酶分析法

张晓静 2009.09
1、终点法的条件
必须有专一地作用于被测物质的酶，并能得到它的制品； 能够确定使这种酶反应就近进行完全的条件； 反应中底物的减少、产物的增加、辅酶物质的改变等可以 借助某种简便的方法进行测定。
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2、终点法的测定方法
分光光度法（光吸收、荧光） 华勃式呼吸仪检验法（气体产生与吸收） 滴定法（pH值变化） 同位素跟踪测定法
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一、终点测定法
指经过一段时间(一般为几分钟)的反应，反应进行到完全， 使全部底物(被测物)转变成产物，称终点法，更确切地说 应称平衡法，这是最理想的分析类型。整个反应达到平衡， 由于正向反应的平衡常数很大，可认为所有的被测定物已 转变为产物，反应液的吸光度不再增加(或降低)，吸光度 的增加(或降低)程度与被测定物的浓度成正比。 终点法对反应条件(如酶量、pH、温度)小的改变不敏感， 只要这种改变不影响在一定时间内反应达到平衡即可.

测定酶活力大小时，通常要求底物浓度足够大， 测定底物浓度的变化在起始浓度的5％以内的速率， 这样可以保证所测定的速率是最初速率。此结果能 比较可靠地反映酶的含量。

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一、酶活力
3.酶的比活力

酶的比活力代表酶的纯度，通常用下式表示：
酶比活力=[ 酶活力单位数(U) / 蛋白质量(mg) ]
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3、特殊的反应速度测定法
将与待测物质相关的两种酶反应偶联起来，构成待测物质 能够再生的循环系统，然后再将可作为指示剂的第三种酶 反应在适当的条件下与之偶联，那么指示剂酶反应的速度 和待测物质量之间有一定的比例关系。
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思考题
1、阐述酶分析法两种类型的异同点。 2、阐述酶活力测定中应注意的主要问题。 3、简述终点法的原理、条件和种类。
可以用此法测定。
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二、酶活力的测定

由于分光光度法有其独特的优点，因此可以把一些
原来没有光吸收变化的酶反应通过与一些能引起光吸
收变化的酶反应偶联，使第一个酶反应的产物转变成
为第二个酶的具有光吸收变化的产物来进行测量。这 种方法称为酶偶联测定法。
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二、酶活力的测定

世界各地实际应用的酶活力单位的定义各不相同。 同一种酶往往有几种不同的单位。

例如，1IU＝lμmol/min；1Kat = 1mol/s
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一、酶活力
酶活力的测定要在最适条件下进行，即最适温度、 最适pH、最适底物浓度和最适缓冲液离子强度等， 只有在最适条件下测定才能真实反映酶活力大小。
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1、利用作底物的测定法
在一定pH及温度下测定反应初速度。反应时除被测物（底 物）外，其他影响反应速度的物质均为过剩，则反应初速 度与被测物的浓度成正比关系。
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2、利用辅酶或抑制剂作用测定
如被测物质可作为某种酶专一的辅酶（或抑制剂），则这 种物质的浓度和将其作为辅酶（或抑制剂）的酶的反应速 度之间有关联，因此通过测定该酶的反应速度就能进行这 种物质的定量。
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二、酶活力的测定
2.酶活力的测定方法
测定反应液中物质的变化量，可采用光学检测 法、化学检测法等生化检测技术。

一种酶可能有多种测定方法，要根据实际情况 选用。

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二、酶活力的测定
1.分光光度法
酶 活 力 的 测 定 方 法
2.荧光法 3.同位素测定法 4.电化学方法 5.其他方法
只是应用于个别酶活力的测定。
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三、测定过程中应注意的问题
1、分析产物比分析底物准确度高。 2、反应初始阶段的速度才能反应酶的真正活力。 3、测得的反应速度必须和酶浓度之间有线性比例关系。
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第二节 酶法分析
根据测定原理，酶法分析可分为终点法和反应速度法两大 类。
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二、酶活力的测定
①底物：根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配制成 一定浓度的底物溶液。要求所使用的底物均匀一致，达 到一定的纯度。有些底物溶液要求新鲜配制，有些则可 预先配制后臵冰箱保存备用。 ②反应条件：据资料或试验结果，确定酶促反应的温度、 pH等条件。温度可选在室温(25℃)、体温(37℃)、酶促 反应最适温度或其他选用的温度，一般在恒温装臵内进 行。pH应是酶促反应的最适pH，采用一定浓度和一定 pH的缓冲溶液来保持。反应条件一经确定，在反应过程 中应尽量保持恒定不变。有些酶促反应要求激活剂等其 他条件，应适量添加。
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二、酶活力的测定
③反应时间：在一定条件下，将一定量的酶液与底物溶 液混合均匀，适时记下反应开始的时间。反应到一定时 间及时终止反应。终止酶促反应的方法要根据酶的特性、 反应底物或产物的性质以及检测方法等加以选择。常用： 加热、添加酶变性剂、加入酸液或碱液、冰浴等。 ④底物或产物的变化量：反应到一定时间，取出适量的 反应液，运用各种生化检测技术，测定产物增加量或底 物的减少量。为了准确地反应酶促反应的结果，应尽量 采用快速、简便、准确的方法测出结果。
第二章
酶分析法
第一节 酶活力测定法 第二节 酶法分析
酶分析法的两种类型


酶活力测定：以酶为分析对象，也就是根据需 要对样品进行酶含量或活力的测定。 酶法分析：以酶作为分析工具或分析试剂，用 以测定样品中用一般化学方法难以检测的物质， 这些物质可以是酶的底物，也可以是酶的抑制 剂或酶的辅助因子。
酶活力测定法
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酶活力的测定就是测定酶促反应的初速率。
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一、酶活力
2.酶活力单位
酶活力的大小即酶含量的多少，用酶活力单位表示, 即酶单位(activity unit，U)。

酶单位的定义：在一定条件下，一定时间内将一定 量的底物转化为产物所需的酶量。这样酶的含量就可 以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表 示，即 “U/g” 或 “U/mL” 。
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二、酶活力的测定
1.分光光度法
源自文库
分光光度法主要利用底物和产物在紫外光或可见光
部分的光吸收度的不同，选择一适当的波长，测定反
应过程中反应进行的情况。其优点是简便、节省时间
和样品，可检测到nmol/L水平的变化。该方法可以连 续地读出反应过程中光吸收的变化，已成为酶活力测
定中一种重要的方法之一。几乎所有的氧化还原酶都
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3、终点法种类
单酶反应定量法 和指示酶反应偶联的定量法
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4、采用终点法应注意的问题
酶底物的专一性 反应的平衡性 反应液中的酶量 反应产物抑制
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二、反应速度法
反应速度法又称连续检测法，是指在多个时间点连续监测 产物（或底物）在线性范围内的生成量（或消耗量）即零 级反应速率测定酶活性的方法。
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二、酶活力的测定

在使用离子选择电极法测定某些酶的酶活力时,
用氧电极可以测定一些耗氧的酶反应。如葡萄糖
氧化酶的活力就可用这个方法很方便地测定。
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二、酶活力的测定
5.其他方法

除上述方法外，还有一些测定酶活力的方
法，例如旋光法、量气法、量热法和层析法
等，但这些方法使用范围有限，灵敏度较差,
一、酶活力 二、酶活力的测定
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一、酶活力
1.概念
酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力的 大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反 应速率来表示，两者呈线性关系。酶反应速率越大， 酶活力越高，反之越低。

酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或 产物的增加量来表示。在实际酶活性测定中一般以测 定产物的增加量为准。
4.电化学方法

电化学方法包括：pH测定法和离子选择电极法等。 pH测定法最常用的是玻璃电极，配合一高灵敏度的
pH计，跟踪反应过程中H+变化的情况，用pH的变化
来测定酶的反应速率。也可以用恒定pH测定法，在酶 反应过程中，所引起的H+的变化用不断加入碱或酸来 保持其pH恒定，用加入的碱或酸的速率来表示反应速 率。用此法可以测定许多酯酶的活力。
二、酶活力的测定
优点：反应灵敏度极高，可直接用于酶活力的测定， 也可用于体内酶活性测定。特别是适用于低浓度的酶 和底物的测定。

缺点：操作繁琐，样品需分离，反应过程无法连续 跟踪，且同位素对人体有损伤作用。辐射猝灭会引起 测定误差，如3H发射的射线很弱，甚至会被纸吸收。

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二、酶活力的测定
有时也采用每克(g)酶制剂或每毫升(mL)酶制剂含 有多少个活力单位来表示。 比活力的大小可用来比较每单位质量蛋白质的催化 能力。比活力是酶学研究及生产中经常使用的指标。

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二、酶活力的测定
要求酶活力的测定方法：快速、简便、准确。 1.酶活力的测定步骤

酶活力测定均包括两个阶段：首先要在一定的
条件下，酶与其作用底物反应一段时间，然后 再测定反应液中底物或产物变化的量。
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二、酶活力的测定
选择底物 配制底物溶液 ① 底物 ② 反应条件 酶活力 的测定步骤
准确计时并终止反应
确定酶促反应条件： pH、温度等
③ 反应时间
④ 底物或产物 变化量
运用各种检测技术， 快速、简便、准确的 测定变化量
2.荧光法
荧光法主要是根据底物或产物荧光性质的差别来进行测 定。由于荧光方法的灵敏度往往比分光光度法要高若干个 数量级，而且荧光强度和激光的光源有关，因此在酶学研 究中越来越多地被采用，特别是一些快速反应的测定方法。

该法缺点：易受其他物质干扰，有些物质如蛋白质能吸 收和发射荧光，这种干扰在紫外区尤为显著，故用荧光法 测定酶活力时，应尽可能选择可见光范围的荧光进行测定。

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二、酶活力的测定
3.同位素测定法
用带有放射性同位素标记的底物经酶作用后得到产 物，通过适当的分离，测定产物的脉冲数即可换算出 酶的活力单位。

已知六大类酶几乎都可以用此方法测定。
通常用于底物标记的同位素有3H、14C、32P、35S和 131I等。
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