实验六细胞器的分离与观察
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
一、实验目的
了解细胞器的分离原理 掌握差速离心和密度梯度离心技术
二、实验原理
细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官， 为了研究各种细胞器的功能，首先就要将这些细胞器 从细胞中分离出来。利用各种物理方法（研磨、超声 波振荡、低渗等将组织制成匀浆，细胞中的个中亚组 分即从细胞中释放出来。
五、实验结果
核DNA呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质RNA呈 红色。
线粒体蓝绿色，呈小棒状或圆形。 观察每个视野中所见完整细胞核和线粒体的
活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊 的部分，主要是染料的“电化学”特性起重要作 用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的 胶粒表现带有阴离子，而被染的部分本身也是具 有阴离子或阳离子，这样它们彼此之间就发生了 吸引作用。
中性红-詹纳斯绿染色
线粒体分析：詹纳斯绿（Janus green B）是 对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于 碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在 线粒体膜上。由于线粒体内具有细胞色素氧化 酶系，能使詹纳斯绿保持在氧化状态（淡蓝绿 色）。中性红为弱碱性染料，对液泡系(即高尔 基体)的染色有专一性，将活细胞中的液泡系染 红色。
（2）离心：低温离心机（4℃）中进行。 每次
离心前一定要在天平（托盘天平）上将两离心 管配平。第一次以600g(3005rpm)离心10min。 将其上清夜移入Eppendorf管中，盖好盖子置于 冰浴中，留待后面使用（分离线粒体）。沉淀 使用1ml预冷的0.25mol/L蔗糖溶液离心洗涤2次， 每次1000g(3880rpm)离心10min。
2.线粒体的分离
(1)分离:将分离细胞核时收集的上清液以 10000g(12270rpm)离心10min。沉淀用预冷0.25mol/L蔗 糖溶液悬浮,10000g离心10min,反复2次。
(2)鉴定:在干净的载玻片中央滴加1～2滴中性红-詹纳斯
绿染液,用牙签挑取沉淀物均匀涂片。盖上盖片,染色 5min,镜检。 线粒体蓝绿色，呈小棒状或圆形。
(3)分析：分级分离得到的组分，可用细胞化学和 生化方法进行形态和功能鉴定。
Unna染色法（甲基绿-派洛宁染色）
细胞核分析：甲基绿-派洛宁对DNA和RNA有选择性 的染色效果。核酸是酸性的，它们对于碱性染料甲 基绿和派洛宁的亲和力不同，而使这两种染料对两 类核酸具有了选择性。DNA被甲基绿染成绿色，RNA 被派洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分 布显示出来。
细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异，因此不 同细胞器在介质中的沉降系数各不相同。根据这一原 理，常用不同转速的离心法来分离不同的细胞器。分 级分离的方法有差速离心和密度梯度离心两种。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆， 在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离， 其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三 步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组 成、理化特性及其功能的主要手段。
细胞经甲基绿-派洛宁混合液处理后，其中的 DNA和RNA出现不同的呈色反应，一般认为这是 由于带有负电荷的核酸对碱性染料派洛宁和甲 基绿具有亲和力，且这两种染料的作用有选择 性，甲基绿染高聚分子的DNA呈蓝绿色，派洛宁 染低聚分子的RNA呈红色。
下次实验内容：
（4）鉴定：将分离纯化的细胞核制成涂片，空气干 燥。将干燥的涂片浸入95％乙醇溶液固定5min，晾 干，滴加甲基绿-派洛宁染液染色20～30min，丙酮 分色30s，蒸馏水漂洗，滤纸吸干水，镜检。
四、实验方法与步骤
1.细胞核的分离 （1）组织匀浆:将饥饿24h的大白鼠处死,立即剪开腹部, 迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水,洗去血污,用滤 纸吸干。称取0.5g肝组织,在小烧杯中剪碎,用预冷的 0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。将烧杯中的悬浮肝组织 倒入匀浆管中进行匀浆,匀浆过程要在冰浴中进行。匀 浆完毕,移入1.5ml离心管中。
核DNA呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质RNA呈红色。
六、实验报告
1. 线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进 行？
2. 要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离 和活性鉴定的过程中需注意哪些问题？根据你的实 际体会，写出操作注意事项及改进方法。
3. 分离介质 0.34mol/L及 0.88mol/L缓冲蔗糖溶 液哪一种在下层? 有什么作用?
（3）纯化：将沉淀用5倍体积0.34mol/L蔗糖溶 液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液混悬，用长针头注射 器再混悬液下轻轻加入4倍体积0.88mol/L蔗糖溶 液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液。尽量使两种溶液明 显分层。以1500g(4752rpm)离心15～20min。弃 上清液，沉淀即为经过纯化的细胞核，用PBS溶 液悬浮，4˚C保存。
(1)细胞匀浆(Homogenization)：低温条件下， 将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即 0.25mol／L蔗糖)进行破Байду номын сангаас细胞使之成为各种细 胞器及其包含物的匀浆。
(2)分级分离(Fractionation)：由低速到高速离心 逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高 的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使 各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由 于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时 均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第 一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮 和离心加以纯化.
洋葱内表皮细胞的线粒体分布
植物根尖液泡的中性红染色
三、材料和试剂
材料：小鼠的肝脏
器材：高速冷冻离心机、天平、显微镜、Eppendorf 管、冰块、冰盒、载玻片、盖玻片、玻璃匀浆器
试剂：生理盐水、0.25mol/L蔗糖溶液、 0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、 0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、 95%乙醇溶液、丙酮、PBS液、 甲基绿-派洛宁染液、中性红-詹纳斯绿染液。
了解细胞器的分离原理 掌握差速离心和密度梯度离心技术
二、实验原理
细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官， 为了研究各种细胞器的功能，首先就要将这些细胞器 从细胞中分离出来。利用各种物理方法（研磨、超声 波振荡、低渗等将组织制成匀浆，细胞中的个中亚组 分即从细胞中释放出来。
五、实验结果
核DNA呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质RNA呈 红色。
线粒体蓝绿色，呈小棒状或圆形。 观察每个视野中所见完整细胞核和线粒体的
活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊 的部分，主要是染料的“电化学”特性起重要作 用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的 胶粒表现带有阴离子，而被染的部分本身也是具 有阴离子或阳离子，这样它们彼此之间就发生了 吸引作用。
中性红-詹纳斯绿染色
线粒体分析：詹纳斯绿（Janus green B）是 对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于 碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在 线粒体膜上。由于线粒体内具有细胞色素氧化 酶系，能使詹纳斯绿保持在氧化状态（淡蓝绿 色）。中性红为弱碱性染料，对液泡系(即高尔 基体)的染色有专一性，将活细胞中的液泡系染 红色。
（2）离心：低温离心机（4℃）中进行。 每次
离心前一定要在天平（托盘天平）上将两离心 管配平。第一次以600g(3005rpm)离心10min。 将其上清夜移入Eppendorf管中，盖好盖子置于 冰浴中，留待后面使用（分离线粒体）。沉淀 使用1ml预冷的0.25mol/L蔗糖溶液离心洗涤2次， 每次1000g(3880rpm)离心10min。
2.线粒体的分离
(1)分离:将分离细胞核时收集的上清液以 10000g(12270rpm)离心10min。沉淀用预冷0.25mol/L蔗 糖溶液悬浮,10000g离心10min,反复2次。
(2)鉴定:在干净的载玻片中央滴加1～2滴中性红-詹纳斯
绿染液,用牙签挑取沉淀物均匀涂片。盖上盖片,染色 5min,镜检。 线粒体蓝绿色，呈小棒状或圆形。
(3)分析：分级分离得到的组分，可用细胞化学和 生化方法进行形态和功能鉴定。
Unna染色法（甲基绿-派洛宁染色）
细胞核分析：甲基绿-派洛宁对DNA和RNA有选择性 的染色效果。核酸是酸性的，它们对于碱性染料甲 基绿和派洛宁的亲和力不同，而使这两种染料对两 类核酸具有了选择性。DNA被甲基绿染成绿色，RNA 被派洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分 布显示出来。
细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异，因此不 同细胞器在介质中的沉降系数各不相同。根据这一原 理，常用不同转速的离心法来分离不同的细胞器。分 级分离的方法有差速离心和密度梯度离心两种。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆， 在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离， 其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三 步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组 成、理化特性及其功能的主要手段。
细胞经甲基绿-派洛宁混合液处理后，其中的 DNA和RNA出现不同的呈色反应，一般认为这是 由于带有负电荷的核酸对碱性染料派洛宁和甲 基绿具有亲和力，且这两种染料的作用有选择 性，甲基绿染高聚分子的DNA呈蓝绿色，派洛宁 染低聚分子的RNA呈红色。
下次实验内容：
（4）鉴定：将分离纯化的细胞核制成涂片，空气干 燥。将干燥的涂片浸入95％乙醇溶液固定5min，晾 干，滴加甲基绿-派洛宁染液染色20～30min，丙酮 分色30s，蒸馏水漂洗，滤纸吸干水，镜检。
四、实验方法与步骤
1.细胞核的分离 （1）组织匀浆:将饥饿24h的大白鼠处死,立即剪开腹部, 迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水,洗去血污,用滤 纸吸干。称取0.5g肝组织,在小烧杯中剪碎,用预冷的 0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。将烧杯中的悬浮肝组织 倒入匀浆管中进行匀浆,匀浆过程要在冰浴中进行。匀 浆完毕,移入1.5ml离心管中。
核DNA呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质RNA呈红色。
六、实验报告
1. 线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进 行？
2. 要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离 和活性鉴定的过程中需注意哪些问题？根据你的实 际体会，写出操作注意事项及改进方法。
3. 分离介质 0.34mol/L及 0.88mol/L缓冲蔗糖溶 液哪一种在下层? 有什么作用?
（3）纯化：将沉淀用5倍体积0.34mol/L蔗糖溶 液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液混悬，用长针头注射 器再混悬液下轻轻加入4倍体积0.88mol/L蔗糖溶 液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液。尽量使两种溶液明 显分层。以1500g(4752rpm)离心15～20min。弃 上清液，沉淀即为经过纯化的细胞核，用PBS溶 液悬浮，4˚C保存。
(1)细胞匀浆(Homogenization)：低温条件下， 将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即 0.25mol／L蔗糖)进行破Байду номын сангаас细胞使之成为各种细 胞器及其包含物的匀浆。
(2)分级分离(Fractionation)：由低速到高速离心 逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高 的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使 各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由 于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时 均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第 一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮 和离心加以纯化.
洋葱内表皮细胞的线粒体分布
植物根尖液泡的中性红染色
三、材料和试剂
材料：小鼠的肝脏
器材：高速冷冻离心机、天平、显微镜、Eppendorf 管、冰块、冰盒、载玻片、盖玻片、玻璃匀浆器
试剂：生理盐水、0.25mol/L蔗糖溶液、 0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、 0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、 95%乙醇溶液、丙酮、PBS液、 甲基绿-派洛宁染液、中性红-詹纳斯绿染液。