BD FACSCalibur流式细胞仪操作手册
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C S C a l i b u r流式细胞仪
FACS101Handbook
本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。如希望进一步了解流式细胞技术应用,请至本公司网站订阅FACSinformation电子报。
如需要本课程手册,欢迎至本公司网站下载。
如需要免疫荧光染色方法,请至本公司网站下载。
一、BDFACSCalibur基本结构
1.1仪器本体:
1.电源开关:在BDFACSCalibur仪器右侧下方,先启动仪器本体,再打开计算机。
2.光学系统:BDFACSCalibur基本配有一支波长488nm的氩离子雷射
以BDFACSCalibur基本型为例
➢FSCDiode只收488nm波长散射光
➢SSCPMT只收488nm波长散射光
➢FL1PMT荧光光谱峰值落在绿色范围(波长515-545nm)
➢FL2PMT荧光光谱峰值落在橙红色范围(波长564-606nm)
➢FL3PMT荧光光谱峰值落在深红色范围(波长>650nm)
3.仪器面板:
仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。
流速控制:
LO:样品流速:12?l/min
MED:样品流速:35?l/min
HI:样品流速:60?l/min
功能控制:
•RUN:此时上样管加压,使细胞悬液从进样针进入流动室。(正常显示绿色;黄色时表示仪器不正常,请检查是否失压。)
•STANDBY:无样品或暖机时之正常位置,此时鞘液停止流动,雷射功率自动降低。
•PRIME:去除流动室中的气泡,流动室施以反向压力,将液流从流动室冲入样品管,持续一定时间后,以鞘液回注满流动室。PRIME结束,仪器恢
复STANDBY状态。
4.储液箱抽屉:
在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开,内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器SheathFilter,及空气滤网Airfilter。请注意气路减压阀VENTTOGGLE之位置。
•鞘液筒:位于抽屉左侧,容积4升。装八分满鞘液筒,仪器可以运行大约3小时。筒上装有液面感应器,鞘液用完时,仪器软件上会有显示。鞘液筒盖
上有金属环扣,保证鞘液筒密闭。
•废液筒:位于抽屉右侧,容积4升。筒上装有液面感应器,废液盛满时,仪器软件上会有显示。注意废液可能有潜在的生物传染性。
•鞘液过滤器:0.22?m过滤器,去除鞘液中的杂质,保证进入流动室的鞘液是干净的。
•气路减压阀:沿箭头方向移动阀门开关,鞘液筒减压,气压恢复正常。在鞘液筒添加鞘液时,需要减压。
•空气过滤网:用于过滤冷却雷射的空气。
5.上样品区:
上样品区是样本管的上样位置。它包括三个部分,一个是进样针
SampleInjectionTube,将样本输入流动室,还有就是支撑架
TubeSupportArm、和液滴存留系统DropletContainmentSystem。
•进样针:是一根不锈钢管,将细胞从样本针中吸入流动室。进样管外有一套管,是液滴保留系统的一部分。
•支撑架:用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。支撑架有三个位置:位于样本管之下的中位,样本管左侧或右侧。
液滴存留系统:系统由支撑架、真空帮浦和外套管组
成。当支撑架位于左侧或右侧位置时,真空帮浦就会启
动,将液体从外管吸入废液筒内。上样时,须注意将支
撑架位于中位,以避免过多样品被抽吸到废液筒内(当
支撑架位于中位,真空帮浦停止工作)。更换样品时,
让仪器保持RUN的模式,使得进样针可以反冲;切换到
STANDBY模式前,确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到
流动室中。
1.2Macintosh计算机与打印机:
准备您的细胞样品
1. 理想样品浓度调至1-10X105cells/ml?一般实验只需0.5ml的样品。
2. 细胞样品务必放至BDFALCON352052试管中,否则无法上机。
3. 上机前务必去除样品中之细胞团块,以防止管路堵塞?可使用附滤网
BDFALCON试管(Cat.No.352235)或35-55?m的尼龙筛网。
4. 供流式分析的样品是单细胞悬浮液,而且大部分样品都需经荧光染色。表面抗原
荧光染色的方法大致有两种:直接免疫荧光、间接免疫荧光染色。研究生可至本
公司网站下载染色方法
•直接免疫荧光染色
•Lysed-No-WashProcedure
•Lysed-And-WashProcedure,SimulTEST&HLA-B27
•PeripheralBloodMononuclearCellProcedure
•LeukemiaandLymphomaProcedure1
•LeukemiaandLymphomaProcedure2,B-cellClonalityAssay
•间接免疫荧光染色
•滴定抗体浓度
•常用试剂
5. 如因特殊因素无法下载上述实验方法,请e-mail:或。
二、开机、关机标准操作
2.1FACSCalibur开机
1. 开启细胞仪电源。
2. 开启其它周边配备电源,如打印机及MO机。
3. 开启计算机。
4. 确认鞘流液筒有八分满的FACSFlow,确实旋紧(鞘液筒容量为4L)。
5. 将废液倒掉,并在废液筒中加入200ml家用漂白水(废液筒容量为4L)。
6. 将减压阀方向调在加压(Pressurize)位置。
7. 排除液流管路与过滤器中的气泡。
8. 取下样品管,执行PRIME功能两次。
9. 使用1mlPBS,HIGHRUN两分钟。
10. 可开始分析样品。
2.2FACSCalibur关机
关机前必要动作:清洗进样管和外套管,防止进样管堵塞、或有染料残留。
1. 将样品支持架左移,取2mlFACSClean(10%Bleach)上样品,让仪器的真空
系统抽取约1ml的液体。
2. 将样品支持架回正,按HIRUN,然后让FACSClean清洗管路10分钟。
3. 按Standby,取下样品管,执行PRIME功能两次。
4. 取2mldH2O,重复上述步骤1-3。
5. 注意最后只留约1ml dH2O在试管中。
6. 按STANDBY五分钟,使风扇冷却雷射后,关闭细胞仪(必要动作,以保护雷
射光源。)
7. 倒掉废液,并回填200ml漂白水。
8. 将减压阀放在「VENT漏气」位置。将鞘流液筒充填至八分满。
9. 退出软件“File”✍“Quit”(如有对话选项,选择“Don‘tsave”)。确认退出
计算机中所有BD应用软件,所有数据数据已储存备份。
10. 关闭计算机。“Special”✍“Shutdown”。
三、上机分析流程
建议首次试机避免进行大量试验,仅需准备下列样品。
(1)NegativeControl(不加任何抗体)。
(2)CD3-FITC(FL1单染)。
(3)CD19-PE(FL2单染)。
(4)CD3-FITC/CD19-PE(FL1/FL2双染)。
3.1Calibur开机