HER2基因真核表达载体的构建及其抑瘤效应研究

HER2基因真核表达载体的构建及其抑瘤效应研究

贺丽清张存李维娜张路张英起

(第四军医大学生物技术中心，陕西西安710033)

【摘要】目的构建HER2基因真核表达载体，研究其对肿瘤生长的抑制作用。方法通过RT-PCR方法从HER-2+SKBR3细胞株中获得HER-2基因胞外段编码区cDNA，构建pRC-CMV-信号肽-hHER2-ECD真核载体，于大肠杆菌DH5α中进行扩增；用获得的质粒免疫小鼠，ELISA法和ELISPOT法分别检测体液及细胞免疫情况，然后用EMT-6细胞接种肿瘤，观察肿瘤生长情况。结果构建的pRC-CMV-信号肽-hHER2-ECD真核载体经酶切和DNA测序分析，结果表明该基因的序列与设计的序列完全相同。pRC-CMV-信号肽-HER2真核表达质粒转染细胞后，目的基因在mRNA水平的表达与预期结果一致。获得的质粒能够引起较低的体液免疫，但其可诱导较高的T细胞反应，并且可明显降低小鼠成瘤率。结论构建的HER2基因真核表达载体可在细胞中表达且对小鼠实体瘤的生长具有一定的抑制作用。

【关键词】真核表达载体HER2转染肿瘤

Construction and antitumor effect of HER2 DNA eukaryotic expression vector He li-qing Zhang cun（The department of biotechnology center，The Fourth Military Medical

University，Xi’an 710033，China）

【Abstract】AIM: To construct an eukaryotic expressing vector of HER2 and investigate the inhibitory effect on the growth of tumor by the expression of the plasmid in vivo．．Methods：The cDNA of HER2 extracellular domain was prepared through RT-PCR from HER-2+SKBR cell line, then it was cloned into pRC-CMV vector and DH5α,the immunocompetence of the plasmid was study by ELISA and ELISPOT. Incubated mice with EMT-6 and the tumor growth was observed. RESULTS: DNA sequencing and restriction enzyme digestion proved that HER-2 gene was correctly connected.After transfection with plasmid pRC-CMV-signal peptide-HER2,293 cells could produce HER2 mRNA. The plasmid can induce low immune but high T cell response and it can restrain the growth of tumor obviously. CONCLUSION: P1asmid can express in cells,The plasmid Can inhibit the growth of solid tumor．

【Key words】eukaryotic expressing vector ; HER-2; transfection; tumor

HER2/neu基因编码分子量为185kDa的受体酪氨酸激酶HER2/neu蛋白，它与细胞恶性转化有关，是癌症病因学中的一种生物学相关蛋白。大量的疫苗研究表明，HER-2全长并不能诱导有效的免疫反应，而胞外区的近膜端免疫原性较强[1]。故本实验首先截取HER-2胞外区的近膜区构建了rhHER-2-ECD真核表达载体，为进行肿瘤疫苗的功能研究奠定基础。

1 主要试剂材料

1。1 细菌菌种、细胞株及实验动物

E．coli DH5 本室保存。质粒pRC-CMV为真核表达载体，第四军医大学生

化教研室馈赠。

HER-2/neu+EMT6细胞株、SKBR3细胞株、HEK293细胞株由本室保存。

6－8周BALB/c小鼠，雌性，由第四军医大学实验动物中心提供。

1。2 分子生物学试剂

质粒纯化试剂盒与核酸片段纯化试剂盒购自上海博亚公司，寡核苷酸片段由北京澳科公司合成。限制性核酸内切酶Bam H I，HindⅢ，Xba I等均购自TaKaRa 公司。T4DNA连接酶，TaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司。TaqDNA聚合酶（PCRmix），DNA Marker购自天根公司。

1640培养基为Gibco公司产品。小牛血清为杭州四季青生物工程材料研究所产品。HER-2/Fc蛋白购自R&D公司。HRP标记的羊抗小鼠IgG和FITC标记的羊抗小鼠IgG购自中杉生物工程公司。ELISPOT试剂盒购自MABTECH公司。Lipofectamine TM2000脂质体购自R&D公司，PVDF膜的96孔板购自Millipor 公司。

2 实验方法

2。1 引物设计

参考GeneBank中人HER2基因序列（gi:54792095），由于HER2胞外区太长，所以根据文献[2]，截取近胞膜端抗原性较强的一段序列，设计一对引物，据克隆所需在每条引物的5’端引入相应的限制性内切酶识别序列及保护碱基，经计算机软件分析，由北京奥科生物公司合成，引物序列如下（下划线序列分别为引入的Bam HI，Xba I酶切位点）:

P1: 5’CG GGATCC TGCCACCAGCTGTGCGCC

P2: 5’GCTCTAGA TCAGTTGATGGGGCAAGGCT

2。2 信号肽序列的设计

真核载体表达的靶分子分泌到细胞外，必须有信号肽的协助。选取分泌性较强的人Ig的信号肽（M K H L W F F L L L V A A P R W V L S），碱基序列由北京奥科生物公司合成，引入相应的酶切位点HindⅢ，Bam HI：

1--5’AGCTTATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCA GATGGGTCCTGTCCG