噬菌体展示

测定噬菌体滴度

只有当噬菌体的感染复度MOI (噬菌体数/细菌数)值远低于1时（即细菌过量时），噬菌斑的数量才会随着加入噬菌体的量而呈线性增加。正因如此，建议检测噬菌体贮液的滴度时，在感染前进行稀释，而不是在高MOI值的情况下稀释被感染的细胞。低MOI值有助于确保每个噬菌斑仅含一个DNA序列。

1. 接种ER2738单菌落于5-10 ml LB培养基中，摇床培养至对数中期（OD600 ~0.5）。

2. 细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成3 ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。保存于45℃备用。

3. 37℃预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。

4. 在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体。

建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104。每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。5. 当菌体培养物达对数中期，分成200 μl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。

6. 每管加入10 μl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5 min。

7. 将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。

8. 待平板冷却5 min后，倒置于37℃培养过夜。

9. 检查平板，计数有~102个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10 μl噬菌体的空斑形成单位（pfu）滴度。

淘选程序

最简单直接的淘选方法有：直接将靶分子包被于塑材表面（通过非特异的疏水作用或静电相互作用），洗去过量的未吸附分子，然后将噬菌体库覆盖在已包被的靶分子的表面。根据靶分子的不同，直接包被法偶尔会导致配体结合位点难以进入，这或许是由于分子的立体封阻或许是由于靶分子表面的部分变性而引起。在这些情况下，可先将噬菌体库在液相中与靶分子进行预结合，然后将噬菌体-靶分子复合物亲和捕获于链霉亲和素包被的表面（见15页）或其他亲和介质上（见16页）。由于直接包被法相对简单，建议先按以下步骤试用此方法。如果没有淘选到明显的共有结合序列，再进行上述液相结合试验中的一种。

第一天

根据需同时在其上进行文库淘选的靶分子的数量和种类不同，淘选试验可以在单个灭菌聚苯乙烯培养皿、12-或24-孔板、96孔微量板中进行。每种靶分子至少包被一个板（或一个孔）。下述方法中给出的量是60×15 mm培养皿的用量，括号中为微孔板的用量，其他中等尺寸的孔相应地调整此用量。但每种情况下，加入的噬菌体数量都是相同的：2×1011个病毒子。

1. 准备100 μg/ml的靶分子溶液（溶于0.1 M pH 8.6的NaHCO3）。

如果需要稳定靶分子，也可使用其他相似离子强度的缓冲液（含金属离子等）。

2. 每板（孔）加入1.5 ml（微孔板每孔150 μl）上述溶液，反复旋转直到表面完全湿润（小心不要使溶液溅出）。

3. 在增湿容器（如：排列有湿纸巾的可封口塑料盒）中4℃轻微震荡，孵育过夜。平板可在此容器中4℃贮存备用。

第二天

4. 挑ER2738单克隆（噬菌体滴度测定时铺的板）于10 ml LB液体培养基中。如果同一天扩增洗脱的噬菌体，也可将ER2738接种于20 ml LB液体培养基，这时请用250 ml三角瓶（不要用50 ml锥形管）。37℃剧烈震荡培养。

5. 倒掉每板中的包被液，板倒置在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液。每板（或孔）加满封阻液，4℃作用至少1 hr。

6. 按5中所述方法除去封阻液。再用TBST (TBS+0.1% [v/v] Tween-20)缓冲液快速洗板6次。每次均旋转以使板或孔的底部及边缘均被洗到，倾去缓冲液，倒置在干净纸巾上拍甩以除去残余溶液（或使用自动洗板机）。此操作要快以避免板干燥。

7. 用1 ml（微孔板则用100 μl）的TBST缓冲液稀释2×1011的噬菌体（即10 μl的原始文库），然后加到已包被好的板上，室温温和摇动10-60 min。

8. 倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液。

9. 按6中所述方法用TBST缓冲液洗板10次，每次换一干净纸巾以避免交叉污染。

10. 根据所研究的分子间相互作用，用1 ml（微孔板则用100 μl）适当的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。一般情况下，是将靶分子的已知配体以0.1-1 mM的浓度溶于TBS溶液中或者用游离靶分子溶液（~100 μg/ml溶于TBS中）从固定靶分子上将结合的噬菌体竞争性洗脱下来。室温温和摇动10-60 min，将洗脱液吸入另一干净微量离心管中。

10a.另外，也可用非特异性缓冲液如0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2), 1 mg/ml BSA来分离已结合的分子：温和摇动>10 min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中。然后再用150 μl（微量孔则用15 μl）1M Tris-HCl（pH 9.1）中和上述洗脱液。

11. 按上述常规M13方法中的程序测定少量（~1 μl）洗脱物的滴度。如需要，可对第一或第二轮洗脱物滴度测定所得的噬菌斑进行测序，方法见下述。（必要时可将剩余洗脱物4℃贮存过夜，第二天扩增。这时，可将ER2738在LB-Tet培养基中过夜培养，第二天将培养物1:100稀释于20 ml LB中（用250 ml三角瓶盛装），加入未扩增洗脱物。37℃剧烈摇动培养4.5 hr，继续第13步）。

12. 剩余洗脱物应当被扩增：将洗脱物加入到20 ml ER2738培养物中（菌体应当处于对数前期），37℃剧烈摇动培养4.5 hr。

13. 将培养物转入一离心管中，然后，4℃10,000 rpm离心10 min。上清液转入另一离心管中，再离心。

14. 将上清的上部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。让噬菌体4℃沉淀至少60 min，最好过夜。

第三天

15. 4℃10,000 rpm离心PEG沉淀15 min。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。

16. 沉淀物重悬于1 ml TBS中，悬液转入微量离心管中，4℃离心5 min使残余细胞沉淀。

17. 上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育15-60 min。4℃离心10 min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。

18. 沉淀物重悬于200 μl TBS, 0.02% NaN3中。离心1 min，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新鲜管中。此即为扩增后的洗脱物。

19. 根据上述常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物。4℃贮存。

20. 再包被一个板或孔准备第二轮淘选时用，见第8页步骤1-3。

第四和第五天

21. 计数板上蓝斑数确定滴度。用这个值来计算相应于2×1011 pfu的加入量。如果滴度太低，接下来的几轮淘选可用低至109 pfu的噬菌体加入量进行试验。

22. 进行第二轮淘选：用第一轮淘选扩增的洗脱物中2×1011 pfu的噬菌体量重复步骤4-18，在清洗步骤中将Tween的浓度增至0.5% (v/v)。

23. 在LB/IPTG/Xgal平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度。

24. 再包被一个板或孔准备第三轮淘选时用，见第8页步骤1-3。

第六天