鼠尾直接PCR试剂盒(快速基因型鉴定)
鼠尾鉴定试剂盒操作流程
鼠尾鉴定试剂盒操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!鼠尾鉴定试剂盒是一种用于检测特定鼠尾DNA的实验工具，下面是操作流程：1. 准备工作- 确保实验室环境符合实验要求，如无菌操作、恒温等。
鼠尾鉴定-纯合子鼠鉴定
鼠尾鉴定
操作流程及步骤：
目的：鉴定纯合子小鼠。
按照厂家设定说明书执行。
医大目前方法如下：
1、提前一晚于1.5mlEP管中加入240ul的消化液（三种消化液看不清楚），
1、56℃过夜。
2、15000r/min 离心2min。
3、吸取上清液200ul+200ul butter GB+200ul 无水乙醇。
4、旋转柱下套离心管，将3步液体加入，12000r/min 离心2min，弃去下层
液体。
5、加500ul WA 12000r/min 离心1min，弃去下层液体。
6、加700ul WB 12000r/min 离心1min，弃去下层液体。
7、重复步骤7。
8、12000r/min 离心2min。
9、换新的1.5mlEp管，加40ulEB65℃加热静置5min。
10、5min后12000r/min 离心2min。
11、测DNA浓度。
12、跑PCR，原理同CDNA，机器不同需设定程序根据目的基因和酶的
不同设定解链温度、退火温度、酶合成最佳温度和循环的次数。
参照厂家指定说明书可输入作为程序。
PCR结束后进入琼脂糖凝胶电泳、然后拍
片对照。
心得体会及注意事项：根据目的DNA不同按厂家制定说明书执行。
**最重要的是每个鼠对应标号，在换管等操作中一定一一对应，不可出错。
鼠尾基因型鉴定原理
鼠尾基因型鉴定原理嘿，朋友们！今天咱就来讲讲鼠尾基因型鉴定原理。
你说这鼠尾，平时咱可能都不咋注意，可它里面藏着的秘密可不少呢！想象一下，这鼠尾就像一个小小的神秘世界，等着我们去探索。
那怎么鉴定它的基因型呢？这就好像我们要解开一个谜题一样。
咱先得了解鼠尾里面有啥。
其实啊，鼠尾里有各种遗传物质，这些遗传物质就决定了鼠的基因型。
这就好比是鼠的“身份证”，能告诉我们它到底是啥样的。
然后呢，我们得有一些专门的方法和工具来搞清楚这些遗传物质。
就像是我们要打开一个锁，得找到合适的钥匙一样。
这些方法可能会有点复杂，但别怕呀，只要我们一步一步来，总能搞明白的。
比如说，我们可能要用到一些化学试剂，让鼠尾里的遗传物质显现出来。
这就好像是给这个神秘世界打开了一盏灯，让我们能看清楚里面的东西。
然后再通过一些技术手段去分析、去判断。
你说这是不是很神奇？一个小小的鼠尾，居然能告诉我们这么多信息。
这就好像是在一个看似普通的地方，突然发现了宝藏一样让人惊喜！而且啊，这鼠尾基因型鉴定可不是随便玩玩的，它可有大用处呢！比如说，在科学研究中，我们可以通过它来了解鼠的遗传规律，这对我们研究很多疾病啊、生物特性啊都有很大的帮助。
这不就像我们有了一把万能钥匙，可以打开很多知识的大门吗？再想想，如果我们能熟练掌握这个技术，那我们不就像是掌握了一门独特的技能，在生物领域里可以大显身手啦？这多酷啊！总之呢，鼠尾基因型鉴定原理虽然有点复杂，但只要我们有耐心、有兴趣，就一定能搞清楚。
就像那句话说的，世上无难事，只怕有心人嘛！所以啊，大家可别小瞧了这小小的鼠尾，它里面的学问可大着呢！让我们一起去探索这个神秘的小世界吧！。
鼠尾提取DNA方法
⿏尾提取DNA⽅法转基因⼩⿏筛选——⿏尾提取基因组DNA⽅法1.⼩⿏分笼后打⽿标，剪取⼩⿏尾尖3mm--5mm左右于1.5mL 离⼼管中，标记⽿标号。
2.配置消化液，每管加⼊消化液0.5mL，55℃，3-5h,或放置过夜。
（最长可放置3天）。
3.加1倍体积（0.5mL）PCI(下层液体)，上下颠倒10余次。
（PCI可分装出⼀些现⽤，以免操作不慎污染）。
4.室温15000rpm离⼼，10min。
5.⼩⼼取上清约0.4mL⼊新管，依次标号，加⼊异丙醇0.4mL，上下倒转10次左右。
6.4℃，15000rpm离⼼，5min。
7.弃上清，滤纸吸⼲，加⼊70%⼄醇0.5mL，将管底沉淀弹起，上下颠倒⼏次，洗涤。
8.4℃，15000rpm离⼼，5--7min。
9.弃上清，瞬时离⼼，⽤枪吸⼲剩余液体，后经空⽓⼲燥5-10min。
10.加⼊1*TE 60-170µL⼀般加100µL，振荡30min溶解，于4℃冰箱保存。
注意事项：1.⼩⿏⽿标与管号⼀⼀对应，在剪尾或提取DNA过程中如发⽣混淆，则应重新剪尾。
2.配置消化液时，最后加蛋⽩酶K，配置完成后混合均匀再分装；分装后依次检查，确认每管的⿏尾都浸⼊在消化液中。
尽量多配⼀些消化液，以免不够。
3.提取DNA之前，先检查⿏尾消化情况，过夜消化后，⼀般只能观察到少量⾻骼及⿏尾⽑发，如观察到⿏尾组织，说明消化不完全，可能是时间不够或消化液配置不正确。
4.由于实验中⽤到的PCI，异丙醇等对⾝体有害，因此在提取DNA和配置PCI时，应注意防护，戴好⼝罩和乳胶⼿套。
5.实验过程中，应轻拿轻放，避免液体洒出，沾湿⼿套，洗去Marker笔字迹等情况的发⽣。
为了防⽌⽿标号被擦掉，最好连号摆放。
6.吸取上清⼀步中，应保证上清质量，避免下层杂质的吸⼊，如不慎吸⼊，应将样品重新离⼼。
7.DNA沉淀⼀般呈⽩⾊或半透明胶状，混有杂质时可能带有⿊⾊，提取过程中如观察不到沉淀，应做好标记，重新剪尾。
小鼠IL-10 ELISA试剂盒说明书
小鼠IL-10ELISA试剂盒Mouse IL-10ELISA kitCat#：EMC005尊敬的客户，感谢您选用本公司QuantiCyto®ELISA系列产品。
本产品选用世界著名生产厂家的原料，采用专业体外诊断试剂生产技术制造，仅供科研使用。
本产品可检测血清、血浆、细胞培养上清液、灌洗液、尿液、羊水、腹水、脑脊液、胸腔积液、组织匀浆液等多种类型样本中天然和重组小鼠IL-10浓度，具体适用样本请咨询。
使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分。
如有疑问，请联系欣博盛生物科技有限公司。
Email:**********************，全国服务热线: 4006800892。
QuantiCyto ®EMC005Mouse IL-102试剂盒组成：名称48T 96T 抗体预包被酶标板8×68×12冻干标准品0.5ng /支×2支0.5ng /支×3支标准品&标本通用稀释液12ml×1瓶20ml×1瓶浓缩生物素化抗体1支（规格见标签）1支（规格见标签）生物素化抗体稀释液10ml×1瓶16ml×1瓶浓缩酶结合物1支（规格见标签）1支（规格见标签）酶结合物稀释液10ml×1瓶16ml×1瓶浓缩洗涤液20×25ml×1瓶50ml×1瓶显色底物（TMB ）6ml×1瓶12ml×1瓶反应终止液具腐蚀性6ml×1瓶12ml×1瓶封板胶纸3张6张产品说明书1份1份储存条件：未开封完整试剂盒4℃保存，请在保质期内使用。
已开封试剂盒抗体包被板条未用完的板条放回带拉链铝箔袋，封好口。
4℃条件下可储存1个月左右。
标准品冻干粉-20℃可储存6个月左右。
稀释后的标准品使用后请丢弃。
浓缩生物素化抗体浓缩液4℃可储存1个月左右，稀释后即用即弃。
血管内皮间质样转分化遗传示踪小鼠模型的构建及其在肝纤维化研究中的应用
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ － ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｃｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ
ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｓｔｕｄｉｅｓ
， ， ， ， ， （ ， ＸＵ Ｈａｏ１ ＲＵＡＮ Ｂａｉ１，２ ＬＩ Ｚｈｉｗｅｎ１ ＦＡＮＧ Ｚｈｉｑｉａｎｇ１ ＷＡＮＧ Ｌｉｎ１ ＤＯＵ Ｋｅｆｅｎｇ１ ． １． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｎｄ ， ， ， ’ ， ； ， Ｓｐｌｅｎｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ Ｘｉｊｉｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ａｉｒ Ｆｏｒｃｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｘｉ ａｎ ７１００３２ Ｃｈｉｎａ ２． Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｅｒｏｓｐａｃｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ， ， ’ ， ） Ａｅｒｏｓｐａｃｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ａｉｒ Ｆｏｒｃｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｘｉ ａｎ ７１００３２ Ｃｈｉｎａ ： ， （ ： ） Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ ＤＯＵ Ｋｅｆｅｎｇ ｄｏｕｋｅｆ＠ ｆｍｍｕ． ｅｄｕ． ｃｎ ＯＲＣＩＤ ００００ － ０００２ － ８８５７ － ５６６３
ｌｅｃｔｅｄ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｄＴｏｍａｔｏ ａｎｄ ｅＧＦＰ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｆｔｅｒ ｂｅｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ
， ｂｙ ｔａｍｏｘｉｆｅｎ ＬＳＥＣｓ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｃｄｈ５ － ＣｒｅＥＲＴ ／ Ａｃｔａ２ － ＫＩ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｃｉｎｇ ｍｉｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｅＧＦＰ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ － ， ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈｏｕｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｔｄＴｏｍａｔｏ ａｌｏｎｅ． Ｃｏｎｃｌｕ
鼠尾鉴定操作步骤
小鼠基因鉴定（KO鼠）1．实验原理：小鼠基因鉴定示意图（1）野生型小鼠，无法p出p1p3片段，且p1p2片段相对于KO型的要小。
（2）杂合KO小鼠，有p1p3产物，但p1p2产物有两条带。
（3）纯合KO小鼠，能p出p1p3产物，且p1p2结果片段较大。
注：p1p3600bp左右，p1p21000bp左右2．实验操作步骤（1）剪子鼠尾（脚趾）：2-3mm1酒精灯、剪子、镊子、1.5EP管、EP管板子、marker笔等（2）小鼠DNA提取：1组织消化：将配置好的消化buffer（裂解液）分别加入到，装有小鼠组织的1.5mlEP管内，每管500ul。
然后按1:500的比例加入蛋白酶K（即每支加入1ul）。
混匀后，55℃水浴消化过夜。
2蛋白酶灭活处理：将过夜消化的样品100℃煮沸，5min。
然后25℃，12000g，离心5-10min。
3苯酚氯仿处理：提前准备好相应数量的1.5mlEP管，每支管中分别加入200ul苯酚和氯仿（抽提液）。
将离心好的样品拿出，每管吸出400-450ul上清转移到相应加入苯酚和氯仿的EP管中。
（尽可能多吸，但保证不能吸到下边沉淀，每管体积一样。
）之后用力摇晃2-3min，避免摇晃过程中将标记磨损掉。
然后25℃，12000g，离心10min。
4等体积氯仿处理：提前准备好相应数量的1.5mlEP管，每支管中分别加入400ul氯仿（等体积氯仿）。
将离心好的样品拿出，每管吸出400ul（视情况而定）上层液体转移到相应加入氯仿的EP管中。
（尽可能多吸，但保证不能吸到下层液体及夹层蛋白，可管子斜置，方便吸取。
每管体积一样。
）用力摇晃2-3min，避免摇晃过程中将标记磨损掉。
然后25℃，12000g，离心10min。
5无水乙醇处理：提前准备好相应数量的1.5mlEP管，每支管中分别加入1ml无水乙醇（2.5倍体积无水乙醇）。
将离心好的样品拿出，每管吸出400ul（视情况而定）上层液体转移到相应加入无水乙醇的EP管中。
鼠尾直接PCR试剂盒的说明
鼠尾直接PCR试剂盒的说明
的从鼠尾、小鼠耳朵样本中释放出基因组DNA，用于PCR 反应，因此特别适合大规模基因检测。
裂解缓冲液释放基因组DNA过程在室温65°C条件下10-30 min内完成，不需加热处理，不需要其他去蛋白、RNA等的过程，即可将释放出的微量DNA作为模板进行PCR反应。
D-Taq DNA polymerase是Foregene为直接PCR反应专门研制出的DNA polymerase。
D-Taq DNA polymerase对多种PCR 反应抑制剂具有极强的的耐受性、在各种复杂反应体系中均能扩增痕量的DNA，扩增速度可达2Kb/min，特别适合进行直接PCR反应。
鼠尾直接PCR试剂盒的应用：
1.鼠尾直接PCR试剂盒适用范围：各类实验室小鼠或大鼠。
2.样本裂解释放的DNA：仅用作PCR模板。
3.试剂盒可用于以下用途：转基因型鉴定、基因分型等。
不同月龄A53T小鼠背根神经节中α-Syn表达变化
第59卷 第3期2023年06月青岛大学学报(医学版)J O U R N A LO FQ I N G D A O U N I V E R S I T Y (M E D I C A LS C I E N C E S)V o l .59,N o .3J u n e 2023[收稿日期]2022-09-01; [修订日期]2023-05-23[基金项目]国家自然科学基金面上项目(32171131)[第一作者]韩帆(1997-),女,硕士研究生㊂[通信作者]陈曦(1980-),女,博士,副教授,硕士生导师㊂E -m a i l :c a s e y1201@163.c o m ㊂不同月龄A 53T 小鼠背根神经节中α-S yn 表达变化韩帆,焦倩,杜希恂,阎春玲,姜宏,陈曦(青岛大学国家生理学重点(培育)学科,山东青岛 266071)[摘要] 目的 探讨不同月龄A 53T 转基因(A 53T )小鼠脊髓背根神经节(D R G )中α-突触核蛋白(α-S yn )表达水平的变化㊂方法 6月龄和12月龄野生型(WT )小鼠和A 53T 小鼠经乌拉坦腹腔麻醉后处死,在体视显微镜下取出胸段㊁腰段和荐段的D R G 组织,采用蛋白免疫印迹法检测D R G 中α-S y n 的表达水平㊂结果 与相同月龄WT 小鼠相比,6月龄及12月龄A 53T 小鼠D R G 中α-S yn 表达量显著增加(F =59.164㊁55.681,P <0.01);与6月龄A 53T 小鼠相比,12月龄A 53T 小鼠D R G 中α-S yn 的表达量显著增加(F =13.802,P <0.05)㊂结论 A 53T 小鼠D R G 中α-S yn 表达量高于同月龄WT 小鼠,且其表达量随年龄增长而增加㊂[关键词] α突触核蛋白;帕金森病;小鼠,转基因;神经节,脊[中图分类号] R 338.2 [文献标志码] A [文章编号] 2096-5532(2023)03-0337-04d o i :10.11712/jm s .2096-5532.2023.59.075[开放科学(资源服务)标识码(O S I D )][网络出版] h t t ps ://k n s .c n k i .n e t /k c m s 2/d e t a i l /37.1517.R.20230719.1618.003.h t m l ;2023-07-20 14:53:22E X P R E S S I O NO Fα-S Y N U C L E I NI N T H E D O R S A L R O O T G A N G L I O N O FA 53T M I C E W I T H D I F F E R E N T A G E SI N M O N T H S HA N F a n ,J I A OQ i a n ,D UX i x u n ,Y A NC h u n l i n g ,J I A N G H o n g ,C H E N X i (S t a t eK e yD i s c i p l i n e :P h y s i o l o g y (i n I n c u b a -t i o n ),D e p a r t m e n t o f P h y s i o l o g y ,Q i n g d a oU n i v e r s i t y ,Q i n gd a o 266071,C h i n a )[A B S T R A C T ] O b je c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h ee x p r e s s i o n l e v e l of α-s y n u c l e i n (α-S y n )i nt h ed o r s a l r o o tg a n g l i o n (D R G )o f A 53Tt r a n s g e n i cm i c ew i t hd i f f e r e n t a g e s i nm o n th s . M e t h o d s Wi l d -t y p e (WT )m i c ea n dA 53T m i c e ,a ge d6o r 12m o n t h s ,w e r e s a c r if i c e da f t e r i n t r a p e r i t o n e a l a n e s t h e s i aw i t hu r e t h a n e .D R Gt i s s u es a m p l e so f t h e t h o r a c i c ,l u m b a r ,a n ds a c r a l s eg m e n t s w e r e c o l l e c t e d u n d e r a s t e r e o m i c r o s c o p e ,a n dW e s t e r n b l o t t i n g w a s u s e d t om e a s u r e th e e x p r e s si o n l e v e l o f α-S yn . R e s u l t s C o m -p a r e dw i t h t h eWT m i c ew i t h t h e s a m e a g e i nm o n t h s ,t h eA 53T m i c e a g e d 6o r 12m o n t h s h a d a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n t h e e x p r e s -s i o n l e v e l o f α-S y n i nD R G (F =59.164,55.681;P <0.01).C o m p a r e dw i t h t h eA 53T m i c e a g e d 6m o n t h s ,t h eA 53T m i c e a ge d 12m o n t h sh a d a s i g n if i c a n t i n c r e a s e i n t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f α-S y n i nD R G (F =13.802,P <0.05). C o n c l u s i o n A 53T m i c e h a v e a h igh e r e x p r e s si o n l e v e l o f α-S y n i nD R Gt h a n WT m i c ew i t h t h e s a m ea g e i n m o n t h s ,a n d t h ee x p r e s s i o n l e v e l o f α-S y n i n c r e a s e s w i t ha ge .[K E Y W O R D S ] a l p h a -s y n u c l e i n ;P a r k i n s o nd i s e a s e ;m i c e ,t r a n s g e n i c ;g a n g l i a ,s pi n a l 帕金森病(P D )是一种主要影响运动功能的神经退行性疾病,其发病率随着年龄增加而逐渐上升[1-3]㊂目前,P D 发生的确切原因和机制仍不完全清楚,但大量研究表明,基因突变是重要的因素之一[4-7]㊂A 53T 转基因(A 53T )小鼠是一种常见的P D 模型小鼠,其体内携带的人类A 53T 突变型α-突触核蛋白(α-S y n )基因可改变α-S y n 的结构,使原本可溶性的α-S y n 单体转变为不溶性的多聚体,可在动物体内重现由α-S yn 聚集起始的P D 病理过程[8-12]㊂根据B R A A K 学说可知,胃肠道可能是α-S y n 发生病变的起始部位[13-16],且这些病理性α-S yn 会通过外周神经系统逐渐向中枢传播[17]㊂已有大量实验证实迷走神经在α-S y n 的肠-脑传播中承担主要作用,但是消化道与中枢之间还存在其他神经联络,如交感神经,其传入纤维的胞体主要汇聚在脊髓背根神经节(D R G )中㊂为明确D R G 中是否也存在着α-S yn 高表达,本实验观察了不同月龄A 53T 小鼠D R G 中α-S y n 的含量变化,从而为交感神经传入纤维参与α-S y n 从胃肠道传播至中枢的可能作用提供证据㊂现将结果报告如下㊂1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 实验动物 A 53T 小鼠(品系名称:B 6;C 3-T g (P r n p-S N C A *A 53T )83V l e /J ),S P F 级,购于南京大学模式动物研究所㊂小鼠饲养于清洁级动物房中,可自由进食饮水,饲养环境为光照模拟自然昼夜节律,12h 明暗交替,温度保持在20~24ħ,相Copyright ©博看网. All Rights Reserved.338青岛大学学报(医学版)59卷对湿度保持在40%~60%㊂选用6月龄和12月龄的纯合子A53T小鼠作为实验组,同窝相同月龄的野生型(WT)小鼠作为对照组㊂1.1.2试剂α-S y n抗体㊁β-t u b u l i n抗体购于美国C e l l S i g n a l i n g T e c h n o l o g y公司;山羊抗兔和山羊抗鼠抗体购于英国T h e r m oF i s h e rS c i e n t i f i c公司;0.45μm P V D F转印膜㊁E C L化学发光液均购于美国M i l l i p o r e公司:R I P A裂解液购于中国C o m W i n B i o t e c h公司㊂A53T小鼠基因型鉴定P C R试剂盒购于中国V a z y m e生物科技有限公司㊂1.2实验方法1.2.1 A53T小鼠基因鉴定 A53T纯合子小鼠由A53T杂合子小鼠配种育得,饲养至1月龄进行分笼和鉴定㊂于尾尖部截取0.5c m长鼠尾组织提取D N A,按照试剂盒(T a q P r o H S U+P r o b e M a s t e r M i x,V a z y m e生物科技有限公司)说明配制实时荧光定量P C R反应体系并进行实验㊂根据P C R数据计算әC t值,通过比较实验组与对照组纯合子目的基因的әC t值,确定基因型㊂1.2.2蛋白免疫印迹法检测D R G中α-S y n表达小鼠经乌拉坦腹腔麻醉处死后取出脊柱,于体视显微镜下取出胸段㊁腰段和荐段的D R G组织放入E P 管中,先用剪刀将组织剪碎,再加入配制好的R I P A 裂解液,充分磨碎组织㊂冰上静置裂解30m i n后,应用高速离心机在4ħ下以12000r/m i n离心20m i n,吸取上清液转移至新的1.5m L E P管中,利用B C A试剂盒和酶标仪进行蛋白质定量,计算上样量㊂按比例加入l o a d i n g b u f f e r,充分混匀,100ħ煮沸10m i n使蛋白充分变性,-20ħ冻存㊂蛋白样品经S D S-P A G E电泳(90V㊁30m i n,120V㊁60m i n)分离后,湿法转至孔径为0.45μm的P V D F 膜上,按蛋白M a r k e r将目标蛋白裁剪出来,经脱脂奶粉封闭㊁一抗孵育㊁H R P-I g G二抗孵育后,用T B S T缓冲液洗净,将膜与E C L超敏发光液反应后置于凝胶成像系统内进行观察并拍摄图像㊂采用I m a g e J分析软件对蛋白条带进行灰度计算,目的蛋白表达水平以α-S y n和β-t u b u l i n g条带灰度值的比值表示㊂1.3统计学处理应用S P S S25.0软件进行统计学处理㊂小鼠D R G中α-S y n的表达量以 xʃs表示,不同月龄WT和A53T小鼠D R G中α-S y n表达水平比较采用析因设计的方差分析,P<0.05表示差异具有统计学意义㊂2结果2.1 A53T小鼠鉴定P C R结果显示,对照组和实验组纯合子目的基因әC t平均值分别为5.84ʃ0.57和6.11ʃ0.47㊂әC t值大于对照组纯合子目的基因әC t值的小鼠为A53T纯合子小鼠㊂共选取10只A53T纯合子小鼠进行实验㊂2.2不同月龄WT和A53T小鼠D R G中α-S y n表达比较蛋白免疫印迹法检测结果显示,6月龄WT组(n=6)㊁6月龄A53T组(n=6)㊁12月龄WT组(n=4)和12月龄A53T组(n=4)小鼠D R G中α-S y n表达水平分别为0.18ʃ0.07㊁1.09ʃ0.21㊁0.46ʃ0.22和1.63ʃ0.35㊂析因设计方差分析结果显示: F月龄=17.417,P<0.01;F组别=112.168,P<0.01; F月龄ˑ组别=1.727,P>0.05㊂与同月龄WT组小鼠相比,6月龄㊁12月龄A53T组小鼠D R G中α-S y n 表达量显著增高,分别增加了505.56%和254.35%,差异均具有统计学意义(F=59.164㊁55.681,P< 0.01);12月龄A53T组小鼠D R G中α-S y n表达量比6月龄A53T组小鼠增加了50.46%,两组相比差异具有统计学意义(F=13.802,P<0.05)㊂表明A53T小鼠D R G中α-S y n的表达远高于同月龄WT小鼠,且随年龄的增长,其表达量增加㊂3讨论大量临床数据表明,在典型的P D运动症状出现之前,胃肠道功能障碍就已经在P D病人身上长期存在,包括便秘㊁胃轻瘫等[18-24]㊂德国的B R A A K 教授于2003年提出了经典的P D分期学说,该学说指出胃肠道是病理性α-S y n蛋白传播的起源地,并且通过肠脑轴逐渐蔓延至中枢神经系统[25-26]㊂其中,α-S y n通过迷走神经传播进入迷走神经运动背核(D MV)是肠脑轴传播的重要组成部分㊂后续有实验表明,迷走神经切断术可以使P D的发展进程大幅减缓,并且使P D的患病风险大大降低[27-30]㊂但该法仍不能完全杜绝P D,这提示α-S y n在胃肠与中枢之间传播可能还有其他的通道㊂支配消化道的神经除迷走神经外,还有交感神经,其传入纤维的胞体主要汇聚在脊髓D R G中,可感受消化道内机械刺激(如管壁扩张㊁胃肠道蠕动等)㊁化学刺激(如管Copyright©博看网. All Rights Reserved.3期韩帆,等.不同月龄A53T小鼠背根神经节中α-S y n表达变化339腔内毒性物质㊁酸碱度等)以及温度的变化等,并将这些信息传入中枢神经系统㊂与迷走神经类似,交感神经在消化道和中枢神经系统之间也起桥梁作用,那么它是否在α-S y n的传播过程中起某些作用呢?本研究对此进行了探讨㊂本实验选取小鼠胸椎㊁腰椎和荐椎处的D R G 组织进行检测,来自消化道的交感神经传入纤维主要通过以上部位进入脊髓,可充分反映交感神经传入纤维在病理性α-S y n肠脑传播中的作用㊂实验结果显示,与同月龄WT组小鼠相比,6月龄㊁12月龄A53T组小鼠D R G中α-S y n表达量显著增加,且随年龄的增长,A53T小鼠D R G中α-S y n表达量会进一步增加,表明交感神经中确实存在病理性α-S y n㊂值得注意的是,本实验所取组织来源于A53T小鼠,该小鼠是一种携带人类A53T突变型α-S y n基因的P D模型小鼠,其体内存在广泛的人A53T突变型α-S y n过表达㊂那么,本实验中小鼠D R G中α-S y n 增多的原因,是否仅与该部位的基因突变相关呢?已有实验表明,3月龄A53T小鼠小肠组织中α-S y n 的表达已经明显升高,且出现了消化道功能障碍,但此时中枢神经系统内并未出现病理性的α-S y n,此种情况甚至会持续到6月龄以后,提示老龄A53T 小鼠中枢病理性α-S y n的增多可能亦与该蛋白从外周至中枢的传播有关[31-33]㊂故作者推测A53T小鼠D R G中α-S y n的增多也可能与交感神经在此传播过程中的作用相关㊂有其他研究也报道了交感神经的可能作用,如P D病人肾上腺中存在α-S y n的沉积,肾上腺髓质中包含由交感神经胞体组成的神经节,在这些神经节及发出的神经纤维中均观察到α-S y n聚集的现象[34-35];在膀胱和生殖器官附近的交感神经神经节中同样出现了路易小体[24,36]㊂这些证据均表明交感神经可能参与了P D进展,并且可能与病理性α-S y n的传播有关㊂综上所述,A53T小鼠D R G中α-S y n的表达量显著增加,且其表达量随年龄的增长同步上升,提示交感神经在P D进展中可能发挥作用㊂本实验结果可为P D发生机制研究提供实验依据,同时为通过阻断α-S y n由外周向中枢传播来治疗P D提供了新的思路㊂[参考文献][1]W E R N E R M H,O L A N OW C W.P a r k i n s o n s d i s e a s em o d i f i-c a t i o n t h r o u g h a b l k i n a s e i n h i b i t i o n:a n o p p o r t u n i t y[J].M o v e-m e n tD i s o r d e r s:O f f i c i a lJ o u r n a lo ft h e M o v e m e n t D i s o r d e rS o c i e t y,2022,37(1):6-15.[2]T O L O S AE,G A R R I D O A,S C HO L ZS W,e t a l.C h a l l e n g e si n t h e d i a g n o s i s o f P a r k i n s o n s d i s e a s e[J].T h eL a n c e tN e u r o-l o g y,2021,20(5):385-397.[3]L IG,MAJF,C U I SS,e t a l.P a r k i n s o n s d i s e a s e i nC h i n a:a f o r t y-y e a r g r o w i n g t r a c ko fb e d s i d ew o r k[J].T r a n s l a t i o n a lN e u r o d e g e n e r a t i o n,2019,8:22.[4]F A R R OW SL,S C H I E R D I N G W,G O K U L A D H A SS,e t a l.E s t a b l i s h i n gg e n er e g u l a t o r y n e t w o r k sf r o m P a r k i n s o n sd i-s e a s e r i s k l o c i[J].B r a i n:aJ o u r n a lo fN e u r o l o g y,2022,145(7):2422-2435.[5]Z H O USQ,T I A N Y,S O N GXJ,e t a l.B r a i n p r o t e o m e-w i d ea n dt r a n s c r i p t o m e-w i d ea s s o-c i a t i o ns t u d i e s,B a y e s i a nc o l o c a-l i z a t i o n,a n d M e n d e l i a nr a n d o m i z a t i o na n a l y s e sr e v e a lc a u s a lg e n e s o f P a r k i n s o n s d i s e a s e[J].T h e J o u r n a l s o fG e r o n t o l o g yS e r i e sA,B i o l o g i c a lS c i e n c e sa n d M e d i c a lS c i e n c e s,2023,78(4):563-568.[6]Y IM H,L IJX,J I A N SJ,e ta l.Q u a n t i t a t i v ea n dc a u s a la n a l y s i s f o r i n f l a mm a t o r y g e n e s a n d t h e r i s k o f P a r k i n s o n s d i-s e a s e[J].F r o n t i e r s i n I mm u n o l o g y,2023,14:1119315. [7]Y E H,R O B A KLA,Y U M G,e t a l.G e n e t i c s a n d p a t h o g e-n e s i s o f P a r k i n s o n s s y n d r o m e[J].A n n u a l R e v i e wo f P a t h o l o-g y,2023,18:95-121.[8]K I L P E LÄI N E N T,J U L K U U H,S V A R C B A H S R,e ta l.B e h a v i o u r a l a n dd o p a m i n e r g i cc h a n g e s i nd o u b l e m u t a t e dh u-m a nA30P*A53Ta l p h a-s y n u c l e i nt r a n s g e n i cm o u s em o d e l o f P a r k i n s o n s d i s e a s e[J].S c i e n t i f i cR e p o r t s,2019,9(1):17382.[9]Z H O N GJX,T A N G G,Z HUJC,e t a l.S i n g l e-c e l l b r a i n a t-l a s o f P a r k i n s o n sd i s e a s em o u s em o d e l[J].J o u r n a l o fG e n e-t i c s a n dG e n o m i c s,2021,48(4):277-288.[10]A B E L I O V I C H A,R H I N N H.P a r k i n s o n sd i s e a s e:g u i l tb yg e n e t i c a s s o c i a t i o n[J].N a t u r e,2016,533(7601):40-41.[11]H A R V E YBK,WA N G Y,HO F F E RBJ.T r a n s g e n i c r o d e n tm o d e l s o f P a r k i n s o n sd i s e a s e[J].A c t aN e u r o c h i r u r g i c aS u p-p l e m e n t,2008,101:89-92.[12]G I A S S O NBI,D U D AJE,Q U I N NS M,e t a l.N e u r o n a l a l-p h a-s y n u c l e i n o p a t h y w i t hs e v e r e m o v e m e n td i s o r d e ri n m i c ee x p r e s s i n g A53Th u m a n a l p h a-s y n u c l e i n[J].N e u r o n,2002,34(4):521-533.[13]Z E N GJQ,WA N G XC,P A N F,e t a l.T h e r e l a t i o n s h i p b e-t w e e nP a r k i n s o n sd i s e a s ea n d g a s t r o i n t e s t i n a ld i s e a s e s[J].F r o n t i e r s i nA g i n g N e u r o s c i e n c e,2022,14:955919.[14]J O N E S JD,R A HMA N IE,G A R C I AE,e t a l.G a s t r o i n t e s t i-n a l s y m p t o m s a r e p r e d i c t i v e o f t r a j e c t o r i e s o f c o g n i t i v e f u n c t i o-n i n g i nd en o v oP a r k i n s o n sd i s e a s e[J].P a r k i n s o n i s m&R e-l a t e dD i s o r d e r s,2020,72:7-12.[15]P I E T R U C C ID,C E R R O N IR,U N I D A V,e t a l.D y s b i o s i s o fg u tm i c r o b i o t a i n a s e l e c t e d p o p u l a t i o no f P a r k i n s o n s p a t i e n t s[J].P a r k i n s o n i s m&R e l a t e dD i s o r d e r s,2019,65:124-130.[16]V A N D E NB E R G EN,F E R R E I R A N,G R AM H,e t a l.E v i-d e n c e f o r b i d i r e c t i o n a l a n d t r a n s-s y n a p t i c p a r a s y m p a t h e t i c a n dCopyright©博看网. All Rights Reserved.340青岛大学学报(医学版)59卷s y m p a t h e t i c p r o p a g a t i o no fa l p h a-s y n u c l e i ni nr a t s[J].A c t a N e u r o p a t h o l o g i c a,2019,138(4):535-550.[17]Z HU X L,L IB,L O U PC,e t a l.T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e nt h e g u tm i c r o b i o m e a n d n e u r o d e g e n e r a t i v e d i s e a s e s[J].N e u r o-s c i e n c eB u l l e t i n,2021,37(10):1510-1522.[18]W I S H A R T S,MA C P H E E G J A.E v a l u a t i o na n d m a n a g e-m e n t o f t h en o n-m o t o rf e a t u r e so fP a r k i n s o n sd i s e a s e[J].T h e r a p e u t i cA d v a n c e s i nC h r o n i cD i s e a s e,2011,2(2):69-85.[19]H E I M R I C H K G,S C HÖN E N B E R G A,S A N T O S-G A R CÍAD,e t a l.T h e i m p a c t o f n o n m o t o r s y m p t o m s o nh e a l t h-r e l a t e d q u a l i t y o f l i f e i nP a r k i n s o n sd i s e a s e:an e t w o r ka n a l y s i sa p-p r o a c h[J].J o u r n a l o fC l i n i c a lM e d i c i n e,2023,12(7):2573.[20]S E P P IK,R A Y C H A U D HU R IK,C O E L H O M,e t a l.U p-d a t eo nt re a t m e n t sf o rn o n m o t o rs y m p t o m so fP a r k i n s o n sd i se a s e-a ne v i d e n c e-b a s e dm e d i c i n e r e v i e w[J].M o v e m e n tD i-s o r d e r s:O f f i c i a lJ o u r n a lo ft h e M o v e m e n tD i s o r d e rS o c i e t y, 2019,34(2):180-198.[21]Z I E M S S E N T,R E I C HMA N N H.N o n-m o t o rd y s f u n c t i o ni nP a r k i n s o n sd i s e a s e[J].P a r k i n s o n i s m&R e l a t e d D i s o r d e r s, 2007,13(6):323-332.[22]WA K A B A Y A S H IK,T A K A H A S H IH,T A K E D A S,e t a l.P a r k i n s o n sd i s e a s e:t h e p r e s e n c eo fL e w y b o d i e si n A u e r-b ac h sa nd Me i s s n e r s p l e x u s e s[J].A c t aN e u r o p a t h o l o g i c a,1988,76(3):217-221.[23]Z H O U Y T,S U YS,X U W H,e t a l.C o n s t i p a t i o n i n c r e a s e sd i s a b i l i t y a n d de c r e a s e sd o p a m i n el e v e l si nt h en i g r o s t r i a t a ls y s t e m t h r o u g h g a s t r i c i n f l a mm a t o r y f a c t o r s i n P a r k i n s o n sd i se a s e[J].C u r r e n t N e u r o v a s c u l a r R e s e a r c h,2019,16(3):241-249.[24]Z H O N GCB,C H E N Q Q,H A I K A LC,e t a l.A g e-d e p e n d e n ta l p h a-s y n u c l e i na c c u m u l a t i o na n d p h o s p h o r y l a t i o n i nt h ee n t e-r i cn e r v o u s s y s t e mi n a t r a n s g e n i cm o u s em o d e l o f P a r k i n s o n sd i se a s e[J].N e u r o s c i e n c eB u l l e t i n,2017,33(5):483-492.[25]H AWK E SC H,D E L T R E D I C IK,B R A A K H.P a r k i n s o n sd i se a s e:a d u a l-h i t h y p o t h e s i s[J].N e u r o p a t h o l o g y a n dA p p l i e dN e u r o b i o l o g y,2007,33(6):599-614.[26]A R M S T R O N G MJ,O K U N M S.D i a g n o s i s a n d t r e a t m e n t o fP a r k i n s o nd i s e a s e:ar e v i e w[J].J AMA,2020,323(6):548-560.[27]K I M S,KWO NSH,K AM TI,e t a l.T r a n s n e u r o n a l p r o p a-g a t i o no f p a t h o l o g i cα-s y n u c l e i n f r o mt h e g u t t o t h eb r a i n m o-d e l sP a r k i n s o n sd i s e a s e[J].N e u r o n,2019,103(4):627-641.e7.[28]S V E N S S O NE,HO R VÁT H-P UHÓE,T HOM S E NR W,e ta l.V a g o t o m y a n ds ub s e q u e n t r i s ko fP a r k i n s o n sd i s e a s e[J].A n n a l s o fN e u r o l o g y,2015,78(4):522-529.[29]R E D D YMA S USC,B O N I N OJ,M C C A L L UM R W.G a s t r o-p a r e s i s s e c o n d a r y t o a d e m y e l i n a t i n g d i s e a s e:a c a s e s e r i e s[J].B M CG a s t r o e n t e r o l o g y,2007,7:3.[30]L I U BJ,F A N G F,P E D E R S E N N L,e ta l.V a g o t o m y a n dP a r k i n s o nd i s e a s e:a S w e d i s hr e g i s t e r-b a s e d m a t c h e d-c o h o r t s t u d y[J].N e u r o l o g y,2017,88(21):1996-2002. [31]S A L AWU FK,D A N B U R AM A,O L O K O B A AB.N o n-m o-t o r s y m p t o m s o f P a r k i n s o n sd i s e a s e:d i a g n o s i sa n d m a n a g e-m e n t[J].N i g e r i a nJ o u r n a l o fM e d i c i n e:J o u r n a l o f t h eN a t i o-n a lA s s o c i a t i o no fR e s i d e n tD o c t o r so fN i g e r i a,2010,19(2): 126-131.[32]K U O Y M,L I ZS,J I A O Y,e t a l.E x t e n s i v e e n t e r i c n e r v o u ss y s t e ma b n o r m a l i t i e s i n m i c e t r a n s g e n i c f o ra r t i f i c i a l c h r o m o-s o m e s c o n t a i n i n g P a r k i n s o nd i s e a s e-a s s o c i a t e da l p h a-s y n u c l e i ng e n e m u t a t i o n s p r e c e d ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m c h a n g e s[J].H u m a n M o l e c u l a rG e n e t i c s,2010,19(9):1633-1650.[33]R O T AL,P E L L E G R I N I C,B E N V E N U T I L,e t a l.C o n s t i p a-t i o n,d e f i c i t i nc o l o nc o n t r a c t i o n sa n da l p h a-s y n u c l e i ni n c l u-s i o n sw i t h i n t h e c o l o n p r e c e d em o t o r a b n o r m a l i t i e s a n dn e u r o-d e g e n e r a t i o n i n t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m i n am o u s em o d e l o fa l p h a-s y n u c l e i n o p a t h y[J].T r a n s l a t i o n a l N e u r o d e g e n e r a t i o n,2019,8:5.[34]WA K A B A Y A S H IK,H A N S E NLA,MA S L I A H E.C o r t i c a lL e w y b o d y-c o n t a i n i n g n e u r o n sa r e p y r a m i d a l c e l l s:l a s e r c o n-f o c a l i m ag i n g o f d o u b l e-i mm u n o l a b e l e ds e c t i o n sw i t ha n t i-u b i-q u i t i na n dS M I32[J].A c t a N e u r o p a t h o l o g i c a,1995,89(5): 404-408.[35]F UM I MU R AY,I K E MU R A M,S A I T OY,e t a l.A n a l y s i s o ft h e a d r e n a l g l a n d i su s e f u l f o r e v a l u a t i n gp a t h o l o g y o f t h e p e-r i p h e r a l a u t o n o m i cn e r v o u ss y s t e mi nl e w y b o d y d i s e a s e[J].J o u r n a l o f N e u r o p a t h o l o g y a n d E x p e r i m e n t a l N e u r o l o g y, 2007,66(5):354-362.[36]B E A C H TG,A D L E RC H,S U EL I,e t a l.M u l t i-o r g a nd i s-t r i b u t i o no f p h o s p h o r y l a t e da l p h a-s y n u c l e i nh i s t o p a t h o l o g y i n s u b j e c t sw i t hL e w y b o d y d i s o r d e r s[J].A c t aN e u r o p a t h o l o g i c a, 2010,119(6):689-702.(本文编辑马伟平)医学学术论文引言的写作引言是论文主体部分最前面的一段小短文,主要是起提纲挈领的作用,让读者了解本文研究的目的㊁范围和结果等信息,以引导读者阅读㊂引言的主要内容包括立题的缘由㊁背景和依据,研究方法和预期目的,以及本文创新价值和意义等㊂其叙述顺序如下㊂①缘由:提出一个问题(想到或遇到的);②背景:交代有关研究的历史和现状;③方法:用什么方法进行研究;④目的:达到什么目的㊂要求重点突出,评价客观,少用套话,勿与摘要雷同,首尾呼应㊂篇幅一般以200~300字为宜,不宜把引言写成小综述㊂Copyright©博看网. All Rights Reserved.。
pcr 鉴定 菌种 试剂盒 原理
聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中常用的技术，用于放大特定的DNA序列。
PCR是一种强大的工具，用于鉴定和表征微生物种类，并且广泛用于微生物诊断和研究。
PCR的一个关键应用是鉴定细菌和真菌物种。
基于PCR的鉴定涉及使用特定引物，这些引物靶向微生物基因组的保守区域，从而使特定物种的DNA序列得到放大。
这使得可以直接从各种样本（如临床标本、环境样本和食品产品）中检测和鉴定微生物。
执行PCR-based鉴定微生物物种时，通常使用专门的试剂盒和试剂。
这些试剂盒通常包含PCR的所有必需成分，包括DNA聚合酶、核苷酸、缓冲液和特定于目标微生物物种的引物。
选择适当的PCR试剂盒对于成功鉴定微生物物种至关重要，因为它确保了PCR反应的特异性和灵敏性。
基于PCR的微生物物种鉴定的原理涉及几个关键步骤。
从样本中提取DNA并纯化以去除可能干扰PCR反应的杂质和抑制剂。
然后将纯化后的DNA用作PCR反应的模板，PCR反应包括多个循环的DNA变性、引物结合和DNA延伸。
这样会放大与感兴趣的微生物物种特异性的目标DNA序列。
PCR-based鉴定微生物物种应用的一个例子是在传染病诊断中。
在临床微生物学中，广泛使用PCR快速准确地检测病原微生物，包括细菌、病毒和真菌，从患者样本中。
基于PCR的鉴定可为临床医生提供有价值的信息，以便及时和有针对性地治疗传染病，从而改善患者的预后。
除了临床诊断，基于PCR的微生物物种鉴定还用于环境微生物学，用于监测和监测各种生态系统中的微生物裙落。
通过鉴定和表征环境样本中存在的微生物物种，研究人员可以深入了解微生物裙落的多样性和功能，以及它们与环境的相互作用。
基于PCR的微生物物种鉴定是一种强大而多功能的工具，在微生物学中应用广泛。
具体试剂盒和试剂的使用，结合PCR的原理，可以准确和敏感地从各种样本中鉴定细菌和真菌物种。
无论在临床诊断、环境监测还是研究中，基于PCR的鉴定在推动我们对微生物多样性及其对人类健康和环境的影响的理解方面起着至关重要的作用。
基因型鉴定
一、基因型鉴定p r o t o c o l1、剪尾取样及编号从鼠房取出需要基因型鉴定的小鼠（由于小鼠一般在21天时已经断奶，故小鼠剪尾的时间应不小于三周），查看鼠箱上的基因信息，根据基因信息从编号笔记本上找出相应编号，续编。
①在EP管上预先写明小鼠编号②从鼠箱中取出老鼠（戴上手套后用手抓住小鼠尾部向上提出，提住鼠尾不放，将小鼠慢慢放至实验台上，此时小鼠会向前爬动，用另一只手从背侧捏住小鼠背部皮肤，要注意捏的位置尽量靠近颈的上部，防止小鼠的头部扭动），从小鼠尾端用剪刀剪下3mm左右鼠尾（不可超过5mm,会使小鼠受伤），将剪下的样品放入对应编号的EP管内，用电烙铁烫及小鼠尾部剪口处，一定要使伤口烫合，防止其流血不止。
然后对小鼠进行鼠耳编号。
（注意：编号时要记录小鼠的性别）2、DNA提取①向每只含样品的EP管内加入400微升消化液（含蛋白酶K），将其置于混合仪上消化，55℃（此温度下DNA在水中的溶解度最高，即最为稳定），3h。
②向消化后的样品中加入400微升异丙醇，反复颠倒，一般可见絮状分层（个别样品看不到）。
之后放至离心机13000r，10min。
③去上清，加入750微升70%乙醇，13000r，10min。
重复此操作一次。
④去上清，将EP管倒置于吸水纸上或置于空气中晾干。
(最好晾干，倒置在吸水纸上有可能会使一部分DNA流失)3、PCR(例，三转小鼠，做三次PCR，每次PCR针对的基因不同，所用引物不同，每次PCR做样品数+3（空对照：不加模板；正对照：突变型小鼠的样品；负对照：野生型小鼠的样品）个体系)。
单个体系如下：ddW 1810*buffer （含Mg2+）dNTPPrimer R(20μM)Primer F(20μM)Taq酶Template 1程序：94℃预热 ~ 4min94℃变性 ~ 1min61℃ 退火 ~ 1min 30个循环72℃ 延伸 ~ 1min72℃ ~ 7min4℃ ~ hold注意盖子盖紧。
鼠尾鉴定结果分析
鼠尾鉴定结果分析碱法提取鼠尾D N A及基因鉴定结果分析:一、实验器材:加样枪(1m l、200u l、20u l、10u l)、枪头(大中小一套)、E P管(20u l、1.5m l、10m l)、试管架、浮标、温度计、胶布、手套、记号笔、锥形瓶、称量匙、冰盒二、实验试剂:A液、B液、引物、m i x、双蒸水、三蒸水、琼脂糖、T B E(5x、1x、回收液)、核苷酸染料、M a r ke r三、母液配置:1. 10M N a O H:N a O H 40g加双蒸水至90m l，待N a O H完全溶解冷却后定容至100m l2.0.5M E DTA:E DTA.N a2盐18.61g,N a O H1.5g,加双蒸水至80m l,逐滴加入10M N a O H至E DTA完全溶解后加双蒸水定容至100m l3. 1M Tr i s H C l(p H8.0):Tr i s碱12.1g，加水至70m l，边搅拌边加入浓盐酸4m l，然后边逐滴加入1M H C l边测P H值，直至P H升至8.0(+\-0.05)，定容至100m l(p H=8.8的Tr i s H C l中边加入浓盐酸边测P H值至P H=8.0(+\-0.05)为止)四、实验步骤:1.剪取鼠尾(约芝麻大小)储存于-20度冰箱(-20度冰箱，主要是防止D N A降解，4度不行)2.提取D N A:1)配置工作液——20m l体系10M N a O H加双蒸水至20m l8u l0.5M E DTAB液:800u l1M Tr i s H C l(p H8.0)加双蒸水至20m l2)加150u l A液(液体应完全浸没标本)，95度水浴锅煮1.5h(将E P管插入浮标中后用胶布缠好防止E P管在加热过程中爆开)3)加150u l B液，混匀(上下颠倒3-5下)4)12000r/m i n4度离心5分钟(可储存于-20度冰箱)3.P C R(冰上操作):P10.5u l(P为AC3I，G为A A A)1)配置P C R体系——15u l体系P20.5u lM i x7.5u l三蒸水4.5u lD N A2u l2)加2u l上述离心后的上清液至P C R体系，瞬离3)P C R94度——3m i n变性:94度——30s退火:55度——30s个循环延伸:72度——24s72度——5m i n4度——?4.琼脂糖凝胶电泳:1)制胶——2%琼脂糖凝胶配方:总体积(m l)2030405060120琼脂糖(g)0.40.60.811.22.4T B E1x(m l)2030Tr i s-b a s e13.6gT B E5x6.56gE DTA0.73g双蒸水u p to250m lE g:50孔大胶的配置:琼脂糖2.4g微波炉加热5m i n染料7.5u l T B E1x150m l2)加样——M a r ke r 0.5u l，样品8u l(加样前吹打2次，从右向左加样)3)电泳——150V，300m A，20m i n(加样孔在近负极侧)5.成像分析:I m a g e l a b6.结果及分析:1)A A A分子量为700+,2)AC3I分子量为400+,3)A A A型——只出现A A A一条带AC3I型——只出现AC3I一条带双阳型——两条带都出现野生型——A A A型老鼠没出现A A A条带或AC3I型老鼠没出现AC3I条带或双阳型两条带均未出现4)出现浅带的原因,判定为阴性还是阳性,我觉得阴性更多。
鼠尾mRNA鉴定方法
小鼠鼠尾总RNA抽提流程参考1 样品的保存送检样品若无法及时处理，应放置在-80℃冰箱中进行存储，切忌反复冻融，防止RNA 的降解。
2 抽提前准备RNA抽提应在RNA提取间无菌操作台中进行，进行抽提前0.5h应对无菌操作台进行紫外灭菌处理。
3 RNA抽提RNA抽提采用TIANGEN生产的动物组织总RNA提取试剂盒进行抽提。
3.1 RNA试剂盒的预处理3.1.1 向裂解液RL中按照RL：巯基乙醇=100:1的体积比向RL中添加巯基乙醇。
注：巯基乙醇具有强烈的臭味，进行该步操作时应在通风厨内进行。
3.1.2 将DnaseⅠ干粉溶解在550μl无RNA酶的ddH2O中，使其充分溶解，溶解后按照100μl的量将其分装到新的无RNA酶的EP管中，保存在-20℃冰箱中。
3.1.3 向buffer RW中按试剂盒的要求添加无水乙醇，混合均匀，配置完善的buffer RW。
3.2 RNA的纯化3.2.1 剪取1-2cm鼠尾，液氮研磨，将研磨产物转移到无RNA酶的新的1.5ml的EP管中。
3.2.2 向EP管中加入300μL裂解液RL，用研磨杵将组织彻底研磨，随后向匀浆液中加入590μLRNase-Free ddH2O和20μl Proteninase K，混匀后放置在56℃金属浴中处理2-3h。
3.2.3 将EP管从金属浴中取出，使样品温度下降至室温，12000rpm/min离心2min，取上清放置在新的无RNA酶的1.5ml EP管中。
注：上清吸取时应尽量吸取更多的上清，但不能吸取到底部的沉淀。
3.2.4 向上清中缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，缓慢颠倒混匀15s，勿剧烈震荡，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱中，室温条件下放置5min，12000rpm/min离心1min，弃废液。
注：此时EP管中样本量较多，过柱不能一次完成，可分多次进行。
3.2.5 向吸附柱中加入350μl去蛋白液RW1，室温放置5min，12000rpm/min离心1min，弃废液。
鼠疫耶尔森菌鼠疫杆菌PCR检测试剂盒说明书
鼠疫耶尔森菌鼠疫杆菌PCR检测试剂盒说明书鼠疫耶尔森菌鼠疫杆菌PCR检测试剂盒说明书产品特征:灵敏度高：能对低拷贝或多样性模板进行定量。
特异性强：采纳热启动酶的激活机制，抑制非特异性扩增。
重复性好：扩增曲线重合度高，受干扰影响少。
扩增效率高：扩增曲线Ct值低，起峰快，效率高。
原理:所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
需要自备的器材：1．仪器：分析天平、离心机、荧光PCR扩增仪、组织研磨器、20℃冰箱、可调移液器（2L、20L、200L、1000L）。
2．耗材：荧光PCR反应管、眼科剪、眼科镊、生理盐水、1.5mL经焦碳酸二乙酯（DEPC）水处理的灭菌离心管、吸头（10L、200L、1000L）、灭菌双蒸水。
具有下列特点：1.产品仅用于科研即开即用，用户只需要供给样品DNA模板，操作简单，定量精准快速。
2.引物经过优化，特异性强。
预期的PCR产物长度为560bp。
3.PCRmix中含上样染料，PCR后可以直接上样电泳。
4.供给阳性对比，便于分析试验结果。
检测方法：1.Ⅰ法：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的加添与PCR产物的加添wan全同步。
定量PCR扩增荧光曲线图PCR产物熔解曲线图2.TaqMan探针法：探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团汲取；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，产品仅用于科研使报告荧光基团和淬灭荧光基团分别，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成wan全同步。
荧光定量PCR试验步骤：①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其wan全溶解。
鼠尾基因型鉴定步骤及原理
鼠尾基因型鉴定步骤及原理鼠尾基因型鉴定是一种常用的遗传学实验方法，用于确定实验对象的基因型。
它通过分析目标基因的序列和特定的基因标记，来确定个体的基因型。
下面将介绍该方法的步骤及原理。
进行基因提取。
从实验对象的组织或细胞中提取DNA，可以采用传统的有机溶剂法或商用基因提取试剂盒进行提取。
提取的DNA质量和纯度对后续实验非常重要。
接下来，进行PCR扩增。
PCR是聚合酶链反应的缩写，是一种在体外扩增DNA片段的技术。
在PCR反应中，使用特定的引物（即DNA 扩增的起始序列）选择性地扩增目标基因的片段。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
通过多轮的PCR反应，可以使目标基因片段的数量呈指数增加。
然后，进行基因分型。
基因分型是根据基因的特定位点或标记进行的。
常用的方法有限制性片段长度多态性（RFLP）分析、单核苷酸多态性（SNP）分析和序列特异性引物扩增（SSCP）分析等。
这些方法通过不同的实验步骤和分析技术，可以确定目标基因的不同等位基因。
进行数据分析和结果判读。
根据实验结果中的基因型分布和分型频率，可以判断实验对象的基因型。
通常，会根据已有的基因型数据进行比对，或者通过统计学方法进行分析和推断。
鼠尾基因型鉴定的原理是基于遗传学的知识。
每个个体都有两个基因，其中一个来自父亲，另一个来自母亲。
这两个基因可以有不同的等位基因。
通过分析特定的基因位点或标记，可以确定个体的基因型。
基因型的不同，可能会导致个体在形态、生理或行为上的差异。
总结起来，鼠尾基因型鉴定是一种通过PCR扩增和基因分型等技术，来确定实验对象基因型的方法。
它在生物学研究和医学诊断中有着广泛的应用。
通过该方法，我们可以更好地了解基因的功能和作用，为遗传病的治疗和预防提供依据。
基因型鉴定-中科院版
1.鼠尾DNA提取第一天：1.剪取小鼠尾尖（同样适用于脚趾，胚胎组织，卵黄膜等，若不立即提取，可以放置4℃数日）放入1.5ml EP 管。
2.每管加入鼠尾裂解液350ul +10ul 蛋白酶K（简称PK，10mg/ml，现用现加）。
3.55℃水浴消化过夜第二天：4.用劲将消化好的组织摇匀（可用振荡器摇匀）。
5.每管加入350ul 酚/氯仿（苯酚：氯仿：异戊醇25:24:1，事先配好，4℃保存）。
6.上下充分混匀，室温静置3分钟后，离心，12000转，30分钟。
7.取出离心后的EP管，可见液体分为三层，取上层无色水相液体约200μl于新1.5ml EP管中，注意勿吸取中层液体。
（不能将中间的蛋白层吸起来，否则会对后续的实验造成影响。
为防止压力过大，可使用切去尖端的枪头）。
8.向新EP管中加入400μl无水乙醇（为2倍于上清的体积），上下颠倒混匀，此时应可看到白色丝状样的DNA。
9.离心12000转，10分钟。
10.可看到有白色沉淀，弃去上清，加入1ml的75%乙醇，将沉淀弹起，以便去除DNA上过多的离子。
11.离心，12000转，10分钟。
12.弃去上清，倒置EP管于吸水纸上，室温干燥约15分钟（注意不能过分干燥，以免基因组DNA难溶解）。
13.加入150-200μl (根据DNA沉淀的量)无菌蒸馏水或者是TE Buffer，可放置37℃助溶。
14.短期4℃，长期-20℃保存。
相关配方：1.鼠尾裂解液配方1000ml溶解液中含：100mM5mM EDTA%SDS200mM NaCl室温保存。
2.蛋白酶K溶液：取100mg 蛋白酶K，加去离子水10ml使成10mg/ml，分装后冻存于-20℃，用时溶解。
3.酚/氯仿：取Tris平衡酚50ml，氯仿48ml，异戊醇2ml加入100ml棕色试剂瓶中混匀，4℃避光保存。
2.基因鉴定PCR反应标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA 0.1～2ugTaq DNA聚合酶UMg2+加双或三蒸水至100ul以我们实验室常用的PCR25ul体系为例：10xbuffer：dNTP 2ulMgCl2：Primer F：1ulPrimer R：1ulTaq酶：DNA模板：1~3ul去离子水加至：25ul退火温度根据引物合成说明书决定PCR操作注意事项：1)PCR的复合管配制需在冰上进行，尤其taq酶需始终放于冰上，或者在最后加入时从-20°冰箱拿出，加完后立即放回。
小鼠基因型鉴定说明书Mouse Genotyping
One Step Mouse Genotyping Kit
PD101-01
Vazyme biotech co., ltd.
产品简介
本试剂盒包含整套的DNA粗提取以及PCR扩增体系，可用于小鼠基因型快速鉴定(Rapid Genotyping)。该试剂盒可用于从 小鼠尾巴、耳朵以及脚趾等组织快速提取基因组DNA，提取产物可直接进行PCR扩增，无需匀浆、破碎、过夜消化、酚氯 仿抽提、DNA沉淀或柱式纯化等操作，极大缩短了实验耗时。使用时，将组织浸泡在预添加了Proteinase K的裂解液中， 55oC孵育20 min再95oC加热5 min灭活Proteinase K。裂解产物经离心后可直接用做PCR扩增模板，经反复测试广泛适用于 2 kb以内目标片段扩增，并适用于4对引物以内的多重PCR反应。 试剂盒中配有2 × Taq Plus Master Mix(Dye Plus)(P212)，包含高性能的Taq Plus DNA Polymerase，dNTP以及优化的缓 冲体系。PCR反应时只需加入引物和模板即可进行扩增，减少了开管/移液等操作，显著降低了样品交叉污染并且提高了检 测通量和结果的重现性。独特的保护剂使得Taq Plus Master Mix经过反复冻融后仍可保持稳定的活性。体系中预混有电泳 缓冲液和染料，可在反应结束后直接进行电泳，使用方便快捷。PCR产物的3’端带A，可克隆至T载体，并适用于 ClonExpressTM快速克隆试剂盒(C112/C113)。
应用实例
操作注意事项： - 用70%的乙醇(自备)预先清洗组织分离过程中所使用的所有工具； - Proteinase K灭活步骤(95oC，5min)必须进行，其残留活性会抑制后续PCR反应； - PCR反应体系配制过程应于冰水浴中进行，以提高扩增特异性(热启动)。
鼠尾直接PCR试剂盒(快速基因型鉴定)
10
25
f: 可以适当增减模板量，以增加目的条带亮度或降低非特异性杂带扩增。
2.2 PCR程序设置：
Temperature (°C) 94 94
50-65 72 72 12
Time 5 min 20 sec 30 sec X min (2 kb /min) 5 min
--
Cycles 1
35
1 1
3. 琼脂糖凝胶电泳 试剂2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚蓝染料，PCR产物可直接点 样进行琼脂糖凝胶电泳。PCR产物的3’端带有碱基A，可直接克隆至 T载体，用于DNA测序。
样本组与阳性对照组均无扩增条带样本组无扩增条带而阳性对照组正常存在非特异性扩增条pcr反应条件设置不当pcr引物质量问题不当储存或长期储存引起试剂活性丧失组织消化不够充分蛋白酶未被完全灭活pcr退火温度太低循环数引物浓度或模板浓度太高pcr引物错配配制pcr反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久优化pcr反应条件重新设计pcr引物使用新鲜的试剂延长55消化时间至60min消化产物在95100孵min增加pcr退火温度降低pcr循环数引物浓度或模板浓度重新设计pcr引物pcr反应体系的配制在低温下进行配制完成后尽快进行pcr扩增反常见问题可能原因对策tel
配制PCR体系时环境温度 过高或体系配制完成到 PCR仪反应间隔时间过久
在冰浴环境下配制PCR反应体 系，完成后尽快放入PCR仪中开 始反应
阴性对照出现目的 条带
PCR试剂或操作工具污染
使用新的试剂，重新高压灭菌 ddH2O和PCR用品。操作过程 中动作尽量轻柔，避免加样溅 出污染其他样品
试剂活性不稳定或DNA模 板降解
订购 & 咨询 Tel: 400-115-0509
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
产品组分 Buffer L
B40013 (200 rxns)
20 mL
B40015 (500 rxns)
50 mL
B45012 (500 rxns)
-
Protease Plus 2 x M-PCR OPTI™
Mixa
0.4 mL 2 mL
1 mL 5 mL
5 mL
a. 含有功能增强型DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+以及DNA Loading Dye。
配制PCR体系时环境温度 过高或体系配制完成到 PCR仪反应间隔时间过久
在冰浴环境下配制PCR反应体 系，完成后尽快放入PCR仪中开 始反应
阴性对照出现目的 条带
PCR试剂或操作工具污染
使用新的试剂，重新高压灭菌 ddH2O和PCR用品。操作过程 中动作尽量轻柔，避免加样溅 出污染其他样品
试剂活性不稳定或DNA模 板降解
鼠尾直接PCR试剂盒（快速基因型鉴定）
产品描述
本试剂盒专为小鼠快速基因型鉴定而研制，能够迅速从小鼠尾巴、耳 朵或脚趾等组织中释放足量的基因组DNA，消化时间仅需15分钟， 无需抽提与纯化，可直接将消化产物作为模板进行PCR扩增。
储存方法
Buffer L 4℃保存，其余组分-20℃保存。保质期2年。
产品组分
订购 & 咨询 Tel: 400-115-0509
Email: order@
常见问题及对策
常见问题
可能原因
长期存储或存储条件不当 导致试剂失活
对策 使用新的试剂盒
样本组与阳性对照 组均无扩增条带
引物质量问题 退火温度过高
重新设计合成引物
建议每2℃为一个梯度降低退火 温度，摸索最佳条件
延伸时间过短或循环数过少 适当增长延伸时间或提高循环 数至36-40 Cycles
未充分消化组织样本 样本组无扩增条带 而阳性对照组正常 加入过多模板抑制PCR
Buffer L
100 µL
组织消化液现用现配，充分混匀后使用。
1.2. 向每个含有小鼠组织样本b的EP管中加入100 μLc新鲜组织消化 液，55℃水浴/金属浴中消化15 mind。组织消化时，务必将组织完全 浸没于消化液中。消化完成后，组织外观上仍然完整，但足量的基因 组DNA已经释放，不影响后续的PCR实验。
将消化时间延长至30 min 降低模板用量
未完全灭活蛋白酶活性
消化产物在95℃加热5 min
PCR引物错配
重新设计PCR引物
PCR体系配制不当（引物浓 度或DNA模板浓度过高） 适当降低引物和模板用量
有非特异性扩增条 带
PCR反应条件设置不当 （退火温度过低或循环数 过高）
适当提高退火温度或降低循环数
订购 & 咨询 Tel: 400-115-0509
Email: order@
PCR 反应组分
20 μL 反应体系 (μL) 50 μL 反应体系 (μL)
物 (10 µM)
0.5
1
反向引物 (10 µM)
0.5
1
模板（消化产物）f
1
2
2 x M-PCR OPTI™ Mix
1.3. 将样本置于95℃水浴/金属浴中孵育5 min以灭活消化液中的蛋白 酶。12000 rpm离心5分钟，取上清作为PCR模板。消化后的上清可 于-20℃保存三个月e。
e. 为保证PCR扩增效率尤其是对于难扩增基因，PCR模板需尽快使用。
2. PCR扩增
2.1. PCR反应体系： 反应体系的配制最好于低温环境下（如冰浴）完成，以保证PCR扩增 效率和扩增特异性。
低温保存所有试剂，重新提取 样本基因组DNA
样本DNA交叉污染 实验结果重复性不 好
PCR产物交叉污染
建议每个取样器只取一个样 本，或取完一个样本后，将取 样器刃口浸没在75%酒精或2% 次氯酸钠溶液中反复涮洗，用 干净的纸巾擦干后，再取下一 个样本
操作过程中动作尽量轻柔，避 免管中PCR产物溅出污染其他样 品。电泳上样过程中，小心加 入适量PCR产物到相应泳道中， 避免上样过多溢出或动作过大 而污染相邻泳道样品。注意勤 换枪头以避免产物交叉污染
实验方法
将蛋白酶混合物加入到含有 鼠尾组织的EP管中 组织消化
在 55°C下孵育15 min充分 释放基因组DNA 蛋白酶失活
消化完成后，在95°C下孵育 5 min使蛋白酶失活
PCR 离心后，消化液的上清液 可以用做PCR的模板
1. 组织消化 按小鼠数量配制组织消化液，试剂比例如下：
单样本
Protease Plus 2 µL
10
25
f: 可以适当增减模板量，以增加目的条带亮度或降低非特异性杂带扩增。
2.2 PCR程序设置：
Temperature (°C) 94 94
50-65 72 72 12
Time 5 min 20 sec 30 sec X min (2 kb /min) 5 min
--
Cycles 1
35
1 1
3. 琼脂糖凝胶电泳 试剂2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚蓝染料，PCR产物可直接点 样进行琼脂糖凝胶电泳。PCR产物的3’端带有碱基A，可直接克隆至 T载体，用于DNA测序。