细胞培养及材料细胞毒性检测

2.基本概念
器官培养 (Organ culture)：将活体中整个 器官或一部分器官取出， 置于体外生存、生长并同 时保持其一定的结构和功 能特征。
组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小 片组织（O.5～1立方毫米） 置于底物上孵育，细胞自 其周围移出并生长。
细胞培养(cell culture)： 把提取的组织用机械或消 化的方法分散成单个细胞 悬液，后进行培养，增殖。
粘着、粘附 （attachment）
铺展 （spreading)
➢ 原代细胞：从机体取出后立即培养 的细胞
➢ 原代培养：将从体内取出的细胞进 行培养
➢ 传代培养：从原代培养细胞继续转 接培养
➢ 传代细胞：在体外培养条件下持续 传代培养的细胞
细胞培养的工作原则
➢ 无菌
➢ 无毒、生物相容性
➢ 清洁的环境
➢ 品质良好的细胞来源，培养基配制使用高纯度药品和 去离子水
➢ 有标准化的工作方法
细胞培养
cell culture
主要内容
➢ 前言 ➢ 细胞培养的基本概念 ➢ 细胞培养的基本条件 ➢ 细胞培养的基本方法 ➢ 细胞培养的污染和检测 ➢ 细胞冻存和复苏 ➢ 细胞管理及保藏 ➢ 细胞毒性检测
1.前言
1885年Roux最早尝试使组织离体培养， 材料是鸡胚神经板，采用生理盐水为培养
液，并首次采用组织培养这个术语。
天然培养基：
培养基
血清
血浆
组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）
合成培养基：
根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模 拟合成的。
包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合 物
目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、M199、MEM、
人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和 繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。
肿瘤源自文库
胚胎
成体
粗切
消化
细切
修切
细胞培养 组织培养 器官培养
细胞培养的优点
➢ 活细胞 ➢ 便于观察检测 ➢ 条件可控 ➢ 均一性 ➢ 便于人工筛选
培养细胞与体内细胞的差异
➢ 失去原有组织结构和形态，趋向单一性 ➢ 分化减弱 ➢ 可能获得不死性
体外培养细胞的生长类型
➢ 贴壁型：动物的正常细胞 ➢ 悬浮型：血液淋巴细胞、肿瘤细胞、植物细胞 ➢ 固定化培养
常用的缓冲液： 生理盐水 PBS Hanks液
（D-Hank’s常用于配制胰酶溶液）
抗生素溶液
通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。 配制
具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万U/瓶，用注 射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万U/瓶，加5ml灭
菌双蒸水，即每毫升各为20万U。
使用时溶入培养液中，使青、链霉素的浓度最终为100U/ml。 庆大霉素：使用终浓度为100U/ml，广谱、稳定。
成纤维细胞样细胞
来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，内皮细胞
形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出2—3个长短不等的突起 中有卵圆形核
生长特点： 排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触易断开而单独行动
培养细胞的生长和增殖过程
血清的使用
➢ 常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、 马血清等
➢ 优质血清的标准 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、 病毒污染。
➢ 血清的灭活（消除补体活性） 56℃ ，30 分钟。
➢ 血清的消毒：过滤除菌
其他细胞培养用液
水：新鲜的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液
主要由无机盐和葡萄糖配制而成 作用：维持渗透压、缓冲和调节酸碱度
胰蛋白酶溶液
➢ 主要作用：
水解与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋 白及糖蛋白，使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。
➢ 常用浓度：0.25%
用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hank’s配制，用滤 器过滤除菌。
➢ 消化时间： 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。
物品 湿热 干热 过滤 紫外
Wilhelm Roux (1850-1924 )
1907年Harrison 和1912年Carrel开始把 组织培养作为一种方法，用于研究离体动物
细胞的培养。 他建立的鸡胚胎成纤维细胞持续了34年
之久(1912-1946)
Alexis Carrel France
Rockefeller Institute for Medical Research New York, NY, USA b. 1873 d. 1944
培养室 工作台
＋
玻璃 制品
＋
＋
金属 器械
＋
＋
塑料 制品
橡胶 制品
＋
培养 用液
＋
＋
布类 棉类
＋
＋
化学 气体
消毒剂
电离 辐射
＋＋
＋
＋＋
＋＋＋
＋＋＋
4.细胞培养的基本方法
贴附生长型细胞 必须贴附于底
物才能生长的细 胞。从形态上大 体分为上皮细胞 型及成纤维细胞 型，还有一些难 以确定其稳定形 态的细胞。
➢ 培养用的液体极多，应由专人负责，配制浓度准确， 所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否 和制备日期等
➢ 一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章， 其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分 开，已消毒品与未消毒品应分别存放
3.细胞培养的基本条件
无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流 罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压
灭菌器，抗生素 细胞生长条件：培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清 细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，
移液器 细胞保存条件：液氮罐，超低温冰箱
常用仪器与设备
➢ 超净工作台 ➢ 高压蒸汽灭菌器 ➢ 过滤除菌装置 ➢ 倒置显微镜 ➢ 水纯化装置 ➢ 恒温培养箱 ➢ 电热干燥箱 ➢ 离心机、天平、水浴、摇床 ➢ 液氮罐 ➢ 冰箱：4℃、-20 ℃ 、-80 ℃
细胞培养器材
➢ 移液器 ➢ 移液管 ➢ 吸管 ➢ 培养瓶： 25cm2、75cm2、150cm2 ➢ 培养皿： 30、60、120毫米 ➢ 多孔培养板： 4、6、24、96孔 ➢ 离心管 ➢ 冻存管
× ×
完全培养基的组成
➢ 基础培养基 ➢ 血清 ➢ 青、链霉素
80％～95％ 5％～20％
各100U／ml