浅谈层析法分离蛋白质

浅谈凝胶柱层析分离蛋白质

根据对生物产物分离工程的学习及所做的相关实验，我对这方面的知识有了粗浅的认识。根据所学知识我发现生物产物分离的方法多种多样，不同产物其分离方法不同，同种产物又有多种分离方法。就所做的实验而言，我对层析法分离蛋白比较感兴趣。以下是我对这种方法的了解：

层析法是分离蛋白质通用的方法。其原理都是通过蛋白质在流动相和固定相之间的性质不同而达到分离的效果。层析法可分为纸层析法，凝胶过滤层析法，离子交换层析法等。凝胶过滤层析法最为常用，在分离蛋白质时只需要把蛋白质混合液加到凝胶珠的上部，并加少许洗脱液来产生一定的液压是蛋白质能向下运动，在凝胶柱底部用试管接流下来的蛋白质液体，进行比色。此种方法很简单，不需要贵重仪器，但分离的蛋白质不是很好，这些液体仍然是很多蛋白质的混合液，通过比色来确定目的蛋白含量的最高值。这种方法只能对蛋白质进行一些粗筛。

近期做了一个实验应用到了凝胶层析即凝胶柱层析分离蛋白质，这个实验主要是运用凝胶层析分离蓝色葡聚糖2000kb和牛徐清蛋白的。这个实验应注意：1、装柱时要注意凝胶的流速，不宜过快，同时要保证凝胶能充分的沉淀且分布的比较均匀; 2、凝胶溶胀所用的溶液应与洗脱用的溶液相同，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果; 3、样品的浓度和加样量的多少。是影响分离效果的重要因素。样品浓度应适当大，但大分子物质的浓度大时，溶液的黏度也随之变大，会影响分离效果，要兼顾浓度与黏度两方面。加样量和加样体积越少分离效果越好，加样量一般为柱床体积的1%-2%，制备用量一般为柱床体积的20%-30%；4、凝胶用完后可再加入防腐剂低温保存；5、叠氮钠属于

有毒性物质，在使用过程中需注意安全。

凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。具有以下特点：1．凝胶层析操作简便，所需设备简单。有时只要有一根层析柱便可进行工作。分离介质—凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生过程便可重复使用。2．分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100％。3．分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响。4．应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围也很宽，如Sephadex G类为102～105d；Sepharose类为105～108d。5．分辨率不高，分离操作较慢。

由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，所以分离时流速必须严格把握。因而分离操作一般较慢。而且对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。此外，凝胶层析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象。

凝胶层析法常用的凝胶有天然凝胶（如琼脂粉凝胶）和人工合成凝胶（如葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）葡聚糖凝胶（Sephadex）具有良好的化学稳定性，是目前生化产品制备中最常用的凝胶。亲脂性葡聚糖凝胶凝胶既亲脂又亲水，可在多种有机溶剂中膨胀。这种凝胶在pH＞2的不含氧化剂的溶液中稳定。用低级醇为溶剂时，对芳香族、杂环族化合物仍有吸附作用。但用氯仿时则可去除对上述化合物的吸附作用，而对含羟基与羧基的化合物却有吸附作用。在G类

凝胶上引入一些酸性或碱性基团后，则制得各种葡聚糖凝胶离子交换剂。聚丙烯酰胺凝胶也是一种人工合成凝胶，其商品名为生物凝胶P（Bio-gel-P），和交联葡聚糖一样，为颗粒状干粉，在溶剂中能自动吸水溶胀成凝胶。其由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺通过自由基引发聚会形成聚丙烯酰胺凝胶。只要控制单体用量和交联剂的比例，就能得到不同型号的凝胶。

凝胶颗粒大小一般分为粗、中、细和超细四类。颗粒越细，分离效果越好，因为它容易达到平衡，但流速慢。颗粒越粗，流速越快，会使区带扩散，使洗脱峰变平变宽。

新柱装好后，要用洗脱缓冲液平衡，一般用3～5倍体积的缓冲液在恒压下流过柱床。新装好的柱要检验其均匀性－可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液过柱，观察色带是否均匀下降。也可以对光检查，看其是否均匀或有无气泡存在。通过实验结果可知由于凝胶层析的稀释作用，似乎样品浓度应尽可能大才好，但样品浓度过大往往导致粘度增大，而使层析分辨率下降一般要求样品粘度小于0.01Pa·s（帕斯卡秒），这样才不致于对分离造成明显影响。对蛋白质类样品浓度以不大于4％为宜。如果样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后上柱。分析用量一般为每100mL床体积加样品1～2mL，制备用量一般为每100 mL床体积加样品20～30 mL，这样可使样品的洗脱体积小于样品各组分之间的分离体积，获得较满意的分离效果。

样品上柱是凝胶层析中最关键的一步。理想的样品色带应是狭窄且平直的巨型色谱带。为了做到这一点，应尽量减少加样时样品的稀释以及样品的非平流流经凝胶层析床体。反之将造成色谱带扩散、紊乱，严重影响分离效果洗脱剂的流速对分离效果也有很大影响，下图显示了同一凝胶柱在不同流速下的洗脱曲线。

可见较快的流速下得到的冼脱峰也宽。流速低洗脱峰窄而高。也就是说，流速较低，分辨率较高，样品稀释较轻。

凝胶过滤层析遇见的问题及分析如下：

1．流速慢：有气泡、出水管阻塞、没打开夹子、柱压太紧（操作压过大、长期使用、接头漏气。

2．柱内产生气泡：上水口不流或皮管破裂，洗脱液外流、接口漏气，如上水口螺丝拧的不紧

3．条带扭曲：胶面不平、样品或洗脱液中有颗粒、装拄不均匀

4．分辩率不高：装拄不均匀、样品量过大、流速太快、拄不垂直或拄不合适、长菌、拄下口软管太长、胶不适当。

凝胶层析主要根据被测样品分子量的差异，在固定相上受到阻滞程度不同而达到分离的目的。分子量大的物质随流动相移动速度较快，先流出层析床，并在记录仪上出现层析峰。反之，分子量小的物质移动速度较慢，后出现层析峰。实验中第一个波峰是蓝色葡聚糖2000kb,后一个则是牛血清蛋白70kb.。

鉴于凝胶层析法的高分离率、高灵敏度及操作简单，保持样品的生物活性等优点，这种方法已广泛应用于大分子物质的去盐、溶液的浓缩、分离提纯及分子