3'，下游为 5' － CCTGCTCCTTCTCCTTCAT － 3'，扩增片长 359 bp； Caspase － 12 上游为 5' － AGTCCTCCGACAGCACAT － 3'，下游为 5' － GAGCCACTCTTGCCTACC － 3'，扩增片 长 373 bp； β － actin 上游为 5' － GTGGGGCGCCCCAGGCACCA － 3'
1 材料与方法
1． 1 材料 Ⅱ型分散酶、Ⅱ 型胶原酶 （ Sigma 公司） ； 0. 1% 胰蛋 白 酶 （ Hyclone 公 司 ） ； 低 糖 DMEM 培 养 基
* 辽宁医学院博士科研启动基金资助项目（ 编号： 20091050）
（ Gibco 公司） ； 胎牛血清 （ 四季青公司） ； AnnexinV － FITC 凋亡试剂盒（ 北京宝赛试剂生物技术有限公司） ； 大鼠横纹肌辅肌动蛋白 － α、二 抗 试 剂 盒 （ 博 奥 森） ； N － 乙酰半胱氨酸（ NAC，碧云天公司） ； 活性氧检测试 剂盒（ 普利莱公司） ； RNA PCR 试剂盒（ 大连宝生物工 程有限公司） 。 1． 2 方法 1． 2． 1 乳鼠心肌细胞原代培养 取 1 ～ 3 d 清洁级 SD 大鼠，雌雄不限，辽宁医学院实验动物中心提供［动物 许可证号： SCXK （ 辽） 2003 － 2007］。参考文献［4］在 无菌条件下取出乳鼠心脏，剪成 0. 5 mm3 大小的碎块， 移入培养皿中，加入混合酶 （ Ⅱ分散酶 + Ⅱ胶原酶） ， 置于 37℃ 、5% CO2 培养箱中 10 min，取出吹打 5 min， 直至组织块基本消化完为止，加入 FBS 2 滴以终止消 化，用 200 目孔径的不锈钢网滤过，以 1 000 r / min 离心 10 min 共 2 次。含 15% FBS 的 DMEM 培养液重悬，接 种到细胞培养瓶中，在 37℃ 、5% CO2 培养箱中1 h差速 贴壁，以去除成纤维细胞。再小心吸出细胞悬 液，计 数。按 5 × 105 · mL －1 密 度 再 次 接 种 6 孔 板，置 入
［2］ BAE S M，PARK H S，KYUNG H M，et al． Clinical application of micro implant anchorage［J］． J Clin Orthod，2002，36（ 5） ： 298 － 302．
［3］ LINDER ARONSON S，NORDENRAM A，ANNEROTH G． Titanium implant anchorage in orthodontic treatment： an experimental investigation in monkeys［J］． Eur J orthod，1990，12（ 4） ： 414 － 419．
下游为 5' － CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC － 3' 扩 增片长 170 bp。PCR 条件为： 95℃ 5 min，95℃ 变性 30 s，按 59℃ 、61℃ 、58℃ 、56℃ 退火 30 s，73℃ 延伸 30 s，30 个循环，73℃ 延伸 10 min。用 2% 琼脂糖凝胶电泳检测 扩增结果。紫外分光图像分析仪检测反应产物 DNA， 计算待测基因与内参灰度值的比值，比较各组间基因 / 内参比值的大小。
广东医学 2012 年 1 月 第 33 卷第 1 期 Guangdong Medical Journal Jan． 2012，Vol． 33，No． 1
·59·Fra Baidu bibliotek
患者颌骨的大小、骨质情况及种植位置，在与颌骨匹配 的前提下尽最大可能选择粗直径的种植体。
参考文献
［1］ 朱胜吉，周彦恒，傅民魁，等． 应用种植体支抗正畸治疗的初 步临床研究［J］． 口腔正畸学，2004，11（ 4） ： 169 － 173．